常染色体显性遗传性听神经病家系全外显子组测序分析

目的：在多年围绕1个常染色体显性遗传性非综合征型听神经病家系开展系统分子遗传学研究的基础上,进一步探讨该家系耳聋的致病机制,以期发现新的听神经病致病基因和突变位点。方法：对3例耳聋患者和1例配偶进行全外显子组测序,初步筛选出与家系耳聋相关的候选致病基因。采用PCR-Sanger测序法,检测上述候选基因变异是否与家系表型共分离。最后,以50例与研究家系无关的听力正常人为对照,检测候选致病突变在正常群体中的突变频率和SNPs遗传多态性。结果：全外显子测序分析得到41个候选致病基因突变;用PCR-Sanger测序法对核心家系的9名成员和2名家系外听力正常人进行验证,仅发现1个基因突变（ALOX15B 7942797 C>T）与家系耳聋表型共分离。选取50例家系外正常对照的DNA样本对ALOX15B基因进行PCR扩增和序列分析,结果显示有2例听力正常人也检测到该基因的同一变异,提示该变异为SNPs遗传多态性。结论：对核心家系成员的全外显子组测序分析和Sanger测序法验证未发现有意义的突变位点,排除了该家系耳聋由基因编码区突变及Indels致病的可能性。     

全外显子组测序在耳聋基因检测中的应用进展

新一代测序技术(Next-generation sequencing NGS)在基因革命中发挥了核心作用。此类技术中,全外显子组测序(whole exome sequencing WES)已经成为遗传学家识别遗传性耳聋致病DNA变异的主要工具。研究显示,1%的人类基因表达产生听力功能。全外显子组测序可采用靶向富集方法将基因组中外显子全部捕获,在经高通量测序获取遗传信息,我们回顾了利用NGS治疗遗传性耳聋的最新进展,重点对全外显子组测序在遗传性耳聋基因的诊断中的应用进行综述。     

全外显子组测序和目标序列靶向捕获测序在遗传性视网膜变性基因诊断中的差异

目的:对比外显子组测序(whole exome sequencing,WES)和目标序列靶向捕获测序检测中国遗传性视网膜变性(inherited retinal dystrophies,IRDs)患者致病基因变异的差异。方法:收集182例IRDs家系,所有先证者均接受系统的眼科检查和必要的全身检查,采集患者及家属血样并提取基因组DNA。按照就诊的时间顺序将患者平均分为两组,一组91例接受WES,另一组91例应用本课题组设计并定制的“遗传性眼病基因诊断芯片” (hereditary eye disease enrichment panel,HEDEP)进行IRDs致病基因外显子区域靶向捕获测序。对候选致病基因用Sanger测序进行验证,并对家系成员进行共分离分析,使用多重连接依赖的探针扩增技术对拷贝数变异进行验证,针对二代测序捕获效率低的区域如RPGR ORF15区,应用Sanger 测序补充检测。根据美国医学遗传学与基因组学学会和分子病理学协会(American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology,ACMG/AMP)制定的《ACMG/AMP基因变异分类标准与指南》将检测到的所有基因变异进行分类,本文只包含“致病的”、“可能致病的”的基因变异,不包含“意义不明确的”、“可能良性的”和“良性的”基因变异。结果:应用HEDEP确诊的家系共51例,阳性率为56.04%(51/91);应用WES确诊的家系共30例,阳性率为33.00%(30/91);总阳性率44.51%(81/182)。平均测序深度以及测序覆盖度方面,HEDEP优于WES,此外HEDEP具有检测拷贝数变异潜力。本研究共检测到29个IRDs基因的致病突变,最常见的致病基因为USH2A、ABCA4和RPGR,基因突变频率分别为11.54%(21/182)、6.59%(12/182)、3.85%(7/182);共发现43个新的致病突变,并检测到6例家系携带RPGR ORF15区的突变。结论:针对临床确诊的IRDs病例,HEDEP较WES能获得更高的基因诊断阳性率和更精确的诊断结果,可作为IRDs基因诊断的首选方法,WES可作为其他基因诊断方法的补充手段。同时,本研究丰富了IRDs致病基因的突变频谱,为将来IRDs基因诊断、遗传咨询和基因治疗奠定了基础。     

