日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆和序列分析

目的 克隆并鉴定日本血吸虫酪氨酸羟化酶(TH)基因，探讨其他信号蛋白在信号传导中对TH的调节及其之间的分子作用机制，从而为血吸虫新型疫苗的设计和药物开发开辟新的途径。方法 以曼氏血吸虫的TH cDNA为模板设计引物，以日本血吸虫成虫mRNA为模板逆转录合成cDNA链，将扩增出的日本血吸虫TH蛋白编码基因序列，克隆入pGEM-T easy载体，用单酶双切法和DNA测序进行鉴定，并与曼氏血吸虫的TH基因序列进行同源性比较。结果 自日本血吸虫RNA经逆转录得到一长度为480bp的DNA片段，经测序与曼氏血吸虫TH的同源性为87％。结论 成功扩增出日本血吸虫TH的中间编码区域，为进一步扩增日本血吸虫TH基因全长以及后续实验奠定了基础。     

Mago nashi:一个日本血吸虫性别决定基因的发现与鉴定

目的　运用免疫学方法筛选日本血吸虫 (中国大陆株 )童虫cDNA文库 ,寻找血吸虫新基因 ,并克隆和鉴定一个日本血吸虫决定性别的Magonashi样蛋白基因。方法　用混合的血吸虫感染者血清免疫学筛选日本血吸虫童虫cDNA文库 ,随机挑取阳性重组克隆进行测序 ,以获得血吸虫基因 ,并通过BLAST程序进行比较及同源性分析 ,根据分析结果设计合成引物 ,用PCR法扩增出日本血吸虫Magonashi样蛋白基因 (SiM)编码序列 ,将其克隆入pGEM T载体和 pBKCMV载体 ,用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果　本研究共挑取 7个阳性克隆 ,通过测序获得了 5个有表达序列标签(ExpressedSequenceTag .EST)价值的序列 ,并进行了同源性分析 ;用PCR法扩增出大小为 4 4 1bpSjM开放阅读框 ,重组质粒pGEM SjM和 pBKCMV SjM经双酶切均可获得一条为PCR产物一致的DNA片段。 结论　本实验获得了 5个有EST价值的序列 ,并成功地克隆了其中SjM编码基因。     

Mago nashi：—个日本血吸虫性别决定基因的发现与鉴定

目的运用免疫学方法筛选日本血吸虫(中国大陆株)童虫cDNA文库，寻找血吸虫新基因，并克隆和鉴定一个日本血吸虫决定性别的Mago nashi样蛋白基因。方法用混合的血吸虫感染者血清免疫学筛选日本血吸虫童虫eDNA文库，随机挑取阳性重组克隆进行测序，以获得血吸虫基因，并通过BLAST程序进行比较及同源性分析，根据分析结果设计合成引物，用PCR法扩增出日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因(SiM)编码序列，将其克隆入pGEM—T载体和pBKCMV载体，用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果本研究共挑取7个阳性克隆，通过测序获得了5个有表达序列标签(Expressed Sequenee Tag.EST)价值的序列，并进行了同源性分析；用PCR法扩增出大小为441bp SjM开放阅读框，重组质粒pGEM—SiM和pBKCMV-SjM经双酶切均可获得一条为PCR产物一致的DNA片段。结论本实验获得了5个有EST价值的序列，并成功地克隆了其中SjM编码基因。     

日本血吸虫14—3—3抗原编码基因的克隆及序列测定

为了寻找日本吸虫病新的诊断和候选疫苗分子,设计合成引物,以日本血吸虫成虫cDNA第一链为模板,用PCR法扩增出日本血吸虫14－3－3抗原（Sj14-3-3）基因编码序列,其大小约784bp,将其克隆入pGEM-T载体,重组质粒pGEM-T-Sj14-3-3经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段,序列测定结果表明具有一个长度为765bp的完整开放阅读框,与曼氏血吸虫14－3－3核苷酸序列有高度同源性。本实验克隆了日本血吸虫14－3－3抗原的编码基因,并进行了序列测定,为进一步研究提供了条件。     

