沉默DNMT3A表达减弱宫颈癌细胞增殖能力的研究

目的探讨沉默DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)表达对宫颈癌细胞增殖能力的影响。方法将培养的宫颈癌Si Ha细胞分为对照组(未转染)、siRNA control组(转染control-siRNA质粒)和siRNA DNMT3A组(转染DNMT3A-siRNA质粒)三组,采用CCK-8法和平板克隆形成实验检测细胞的增殖能力,Transwell法检测细胞的侵袭能力,流式细胞仪检测细胞的周期进展。结果 siRNA DNMT3A组细胞中DNMT3A mRNA表达水平显著低于对照组(P0.05),而siRNA control组细胞中DNMT3A mRNA表达水平较对照组差异不显著(P0.05)。与对照组相比,siRNA DNMT3A组细胞在48 h和72 h的OD值、克隆细胞形成数、细胞侵袭数、S期和G2/M期细胞所占比例均明显降低,G0/G1期细胞比例显著升高,差异均有统计学意义(P0.05);而siRNA control组与对照组间的OD值、克隆细胞形成数、细胞侵袭数和各细胞周期比例差异均不显著(P0.05)。结论沉默DNMT3A表达可能通过将细胞阻滞在G0/G1期减弱宫颈癌细胞的增殖能力。     

miR-378对卵巢癌细胞增殖能力的影响

目的探究微小RNA378(miR-378)与c-Myc表达的关系及其与卵巢癌细胞增殖能力的影响。方法培养对数生长期人卵巢癌细胞系SKOV3,慢病毒转染法外源性上调SKOV3细胞中miR-378的表达作为实验组,同时转染空白载体作为对照组,Taqman实时荧光定量PCR(RT-q PCR)技术检测两组细胞miR-378及c-Myc mRNA表达水平,免疫印迹实验(Western Bolt)检测两组细胞c-Myc蛋白表达水平,CCK-8实验检测两组细胞增殖能力的情况,克隆形成实验检测两组细胞克隆形成能力的情况。结果实验组miR-378的表达水平显著高于对照组细胞(P0.001);实验组c-Myc mRNA表达水平显著低于对照组细胞(P0.05);实验组c-Myc蛋白表达水平同样显著低于对照组细胞(P0.05);实验组细胞增殖能力在48及72h时显著低于对照组细胞(P0.05);实验组细胞克隆形成能力显著低于对照组细胞(P0.01)。结论 miR-378可能通过抑制原癌基因c-Myc的表达,介导卵巢癌细胞增殖能力的下调。     

Irisin通过PI3K/AKT/Cyclin D1途径促进宫颈癌HeLa细胞增殖的机制研究

目的 探讨鸢尾素(Irisin)对宫颈癌Hela细胞生物学行为的影响及促增殖分子机制。方法 体外培养人宫颈癌Hela细胞,加入不同浓度Irisin处理,CCK-8(cell counting kit-8)法、平板克隆实验检测Irisin对细胞增殖和集落形成能力的影响,划痕、Transwell侵袭实验检测Irisin对细胞迁移、侵袭能力的影响。设置对照组、Irisin组、Irisin+AKT抑制剂组,流式细胞周期实验检测Irisin对细胞周期分布的影响,Western Blot法检测Cyclin D1及AKT、p-AKT表达量的改变。结果 CCK-8、平板克隆结果示,Irisin显著促进宫颈癌Hela细胞的增殖和集落形成(P<0.05)。划痕、Transwell结果示,Irisin显著提高划痕愈合率及穿膜细胞数(P均<0.05)。流式细胞周期实验、WB结果示,与对照组相比,Irisin组G1期细胞比例减少,S期比例增多,Cyclin D1和p-AKT/AKT的表达上调(P均<0.05)。与Irisin组相比,Irisin+AKT抑制剂组G1期细胞比例增加,S期比例减少,...     