全外显子组测序和目标序列靶向捕获测序在遗传性视网膜变性基因诊断中的差异

目的:对比外显子组测序(whole exome sequencing,WES)和目标序列靶向捕获测序检测中国遗传性视网膜变性(inherited retinal dystrophies,IRDs)患者致病基因变异的差异。方法:收集182例IRDs家系,所有先证者均接受系统的眼科检查和必要的全身检查,采集患者及家属血样并提取基因组DNA。按照就诊的时间顺序将患者平均分为两组,一组91例接受WES,另一组91例应用本课题组设计并定制的“遗传性眼病基因诊断芯片” (hereditary eye disease enrichment panel,HEDEP)进行IRDs致病基因外显子区域靶向捕获测序。对候选致病基因用Sanger测序进行验证,并对家系成员进行共分离分析,使用多重连接依赖的探针扩增技术对拷贝数变异进行验证,针对二代测序捕获效率低的区域如RPGR ORF15区,应用Sanger 测序补充检测。根据美国医学遗传学与基因组学学会和分子病理学协会(American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology,ACMG/AMP)制定的《ACMG/AMP基因变异分类标准与指南》将检测到的所有基因变异进行分类,本文只包含“致病的”、“可能致病的”的基因变异,不包含“意义不明确的”、“可能良性的”和“良性的”基因变异。结果:应用HEDEP确诊的家系共51例,阳性率为56.04%(51/91);应用WES确诊的家系共30例,阳性率为33.00%(30/91);总阳性率44.51%(81/182)。平均测序深度以及测序覆盖度方面,HEDEP优于WES,此外HEDEP具有检测拷贝数变异潜力。本研究共检测到29个IRDs基因的致病突变,最常见的致病基因为USH2A、ABCA4和RPGR,基因突变频率分别为11.54%(21/182)、6.59%(12/182)、3.85%(7/182);共发现43个新的致病突变,并检测到6例家系携带RPGR ORF15区的突变。结论:针对临床确诊的IRDs病例,HEDEP较WES能获得更高的基因诊断阳性率和更精确的诊断结果,可作为IRDs基因诊断的首选方法,WES可作为其他基因诊断方法的补充手段。同时,本研究丰富了IRDs致病基因的突变频谱,为将来IRDs基因诊断、遗传咨询和基因治疗奠定了基础。     

全外显子测序技术诊断Sheldon Hall综合征

目的：应用全外显子测序技术（whole exome sequencing,WES）辅助临床诊断2例远端关节弯曲Sheldon Hall综合征家系,为患者遗传咨询和产前诊断提供依据。方法：收集临床资料,提取患者及家系成员外周血基因组DNA,采用外显子捕获技术进行检测,结合生物信息学软件及数据库进行分析,根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG,2015）标准对检测出的变异进行致病性判定,结合患者临床表型寻找致病基因及位点,最后经Sanger测序法对致病位点进行验证。结果：家系中2例患者TNNI2基因第8号外显子均存在杂合突变（c.525_c.527delGAA,p. 176delK）,为常染色体显性遗传,生物信息学分析为致病性突变,Sanger测序验证结果与外显子捕获测序结果一致。结论：应用全外显子测序技术对远端关节挛缩畸形的患者进行诊断,明确致病原因,为家系遗传咨询和产前诊断提供指导。     

糖尿病增殖型视网膜病变外显子组测序研究

目的本研究组拟应用目标区域捕获与外显子测序技术对2型糖尿病增殖型糖尿病视网膜病变患者进行外显子组测序分析。方法选择于首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科就诊的2型糖尿病患者中进行彩色眼底照相及眼科医师检眼镜检查者。50名糖尿病人病史小于15年患增殖型糖尿病视网膜病变的患者作为病例组,50名糖尿病病史10年以上而无糖尿病视网膜病变且糖化血红蛋白大于7.0%患者作为对照组。提取外周血DNA,应用NimbleGen商业化2.1M外显子序列捕获芯片结合高通量测序技术进行外显子组区域的重测序。结果无视网膜病变组和增殖型视网膜病变组年龄分别为(60.00±7.89)岁、(55.81±7.75)岁(P=0.007);糖尿病病程分别为(13.67±3.87)年、(10.55±4.16)年(P=0.000 1)。2组间体质量指数、血压、糖化血红蛋白、血脂、肾功能差异均无统计学意义。增殖型视网膜病变组较无视网膜病变组有较高的糖尿病肾病患病率,分别为70.6%、21.6%,P=0.000。外显子组测序结果显示目标区域的平均测序深度42×。发现已知非同义单核苷酸多态性14 386个,新的非同义单核苷酸多态性6 444个。结论应用目标区域捕获与外显子测序技术对2型糖尿病增殖型糖尿病视网膜病变进行测序分析显示,大量单核苷酸多态性可能与增殖型糖尿病视网膜病变相关,有待于进一步在大样本研究及实验研究中验证其在增殖型糖尿病视网膜病变发病中的具体作用。     