日本血吸虫肌动蛋白轻链基因的获得和分析

目的运用表达序列标签(expressedsequencetag,EST)技术,从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选和鉴定日本血吸虫新基因,为寻找日本血吸虫新的候选疫苗奠定基础。方法转化日本血吸虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,获得EST;用NCBI站点的GenBank对所获得的新基因序列进行同源性检索;利用BLAST程序对同源性高的基因进行核苷酸和氨基酸水平的同源性比较;并利用pcgene软件对其蛋白质结构进行初步分析。结果发现xzw00081克隆的cDNA序列为日本血吸虫新基因并获得GenBank登录号(AY225851)。该cDNA序列与曼氏血吸虫肌动蛋白轻链基因高度同源,核苷酸水平的同源性为84%;氨基酸水平的同源性为86%;编码蛋白的理论相对分子质量为1053888,等电点为696;抗原表位可能位于氨基酸序列158～184处。结论用EST寻找日本血吸虫新基因是一种可行的方法,所筛选到的日本血吸虫新基因长374bp,编码88个氨基酸,与曼氏血吸虫肌动蛋白轻链基因高度同源,为进一步研究该基因的全序列及功能作准备。     

日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶基因克隆和序列分析

目的克隆日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）基因,并进行序列分析。方法制备日本血吸虫成虫mRNA,反转录合成cDNA,采用聚合酶链反应（PCR）技术,从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出SjTGR基因片段。通过TA克隆技术将该基因片段克隆到pGEM-T载体中进行DNA序列测定和生物信息学分析。结果采用PCR技术成功地从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出TGR基因片段,TA克隆后DNA序列分析显示该基因长度为1791bp,编码596个氨基酸残基,理论分子质量65kDa,生物信息学分析显示与曼氏血吸虫TGR氨基酸序列同源性为82%,含有吡啶核苷酸二硫化物氧化活性中心CVNVGC序列,在氨基端含有谷氧还蛋白特征性的活性位点CPFC基序。结论SjTGR基因克隆获得成功,为发展抗日本血吸虫新药及疫苗候选分子奠定了基础。     

日本血吸虫(大陆株)卵壳蛋白编码基因的克隆和序列测定

目的：克隆和鉴定日本血吸虫虫卵卵壳蛋白（SjEP）编码基因，以寻找血吸虫新的候选疫苗和诊断分子。方法：设计合成引物，分别以日本血吸虫雌、雄成虫cDNA第一链为模板，用PCR法从中扩增出SjEP基因编码序列，将其克隆入pGEM-T载体，用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果：PCR法从雌虫cDNA中扩增出大小为624bp SjEP基因编码序列，重组质粒pGEM-SjEP经双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增，均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段，序列测定结果表明具有一个长度为624bp的完整开放阅读框，与日本血吸虫（菲律宾株）虫卵卵壳蛋白核苷酸序列有高度同源性（99．9％）。结论：本实验成功地克隆了SjEP编码基因，并进行了序列测定，为进一步研究提供了条件。     

日本血吸虫磷酸甘油酸激酶基因T/A克隆及序列分析

目的获取日本血吸虫磷酸甘油酸激酶(SjPGK)编码基因片段,分析其核苷酸序列,为日本血吸虫病疫苗研制提供候选抗原分子。方法根据曼氏血吸虫磷酸甘油酸激酶(SmPGK)cDNA序列设计1对引物,采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法,从日本血吸虫成虫总RNA中扩增SjPGK基因片段。利用T/A克隆法,将其克隆入pMD18T载体,经双酶切分析和PCR鉴定,将阳性克隆进行脱氧核糖核酸序列测定;运用Blast程序,将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果RTPCR特异性扩增出1条长约830bp大小的条带;经酶切和PCR鉴定表明所构建的质粒pMD18TSjPGK中含有所扩增的基因序列;脱氧核糖核酸序列测定和分析,SjPGK基因片段长为830bp,与SmPGK的核苷酸同源性为85%,分值为672;氨基酸同源性为94%,分值为473。结论成功克隆SjPGK编码基因片段,为进一步实验提供了条件。     

日本血吸虫硫氧还蛋白编码基因的克隆和表达

目的克隆和表达日本血吸虫大陆株硫氧还蛋白(SjcTrx)的编码基因。方法根据日本血吸虫菲律宾株硫氧还蛋白基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入SalI酶切位点和终止密码子TAA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SjcTrx基因。经双酶切并纯化的PCR产物与同样双酶切并纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接,构建重组质粒pET28a-SjcTrx,转化BL21感受态菌并大量扩增。重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定。pET28a-SjcTrx/BL21用IPTG诱导表达。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334 bp,构建的重组pET28a-SjcTrx表达质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段。根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,约14kDa。Western blotting显示该重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清和重组抗原免疫小鼠血清所识别。结论SjcTrx基因的表达获得成功,并获得纯化蛋白,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。     