RNA干扰对卵巢癌细胞mTOR表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨RNA干扰技术对人卵巢癌细胞SKOV3中mTOR的表达及对细胞增殖与凋亡的影响。方法:培养SKOV3细胞系,设计合成mTOR siRNA实验分4组:正常培养组:未转染的正常培养SKOV3细胞;空白对照组:转染空脂质体的SKOV3细胞;转染组:转染mTOR siRNA的SKOV3细胞;无义对照组:转染无义siRNA的SKOV3细胞。采用Western blot法检测各组细胞中的mTOR蛋白表达水平;应用MTT法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:mTOR siRNA转染组SK-OV3细胞mTOR蛋白的表达显著低于各对照组(P<0.05);mTOR siRNA转染组SKOV3细胞增殖低于各对照组(P<0.05);mTOR siRNA转染组细胞凋亡率高于各对照组(P<0.05)。结论:mTOR siRNA对SKOV3细胞中mTOR蛋白的表达有明显的抑制作用,特异性阻断mTOR基因表达可显著抑制SKOV3细胞的增殖并促进其凋亡。     

RI基因稳定转染的SKOV3细胞系的建立及其对细胞增殖的作用

目的:建立稳定表达RI基因的卵巢癌SKOV3细胞系,并观察外源基因对细胞体外增殖的作用。方法:以脂质体为介导,将携有RI基因的重组载体pLNCX-ri转染SKOV3细胞,实验分3组,RI基因转染组(SKOV3/RI组)、空质粒转染组(SKOV3/Neo组)和空白对照组(SKOV3组)。采用G-418筛选获得稳定转染的细胞系后,通过RT-PCR技术和免疫细胞化学染色方法鉴定各组细胞中RI基因的表达;通过MTT、细胞周期分析、细胞凋亡检测方法观察该基因对细胞生长的影响。结果:外源性RI基因已整合于细胞基因组中,并获得稳定表达。转染RI基因后的细胞生长速度减慢,明显低于对照组,差异有统计学意义。细胞周期分析显示,实验组G1期细胞增至69.23%,S期细胞降至24.34%,与另外两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。细胞凋亡检测表明SKOV3/RI组细胞凋亡率为58.25%,与SKOV3组(17.97%)及SKOV3/Neo组(21.42%)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:通过脂质体介导,可以建立RI基因稳定表达的卵巢癌细胞系,且RI基因对SKOV3细胞的体外增殖有抑制作用。     

NDRG2基因过表达影响卵巢癌细胞生物学功能的研究

目的构建N-myc下游调节基因2 (NDRG2)过表达质粒,研究NDRG2基因影响卵巢癌细胞增殖、凋亡及侵袭等生物学行为的作用。方法 NDRG2过表达质粒载体感染卵巢癌细胞,从而实现NDRG2基因的在卵巢癌细胞中的过表达。之后通过CCK8试验观察卵巢癌细胞的生存能力及平板克隆形成试验观察卵巢癌细胞的增殖能力。流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。结果质粒转染后,Q-PCR检测NDRG2基因特异过表达。Q-PCR试验观察NDRG2过表达质粒瞬时转染后NDRG2基因表达情况,与空载体组相比,NDRG2过表达转染组卵巢癌细胞NDRG2基因表达水平明显升高(OVCAR-3、SKOV3、CAOV3卵巢癌细胞t值分别为48.000、28.667、29.784,均P0.05)。CCK8检测、平板克隆试验结果显示过表达NDRG2基因显著抑制OVCAR-3、SKOV3及CAOV3细胞生长(t=22.928、13.797、10.332;χ~2=5.530、4.060、4.230,P0.05),并促使上述3种卵巢癌细胞周期停滞于G1期。结论通过真核表达载体使细胞NDRG2基因的过表达,可以明显抑制OVCAR-3、SKOV3及CAOV3细胞的生长和增殖。     