dHMN-V型家系BSCL2基因和GARS基因突变分析

目的 报告1个远端型遗传性运动神经病V型(distal hereditary motor neuronopathy V, dHMN-V) 家系, 并探讨与BSCL2 (berardinelli-seip congenital lipody- strophy 2)基因和GARS基因 (glycyl tRNA synthetase)突变的关系.方法 对该家系进行临床及电生理检查,并应用PCR 直接测序法对先证者及其部分家系成员进行GARS基因全部17个外显子和BSCL2基因3号外显子突变检测.结果 该家系5代共13例患者,临床主要表现为成年起病,开始为单或双手大鱼际肌萎缩,逐渐出现小鱼际肌、手部骨间肌萎缩,遇冷挛缩,继而出现足趾骨间肌萎缩;肌电图提示运动神经神经传导速度降低,而感觉神经神经传导速度基本正常;突变分析结果显示该家系BSCL2基因3号外显子糖基化位点无突变,在GARS基因也未发现致病突变,仅在内含子区和外显子非编码区发现3个多态,分别为IVS18+136G→A, IVS17-6C→T和 C.-39G>C,其中IVS18+136G→A, IVS17-6C→T为新发现的2个多态.结论 dHMN-V具有临床和遗传异质性,其可能存在除BSCL2基因和GARS基因外的新的基因位点.     

全外显子组测序分析中预处理方法和变异识别方法的比较

目的：比较全外显子组数据分析中不同的预处理方法和变异过滤方法对变异识别的影响。方法：利用２例全外显子组测序数据,从使用不同的预处理方法（FASTX-Toolkit、Trimmomatic及未做预处理）、修饰后不成对读长（single-end reads,SE）取舍策略以及变异过滤方法[Hard过滤和变异质量得分重新校正（variant quality score recalibration,VQSR）]3个方面,通过数据覆盖深度（depth of coverage,DP）、识别变异的数目、转换/颠换比值和基因型一致性等特征,比较他们对全外显子组变异识别结果的影响。结果：Trimmomatic预处理后的读长测序ＤP与未预处理的原始数据接近,但明显高于FASTX-Toolkit预处理方法。当DP≥10×且基因型质量分数（genotype quality score,GQ）≥20时,经Trimmomatic预处理后识别到的单核苷酸变异（single nucleotide variant,SNV）数量比FASTX-Toolkit多,与未预处理组接近。当包含SE时,FASTX-Toolkit组多识别出的SNV数量高于（28%）Trimmomatic组（5%）。当样本量较少时,在所有实验组中Hard过滤方法滤掉的SNV要少于VQSR。结论：Trimmo－matic修饰（过滤）原始序列更温和,而FASTX-Toolkit可能过度过滤了原始数据。保留SE有利于下游变异识别。Hard过滤相较于VQSR表现出了更高的容忍度。     

全外显子组测序诊断2例Gitelman综合征

中南大学湘雅三医院内分泌科收治了2例疑诊Gitelman综合征的患者。抽取2例患者外周血进行基因组DNA抽提,然后采用全外显子组测序进行基因学检测,寻找致病位点,并通过生物信息学软件对突变位点进行功能分析。全外显子组测序及Sanger测序验证发现2例Gitelman综合征患者均携带SLC12A3基因复合杂合突变：c.486＿490delTACGGinsA、p.R943W、p.D486N及p.R928C。其中c.486＿490delTACGGinsA插入缺失突变将造成框移及蛋白质截短,而p.R943W、p.D486N及p.R928C突变经SIFT、PolyPhen2和Mutation Taster预测为有害。这4个突变既往均有报道,其中p.R943W为首次在中国人群中发现。Gitelman综合征临床较罕见,漏诊率高。对Gitelman综合征患者及早进行基因检测有助于明确病因及指导治疗。     

全外显子组测序在自身免疫性疾病中的研究进展

自身免疫性疾病(autoimmune diseases,AIDs)是指机体对自身抗原发生免疫应答而导致自身组织损害的一类疾病,其确切发病机制尚不明确,目前普遍认为遗传因素在AIDs的发生发展中发挥重要作用.近年来,全外显子组测序技术的发展与应用鉴定了多个遗传变异与AIDs相关,并证实这些变异位点通过不同机制参与疾病的各...     