日本血吸虫中国大陆株23kDa膜蛋白的基因克隆与序列分析

本研究根据曼氏血吸虫疫苗候选分子Sm23的基因序列，设计了一对引物，并通过聚合酶链反应（PCR）基因克隆技术，从日本血吸虫中国大陆株cDNA文库中克隆出了中国大陆株23kDa膜蛋白基因。DNA序列分析表明，编码日本血吸虫中国大陆株Sj23膜蛋白的基因含有657bp，与曼氏血吸虫Sm23的核着酸有79．5％的同源性，而与日本血吸虫菲律宾株的Sj23的同源性为100％。该研究为发展Sj23多肽疫苗奠定了基础。     

日本血吸虫副肌球蛋白全基因克隆、测序及体内表达

目的： 将日本血吸虫大陆株副肌球蛋白（ Ｓｊｃ９７） 编码区全基因克隆及测序, 并研究 Ｓｊｃ９７ 全基因核酸疫苗在小鼠体内的表达。方法： 抽提日本血吸虫成虫总 Ｒ Ｎ Ａ, 逆转录 聚合酶链反应 （ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ） 扩增编码 Ｓｊｃ９７的全基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ, 双脱氧链末端终止法测 Ｄ Ｎ Ａ 序列。构建含 Ｓｊｃ９７ 全基因的质粒表达载体 （ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７） , 并用免疫荧光染色法研究ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７ 在小鼠体内的表达特性。结果与结论： 用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 扩增获得了 Ｓｊｃ９７ 的编码区全基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ, 并测定了该基因编码区的全序列。与日本血吸虫菲律宾株、日本株及曼氏血吸虫副肌球蛋白编码区全基因比较, 核苷酸序列同源性分别为： ９９４ ％ 、９９２ ％ 和９１０ ％ ; 推导的氨基酸序列同源性分别为：９９７ ％ 、９９８ ％ 和９６０ ％ 。ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７ 核酸疫苗能在注射的小鼠局部肌肉组织表达 Ｓｊｃ９７ 。     

日本血吸虫原肌球蛋白编码基因克隆和表达

目的　克隆和表达日本血吸虫大陆株原肌球蛋白 (tropomyosin ,TM)编码基因。方法　应用RT PCR方法体外扩增日本血吸虫原肌球蛋白编码基因 ,并采用T载体对该PCR产物直接进行克隆并用于核苷酸序列的测定。将目的基因亚克隆入原核表达载体pQE30 ,以IPTG诱导重组原肌球蛋白的表达。结果　PCR扩增产物约 82 3bp ,符合预计大小 ,并成功地克隆入T载体 ,对其中一克隆pGSjcTM12的插入片段的核苷酸序列分析表明 ,该序列和推测的氨基酸序列与曼氏血吸虫原肌球蛋白基因分别有 91 1%和 98 1%的同源性。该编码基因亚克隆入原核表达载体pQE30获得高效表达 ,分子量约 32kDa,并能被日本血吸虫天然原肌球蛋白免疫血清特异识别。结论　日本血吸虫原肌球蛋白编码基因克隆和原核表达成功。     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆、真核表达及鉴定

目的扩增日本血吸虫的酪氨酸羟化酶（Schistosoma japonicum Tyrosine Hydroxylase,SjTH）编码基因,构建pcDNA3.1(+) SjTH真核表达载体,并检测其在COS 7细胞中的表达情况。方法以日本血吸虫成虫cDNA为模板,RACE PCR扩增SjTH编码基因,并与pGEM T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,PCR和双酶切初步鉴定后测序,纯化无内毒素重组质粒pcDNA3.1(+) SjTH,转染入COS 7细胞,G418筛选阳性克隆,RT PCR和Western blot鉴定重组SjTH蛋白的表达。结果RACE PCR 扩增出SjTH编码基因,大小约1 392bp,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组真核质粒构建成功。脂质体介导无内毒重组真核质粒pcDNA3.1(+) SjTH转染入COS 7细胞,G418筛选出阳性克隆,RT PCR证实阳性单克隆细胞带有SjTH编码基因,Western blot鉴定单克隆细胞表达重组SjTH蛋白,大小约54kD。结论真核表达载体pcDNA3.1(+) SjTH构建成功,G418筛选出阳性克隆,真核表达重组SjTH蛋白,为后续研究SjTH蛋白功能奠定基础。     