人乳腺癌MCF-7细胞的TRF2 siRNA表达载体的构建和鉴定

目的:构建表达端粒重复序列结合因子2(TRF2)基因小干扰RNA(siRNA-TRF2)的腺病毒表达载体(rAd-shRNA-TRF2),并检测该载体对人乳腺癌(MCF-7)细胞TRF2基因表达的沉默效应。方法:采用同源重组法构建重组腺病毒rAd-shRNA-TRF2表达载体,鉴定正确后转染MCF-7细胞,用FQ-RT-PCR和Western blot检测转染后48 h TRF2基因的表达,MTT法和克隆形成实验检测细胞生长状况。结果:重组腺病毒rAd-shRNA-TRF2包装成功,转染MCF-7细胞后,TRF2基因的表达明显被抑制,细胞生长显著抑制,细胞克隆形成能力显著下降。结论:腺病毒介导的TRF2 RNAi表达载体rAd-shRNA-TRF2构建成功,可有效抑制人乳腺癌MCF-7细胞TRF2基因的表达,抑制细胞生长。     

稳定高表达人野生型DNA polβ食管癌细胞Ec9706的生物学特征

目的：建立稳定高表达人野生型DNA聚合酶beta（polβ）的食管癌细胞系Ec9706，并对该细胞系的生物学特征进行分析。方法：脂质体转染法将人野生型polβ重组绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—AC3转染入Ec9706细胞，荧光显微镜观察转染效果，经G418筛选得到稳定转染细胞系。RT—PCR方法检测转染细胞polβmRNA的表达水平，绘制生长曲线，软琼脂实验测细胞克隆形成率，MTT法测转染前后细胞对顺铂的敏感性。结果：荧光显微镜下转染细胞荧光强，转染效率高，RT—PCR结果表明转染细胞的polβ表达较空载体转染细胞、对照细胞增加。转染前后细胞生长速度接近，转染细胞周期分布发生改变，多被阻滞在S期，在软琼脂实验中克隆形成率增加，对顺铂的敏感性降低。结论：成功建立了稳定高表达人野生型polβ的Ec9706细胞系，polβ的高表达与细胞的细胞周期分布、恶性增殖能力及耐药性有一定关系。     

靶向MICA基因对胃癌SGC-7901细胞增殖的抑制作用

目的探讨通过小干扰RNA(siRNA)抑制MICA基因表达对胃癌SGC-7901细胞生长的抑制作用。方法将靶向MICA的siRNA(MICA siRNA)通过脂质体转染法瞬时转染胃癌SGC-7901细胞48 h;Western blot检测siRNA转染前后SCG-7901细胞内MICA蛋白表达的变化;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测MICA siRNA转染对细胞增殖的影响,TUNEL检测siRNA转染对细胞凋亡的影响。结果 MICA siRNA转染干扰SCG-7901细胞内MICA表达,并诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖。细胞转染后,MICA蛋白表达降低70%~85%,明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);转染组细胞存活率明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);转染组细胞凋亡率明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论靶向MICA抑制胃癌SGC-7901细胞增殖并促进细胞凋亡,MICA可用于胃癌基因治疗的靶点。     

联合转染p53与血管生成抑素基因对人胃癌细胞系SG7901生长的影响

目的探讨联合转染p53和血管生成抑素(AS)基因对人胃癌细胞系SG7901生长的影响。方法用脂质体转染法分别将p53、AS基因、p53和AS基因转染人胃癌细胞系SG7901。以RT-PCR法检测转染后细胞目的基因的表达,通过细胞集落形成实验、MTT生长曲线、细胞周期检测观察其生物学特性变化。结果p53或AS基因均能抑制转染细胞的生长,而联合转染两种基因的细胞生长抑制更明显。结论p53和AS基因具有协同抑制恶性肿瘤细胞生长作用,提示联合多种基因可能有利于恶性肿瘤的基因治疗。     