全外显子组测序技术检出Kallmann syndrome患者KAL1基因新突变

目的 分析Kallmann syndrome家系患者的分子遗传机制.方法 利用全外显子组测序技术对先证者进行测序分析,按照ACMG解读规则筛选致病性突变,Sanger测序对所有家系成员验证突变结果.结果 捕获且比对到目标区的碱基量为3418.98Mb,平均测序深度为77.66X,覆盖度为99.23％,共检出5056个变异,3174为罕见变异（RSV）,KAL1基因c.1735_1736insT突变为疑似致病性突变,且满足家系共分离.结论 KAL1基因c.1735 1736insT框移突变为新的疑似致病性突变.     

全外显子测序技术在产前诊断中的应用

随着高通量测序技术的不断发展,全外显子测序技术在产前诊断中的应用逐渐普遍.全外显子测序是利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并聚集后进行高通量测序,分析解读后找到致病变异或与疾病相关新基因的分析方法,具有检测范围广、检出率高、检测性价比高的优点.全外显子组测序技术将围产儿遗传缺陷疾病的研究深入到基因层面,把临...     

染色体微阵列分析和全外显子组测序在产前罕见疾病诊断中的应用

目的 探讨产前罕见疾病的诊断方法。方法 选取4845例有产前诊断指征的孕妇,所有胎儿均行CMA检测CNV,在排除非整倍体和异常CNV后,其中68例进一步行WES检测。结果 4842例样本CMA检测成功,检出染色体异常537例(11.09%),经分析明确致病性变异为370例,包括：非整倍体214例,致病性CNV 134例和部分CNV嵌合22例。疾病主要涉及1q21缺失综合征(7例)、DiGeorge综合征(6例)、17q12缺失综合征(6例)、Cri-du-chat综合征(5例)、16p11.2缺失综合征(5例)。WES结果显示在68例CMA结果阴性的胎儿中检出13例单基因病(19.12%)。结论 CMA和WES是明确产前胎儿遗传病因和产前诊断的有效手段。     

全外显子测序在糖尿病肾病中的应用

糖尿病肾病（DKD）作为糖尿病最常见的并发症之一,是以微血管损伤为特征的肾功能损害,是导致终末期肾脏衰竭的首位病因,但其具体发生发展机制复杂。临床和流行病学表明,DKD在不同种族群体中存在家族聚集性,表明遗传因素参与了疾病的进展。全外显子测序（WES）包括对人类基因组中所有外显子的捕获、测序和分析。本文旨在总结WES在DKD中的最新进展,期待为未来的临床诊治开发新的靶点。     

利用全外显子组测序技术对妊娠中期胎儿双肾缺如的病因分析

摘要:目的 利用全外显子组测序技术对妊娠中期胎儿双肾缺如的病因分析。方法 选取华中科技大学同济医学院附属同济医院产检患者1例,该患者孕期超声发现胎儿出现双肾缺如的形态学异常,胎儿父母经遗传咨询决定终止妊娠。采集引产胎儿组织标本及其父母的外周血样,提取基因组 DNA,使用全外显子组高通量测序检测技术进行样本检测,并采用生物信息学方法进行数据分析、对比、解读。结果 引产儿大体观可见面部鼻梁增宽,符合 Alagille综合征面部畸形变化。全外显子测序结果比照 HumanGenome38(hg38/GRCh38)、RefSeq、dbSNP、1000Genomesphase3、ExAC、gnomAD、神州基因组数据库等数据库,所用解读数据库包括 DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC、ClinVar、HGMD 及PubMed等数据库,显示引产胎儿的染色体20p12.2区存在0.15kb大小的JAG1基因16号外显子杂合缺失,而引产儿父母均无该基因外显子异常。通过临床及基因测序分析,考虑引产胎儿诊断为 Alagille综合征1型。此外还发现基因EYA1的c.361G>C突变,其与常染色体显性遗传疾病鳃-耳-肾综合征1型有关。结论 该研究首次报道JAG1基因第16号外显子杂合缺失可能与以胎儿双肾缺如为临床特征的 Alagille综合征1型疾病相关,该发现为遗传咨询领域资料提供了一定程度的补充。     