中国人磷脂转运蛋白基因克隆及序列分析

为探讨中国人磷脂转运蛋白的基因结构、组成及特点 ,克隆了中国人磷脂转运蛋白基因。首先提取人胎肝组织总RNA ,以此为模板利用逆转录—聚合酶链反应法成功钓取了磷脂转运蛋白成熟肽基因片段 ,DNA序列分析所得基因片段由 14 2 8个碱基组成     

日本血吸虫线粒体相关蛋白的特性及抗原表位的分析

目的　分析rSj338重组蛋白的氨基酸序列 ,了解该蛋白的特性 ,预测其抗原表位。方法　制备Sj338基因片段并重组入测序载体pGEM T ,对其核苷酸序列进行测定 ,分别以DNASIS和GOLDKEY软件对序列资料进行分析 ,并在BLAST网上进行同源性分析。结果　rSj338基因长 487bp ,含 1个由 45 9bp组成的开放阅读框 ,编码一由 15 3个氨基酸残基组成的多肽 ,分子量为 17 6kDa,氨基酸同源性分析发现 ,重组蛋白与人的线粒体传入受体亚单位氨基酸同源性为 46 % ,与褐鼠线粒体膜受体的前体氨基酸同源性为 44 % ,预测该蛋白的抗原表位位置为2 6～ 32、37～ 46、131～ 136和 147～ 15 1氨基酸肽段。结论　rSj338重组蛋白可能为日本血吸虫线粒体相关蛋白     

日本血吸虫谷胱甘肽转移酶基因片段在真核表达载体中的亚克隆

目的将日本血吸虫谷胱甘肽转移酶(GST)基因片段克隆到真核表达载体 pBKCMV中,以便对其进行核酸疫苗的研究。方法特定寡核苷酸引物的设计和合成,TRIZOL 提取日本血吸虫成虫 RNA,RT-PCR 法扩增 GST 基因编码序列,将扩增产物连接 pGEM-T 克隆载体,再亚克隆到真核表达载体 pBK CMV 中。结果 RT-PCR 法特异性扩增出 SiGST 编码基因片段,其大小约为670bp,经双酶切、PCR 鉴定表明所构建的质粒 pGEM-T-GST 和 pBK CMV-GST中含有目的基因。结论 pBK CMN-GST 重组质粒的成功构建,为进一步表达 GST 及其在血吸虫病免疫诊断、免疫预防中的作用研究提供了条件。     

日本血吸虫丝氨酸蛋白酶基因片段在真核表达载体中的克隆

目的：为了寻找新的预防日本血吸虫病的侯选疫苗分子。方法：设计合成引物,以日本血吸虫成虫基因组DNA为模板,用PCR法扩增出丝氨酸蛋白酶（Sp）基因编码序列,其大小约450bp,将其克隆入pGEM－T载体,进行序列测定,并将Sp基因克隆入真核表达载体pBKCMV中。结果：PCR法扩增出SjSp基因编码序列,其大小约450bp,重组质粒pGEM－T－Sp和pBK-Sp经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段,序列测定结果表明具有一个长度为427bp的不完整开放阅读框,其与曼氏血吸虫丝氨酸蛋白酶（SmSp1）具有高度同源性。结论：本文首次报道了日本积压吸虫丝氨酸蛋白酶（SjSp）的部分基因编码序列,并克隆入了真核表达载体pBKCMV中,为进一步研究提供了条件。     

日本血吸虫(中国大陆株)20.2 kDa分子编码基因(Sj20.2)的克隆及序列分析

目的：克隆日本血吸虫中国大陆株20.2kDa分子的编码基因，方法：根据筛选到的日本血吸虫肝期童虫cDNA文库阳性克隆之一的插入片段序列，设计合成1对引物，通过PCR技术对其最大开放阅读框进行扩增，然后克隆人pGEM-T载体，并对克隆产物进行核苷酸序列测定和分析，利用在线软件推测其编码氨基酸的序列，结果：利用PCR方法从上述插入片段中扩增出1条单一的DNA条带，大小介于515bp与697bp之间，将此产物克隆入pGEM-T载体，双酶切和PCR反应结果都出现与前述结果一致的目的片段，核苷酸序列测定结果表明此开放阅读框全长564bp，在线软件分析结果表明，此片段编码187个氨基酸，编码肽段分子量大小约为20．0dDa，结论：本次实验成功扩增和克隆出目的基因片段，为下一步研究奠定了基础。