微小RNA-21在乳腺癌细胞中的作用

目的：探讨微小RNA（miR）-21在乳腺癌细胞（MCF7）中的作用。方法：对MCF7细胞转染miR-21,采用免疫组织化学法检测转染后程序性细胞凋亡4（PDCD4）表达;用噻唑蓝（MTT）比色法测转染miR-21后MCF7细胞增殖;流式细胞术检测转染后MCF7细胞凋亡。结果：经免疫组织化学检测,转染组未见染色,对照组细胞胞质呈棕褐色,转染组PDCD4的表达明显低于对照组,MTT法检测转染组细胞活力增加（P〈0.05）。转染组的凋亡率为（3.14±0.24）%,明显低于空白组、空质粒组的（8.04±0.02）%、（9.41±0.53）%,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论：PDCD4是miR-21的靶基因之一,miR-21的高表达可促进乳腺癌的发展。     

血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶-9在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的研究非小细胞肺癌（NSCLC）组织中血管内皮生长因子（VEGF）及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达情况,探讨VEGF及MMP-9在NSCLC侵袭和转移中的作用。方法应用免疫组织化学SABC法检测23例肺良性病变组织、30例NSCLC癌旁正常肺组织及111例NSCLC组织中VEGF及MMP-9的表达水平。结果NSCLC组织中VEGF及MMP-9的阳性表达率均高于肺良性病变组织和NSCLC癌旁正常肺组织（P〈0.05）。VEGF和MMP-9的表达随组织分化程度的降低而升高（P〈0.05）;在腺癌中MMP-9的阳性表达率高于鳞癌（P〈0.05）。VEGF和MMP-9的阳性表达率随TNM分期增高而升高（P〈0.05）,VEGF的阳性表达率随肿瘤增大而升高（P〈0.05）。有淋巴结转移者VEGF和MMP-9的阳性表达率高于无淋巴结转移者（P〈0.05）;存活1 a以内、1-3 a的患者VEGF和MMP-9的阳性表达率均高于存活3-5 a者（P〈0.05）。结论VEGF和MMP-9可能在NSCLC的侵袭和转移中发挥重要作用,可作为评估NSCLC的侵袭、转移和预后的参考指标。     

硅纳米载体携带RNA干扰质粒逆转人结肠癌细胞多药耐药的实验研究

目的 探讨硅纳米颗粒作为基因转染载体携带干扰质粒MRP2siRNA逆转人结肠癌耐药细胞株HT29/L-OHP的多药耐药,为硅纳米作为靶向基因治疗和化疗药物的有效性打下基础. 方法 制备硅纳米载体,用硅纳米载体和脂质体分别将多药耐药基因MRP2的干扰重组质粒pGensil-MRP2siRNA,转染人结肠癌耐药细胞株HT29/L-OHP,观察两种载体转染人结肠癌耐药细胞株HT29/L-OHP后绿色荧光的表达,利用RT-PCR和Western-blot检测MRP2的表达,CCK-8实验测定转染干扰质粒后顺铂对人结肠癌耐药细胞株HT29/L-OHP细胞增殖抑制作用,并比较两种载体的逆转效率. 结果 在人结肠癌耐药细胞株HT29/L-OHP中,两种载体携带的siRNA都明显抑制了MRP2 mRNA及蛋白的表达,两种载体逆转效果差异无统计学意义（P＞0.05）.在相同浓度化疗药物的作用下,两种载体的RNA干扰组细胞凋亡比例显著高于对照组（P＜0.01）,表明细胞耐药性显著下降,两种载体细胞凋亡差异无统计学意义（P＞0.05）. 结论 硅纳米能有效的携带pGensil-MRP2siRNA质粒转染人结肠癌细胞人结肠癌耐药细胞株HT29/L-OHP,并且对结肠癌耐药细胞的MRP2的表达有明显抑制作用,取得良好的逆转耐药效果.     