全外显子测序技术检测在原发性免疫缺陷病诊断中的应用

全外显子测序(WES)技术因相对经济有效,已被广泛应用于临床疾病的基因诊断中.本文主要探讨WES在原发性免疫缺陷病(PID)临床诊断中的应用,系统总结了在WES检测辅助下找到的PID的致病基因以及新发现的致病基因,并将其分为转录因子相关基因和非转录因子相关基因两大部分.希望能为临床基因诊断提供帮助.     

全外显子组测序发现一家族性扩张型心肌病致病基因

 目的 对一扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)家系行全基因组外显子测序以寻找该家系的致病基因。方法 收集在复旦大学附属中山医院就诊的1位DCM患者及其家系成员的临床资料,采集相关家系成员外周血并抽提DNA,对该家系5名成员行全基因组外显子测序,寻找致病基因,用Sanger测序对家系其他成员进行验证。结果 通过对家系患者与正常人测序结果比对分析,同时经过多个生物数据库数据过滤,发现LMNA基因6号外显子上存在的杂合突变 c.961 C>T (p.Arg321Ter)为该家系的可能致病基因突变。LMNA c.961 C>T无义突变导致LMNA编码蛋白质过程提前终止,相应蛋白质功能异常,进而导致该家系中此突变基因的携带者出现心功能异常。结论 本研究应用全基因组外显子测序从一DCM家系中发现其致病基因及突变位点:LMNA c.961 C>T (p.Arg321Ter),突变导致该家系相关成员心功能异常。此位点在汉族人群中尚属首次报道。     

全外显子组测序鉴定盐酸氢吗啡酮镇痛引发呼吸抑制反应相关联的基因变异位点

目的 探索与盐酸氢吗啡酮镇痛后出现呼吸抑制反应相关联的基因变异位点。方法 采用病例-对照研究,选取10例癌症患者作为研究主体,给予盐酸氢吗啡酮镇痛,记录患者是否存在呼吸抑制反应,并采用全外显子组测序(WES)技术分析他们的基因变异位点。结果 10例患者中有4例在使用盐酸氢吗啡酮镇痛后出现呼吸抑制反应;WES结果表明,在4例阳性病例中同时检测出的基因变异有5 871种,包括5 570个单核苷酸多态性(SNP)和301个小片段的插入或缺失(Indel)。通过差减法扣除在6个阴性病例中出现的SNP和Indel,最终得到与盐酸氢吗啡酮镇痛后出现呼吸抑制反应密切相关的5个SNP (rs6780995、rs17136118、rs1048445、rs12931472和rs72981971)。结论 成功鉴定出5个可能与盐酸氢吗啡酮镇痛后出现呼吸抑制反应相关联的差异性SNP,需进一步研究证实其临床意义。     

一组家族遗传性疾病全基因组测序的分析报告

目的:临床上发现一组特殊病例,一个家族4代人中均发现有同一种神经肌肉性疾病的患者,症状具体表现为上肢肘关节有不同程度的伸直受限,下肢踝关节似马蹄样畸形,足部高弓畸形?无明显内翻内收现象?本研究拟通过全基因组测序,探讨其发病的致病基因及分子机制?方法:利用高通量测序技术,分别对患儿?具有相似症状的患儿父亲及健康母亲的血液样本进行全基因组测序?利用生物信息学分析筛选疾病相关基因突变,并进一步收集该家族中的其他患病及健康成员的血液样本,利用PCR技术进行验证?结果:生物信息学分析发现一系列突变基因,包括ANXA3基因突变[chr4,c.C820T(p.R274*)]?ATP6V1E2基因突变[chr2,c.G136A(p.V46M)]和HIST1H3A基因突变[chr6,c.C205T(p.Q69*)]等?基于家族更多成员血液样本的PCR实验结果进一步证实,ANXA3为该疾病潜在的致病基因,突变可导致其蛋白质高级结构的改变,可能与该疾病发生有关?结论:本研究为从分子水平上了解该家族遗传性疾病的发生提供了一定的理论参考?