靶向抑制存活素表达对卵巢癌细胞株生物学行为的影响和意义

目的：通过存活素（ Survivin）反义寡核苷酸（ ASODN）转染人卵巢癌SKOV3细胞株抑制存活素Survivin蛋白表达,分析靶向抑制 Survivin 表达对卵巢癌细胞生长、细胞周期改变、凋亡、侵袭迁移能力的影响和意义。方法用脂质体（LipofectamineTM2000）介导Survivin ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,通过四唑盐比色法（MTT法）分析细胞生长活性改变,通过流式细胞仪检测Survivin蛋白表达改变、细胞周期分布和细胞凋亡率,通过Transwell小室检测细胞侵袭迁移能力的改变。结果转染Survivin ASODN后卵巢癌细胞株中Survivin蛋白表达明显下降（t＝7．82,P＜0．01）。细胞生长明显减慢（F＝3．75,P＜0．01）,600nm/L ASODN转染48小时细胞存活率为49．50±20．76％,接近IC50值。细胞凋亡明显增加（t＝6．37,P＜0．05）,细胞增殖明显下降（t＝-10．35,P＜0．01）,更多的细胞停留在G0/G1期（t＝10．38,P＜0．01）。细胞迁移和侵袭能力下降（t值分别为19．26、27．42,均P＜0．01）。结论 Survivin ASODN通过靶向抑制卵巢癌细胞存活素表达,可抑制细胞生长,促进细胞凋亡,减少进入有丝分裂的细胞数,降低细胞的侵袭迁移能力,从而达到治疗卵巢癌的作用。靶向抑制存活素的治疗将成为卵巢癌治疗的重要手段。     

RNA干扰iNOS基因对颊鳞癌细胞凋亡影响的实验研究

目的研究RNA干扰iNOS基因的表达对肿瘤细胞凋亡的影响。方法采用RNA干扰技术,通过脂质体介导,将含有iNOS特异性发夹状小RNA（short hairpin RNA,shRNA）的pGenesil-1质粒转染入颊鳞癌Bca885细胞株。观察pGenesil-1质粒载体转染率、免疫组化检测细胞中iNOS的蛋白表达的改变情况、流式细胞仪检测Bca885细胞的凋亡率。采用SPSS12．0统计软件统计分析。结果在脂质体介导下,将含iNOS特异性shRNA的质粒转染入颊鳞癌细胞后。实验组Bca885细胞中iNOS蛋白表达低于两对照组,具有统计学意义（P〈0．01）;三组细胞的凋亡率分别为12．05±0．18、3．31±0．12和2．46±0．09．实验组高于两对照组,具有统计学上意义（P〈0．01）。结论RNA干扰可以降低iNOS基因的表达,达到基因沉默的效果;沉默iNOS基因可提高Bca885细胞的凋亡．从而降低Bca885细胞的细胞增殖活性。     

大豆异黄酮对辐射小鼠骨髓细胞的防护作用

目的研究大豆异黄酮(SI)对辐射小鼠骨髓细胞的防护作用,为SI应用于抗电离辐射药物和功能食品的研究提供依据。方法24只雄性昆明小鼠,随机分为正常对照组、辐射对照组和辐射补充0.5%SI组,喂养2周后,后两者给予4.0Gyγ射线照射。照射后7d处死小鼠,分离双侧股骨,观察骨髓细胞(BMC)形成细胞集落的能力。体外实验取正常组小鼠的股骨,制成BMC单细胞悬液,4.0Gyγ射线照射,测定BMC的细胞周期和3H-TdR掺入量。结果辐射使小鼠BMC的粒-巨细胞集落形成单位(CFU-GM)和成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)明显减少,辐射补充SI组BMC的CFU-GM〔(26.0±6.9)个/105BMC〕和CFU-F〔(23.4±8.6)个/106BMC〕明显高于辐射对照组〔相应为(17.3±4.4)个/105BMC和(15.6±4.9)个/106BMC)(P0.05)〕。体外实验结果表明,辐射使细胞周期的G0-G1期细胞数量明显增加,S和G2-M期细胞明显减少,细胞的3H-TdR掺入量明显减少;补充SI组与辐射对照组相比,G0-G1期细胞数量明显减少(P0.05),S和G2-M期的细胞数明显增加(P0.05),细胞的3H-TdR掺入量明显增加(P0.05)。结论大豆异黄酮对小鼠骨髓细胞辐射损伤有一定的防护作用。     

人白介素21基因联合γ射线照射对食管癌ECl09细胞厨期的影响

目的研究含有IL-21基因的重组腺病毒表达载体（Ad-IL-21）联合γ射线照射对食管癌细胞ECl09生长的抑制作用,为肿瘤的基因-放射治疗提供实验依据。方法将Ad-IL-21于体外转染食管癌细胞株ECl09,用M1Tr比色法和流式细胞术观察基因联合照射后ECl09细胞的生长曲线和细胞周期的变化。结果Ad-IL-2l基因组、单纯照射组和Ad-IL-2l基因联合照射组ECl09细胞生长均明显受到抑制,与Ad-lacZ组和空白对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。其中联合照射组ECl09细胞生长最为缓慢,与Ad-IL-2l基因组和单纯照射组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。Ad-IL-21基因组、单纯照射组和联合治疗组大量的ECl09细胞停留在G1期,而G2期和s期细胞明显减少,联合治疗组细胞停留在G1期最多。结论腺病毒介导的白介素21基因转移能显著抑制食管癌ECl09细胞的生长,使细胞产生G1期阻滞,与放射治疗联合应用具有相加和协同效应。     

AKT基因被RNA干扰抑制后对卵巢癌SKOV3细胞增殖及凋亡的影响

目的通过RNA干扰技术阻断卵巢癌SKOV3细胞中AKT基因的表达,研究其对卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响。方法人卵巢癌SKOV3细胞体外培养,分为对照组、空白载体组与RNA干扰组三组,采用MTT法与流式细胞仪AnnexinV／PI法检测并评价AKT基因干扰后对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响。结果MTF结果显示RNA干扰组细胞增殖能力较对照组与空白载体组明显降低,差异具有统计学意义（P〈0．05）,空白载体组与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）;流式细胞仪AnnexinV／PI法检测结果显示,RNA干扰组细胞凋亡率高达到（79．52±2．31）％,较对照组与空白载体组明显升高,约是空白载体组与对照组的3倍,差别具有统计学意义（P〈0．05）。结论靶向AKT基因的小干扰RNA（siRNA）可有效地抑制卵巢癌细胞的增殖,促进细胞凋亡,是卵巢癌的治疗新方法。     

电离辐射联合自噬诱导剂或抑制剂对人宫颈癌Hela细胞的作用

目的 探讨电离辐射联合自噬抑制剂或诱导剂对人宫颈癌细胞株增殖的影响。方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)和流式细胞术(FCM)检测经不同剂量(0、2、4、6、8和10 Gy)照射和6 Gy+自噬抑制剂三甲基腺嘌呤(3-MA)及6Gy+自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin)不同方法处理的人宫颈癌细胞存活和增殖情况,并分析其量效和时效关系。结果 随着照射剂量的增加(2、4、6、8和10 Gy)及时间的延长(24、48和72 h),宫颈癌细胞增殖的抑制作用组间比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。6 Gy+rapamycin处理对癌细胞增殖的抑制率低于单纯6Gy照射组(P<0.05),组间比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。6 Gy+3-MA处理对癌细胞增殖的抑制高于单纯6 Gy照射组(P<0.05),处理后24、48和72 h其抑制率组间比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论 在Hela细胞中电离辐射诱导自噬能够拮抗凋亡,电离辐射联合自噬诱导剂能够抑制Hela细胞凋亡,而电离辐射联合自噬抑制剂能够促进其凋亡。