不同基因型HCV膜区（E2）基因克隆及亲、疏水性分析

目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）不同基因型膜区序列变异及其变异规律。方法 克隆不同基因型HCV的膜区基因,序列测定,核苷酸和氨基酸序列比较和分析。结果 不同基因型膜区基因相似性不同,从同一血清样本获得的不同克隆间,其同源性核苷酸大于99．2％,氨基酸大于99．9％。相同亚型核苷酸和氨基酸同源性大于80％。同型基因核苷酸和氨基酸同源性分别为（63．9－75．0）％和（64．9－72．8）％。异型基因同源性核苷酸为（59．4－67．0）％,氨基酸为（56．5－66．3）％。氨基酸序列变化在某些部位有一定保守性。不同基因HCV高变区（HVR）的亲水性和疏水性变化小于其下游3′端区域。结论 HCV基因变化可能有一定规律性。     

藏猪白细胞介素4基因Cdna的克隆及序列分析

目的：克隆藏猪白细胞介素4基因cDNA。方法：从体外ConA刺激70小时的藏猪外周血淋巴细胞中提取总RNA，应用RT-PCR技术扩增，pMD-T载体连接，常规转化后，进行酶切及序列测定进行鉴定。结果：研究表明克隆得到的IL-4基因cDNA与成华猪的IL-4同源性达到99％，与长白杂交猪的同源率为98％。结论：从藏猪外周血淋巴细胞中成功地分离到IL-4基因。     

弓形虫HT分离株ROP5蛋白基因的克隆、序列分析及其表达研究

目的克隆和表达弓形虫虎源分离株（HT株）ROP5蛋白基因。方法运用RT—PCR技术从弓形虫HT株中扩增出ROP5基因，将其克隆人T载体中进行测序和分析．并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。结果该基因全长1650bp，编码549个氨基酸。其中前24个氨基酸构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比，有12个核苷酸有差异，导致7个氨基酸发生改变，两者核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99．2％和98．9％。转化重组质粒pETROP5的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG的诱导下，可表达出相对分子质量为64800的重组蛋白，并且能与弓形虫抗体发生血清学反应，表达量占菌体蛋白的15．6％。结论成功克隆和表达了弓形虫HT株ROP5蛋白基因，表达的重组蛋白具有良好的反应原性。     

弓形虫虎源分离株ROPIO基因的克隆、序列分析及其表达研究

采用RT-PCR技术从弓形虫虎源分离株中扩增出ROP10基因，将其克隆入pMD18．T载体中进行测序和生物信息学分析，并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。该基因全长1761bp，编码586个氨基酸，其中前28个氨基酸残基构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比，16个核苷酸存在变异，导致7个氨基酸发生改变，但两者N-联糖基化位点的数量和位置没有差异，两虫株核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99．2％和98．8％。转化重组质粒pETROP10的大肠杆菌B121（DE，）在IPTG的诱导下，可表达出分子量为67．6kDa的重组蛋白，表达量占菌体蛋白的13．8％。     

弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因的克隆、鉴定与生物信息学分析

目的克隆并鉴定弓形虫PRU株表面抗原SAG2C基因序列和cDNA序列，对比不同毒力弓形虫株（PRU、RH、ME49）中SAG2C基因序列。进行生物信息学分析。方法根据SAG2C基因已知序列设计合成一对引物，应用PCR技术从Prugniaud（PRU）株弓形虫基因组DNA和总RNA中扩增SAG2C基因，克隆入pMD19-T载体并进行序列测定。应用DNAMAN软件、NCBI网站（http：／／www。ncbi．nlm．nih.gov／）分析3种虫株之间SAG2C基因的同源性；利用生物信息学网站ExPASy（http：／／us.expasy．org／）对获得的基因及推导出的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果PCR扩增得到弓形虫PRU株SAG2C基因及其全长cDNA序列．酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒。测序结果表明，获得SAG2C基因序列1225bp，全长cDNA序列1095bp，编码364个氨基酸。同源性分析显示。弓形虫Prugniaud株和RH株SAG2C基因同源性为97．14％；Prugniaud株与ME49株cDNA序列同源性为96．89％；编码氨基酸序列同源性为92％。N端为信号肽，C端疏水序列预测它为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白．存在13个潜在抗原表位及多个保守功能区域。结论成功克隆了弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因序列及其全长cDNA序列。序列分析显示其为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白。     

中国狂犬病固定毒aG株N,NS和M蛋白基因的核苷酸序列测定

报告了中国狂犬病固定毒ａＧ株核衣壳蛋白（Ｎ蛋白），核蛋白壳磷酸蛋白（ＮＳ蛋白，又称Ｍ１蛋白）和基质蛋白（Ｍ蛋白，又称Ｍ２蛋白）蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸推导序列。各基因编码区的全长分别是：Ｎ基因１３５２，ＮＳ基因８９４和Ｍ基因６０９个核苷酸。ａＧ和ＣＶＳ株的Ｎ，ＮＳ和Ｍ基因的核苷酸序列都具有高的同源性，分别为９１．９５％，９０．２７％和９０．８０％。     

中国狂犬病固定毒aG株N,NS和M蛋白基因的核苷酸序…

报告了中国狂犬病固定毒ａＧ株核衣壳蛋白（Ｎ蛋白），核蛋白壳磷酸蛋白（ＮＳ蛋白，又称Ｍ１蛋白）和基质蛋白（Ｍ蛋白，又称Ｍ２蛋白）蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸推导序列。各基因编码区的全长分别是：Ｎ基因１３５２，ＮＳ基因８９４和Ｍ基因６０９个核苷酸。ａＧ和ＣＶＳ株的Ｎ，ＮＳ的Ｍ基因的核苷酸序列都具有高的同源性，别为９１．９５％，９０．２７％和９０．８０％。     

副粘病毒Tianjin株F基因克隆及序列分析

目的探索副粘病毒Tianjin株的来源和种系进化地位。方法以副粘病毒Tianjin株基因组RNA为模板，通过RT-PCR方法获得包括F基因全长的两个质粒克隆，分别进行序列测定。将拼接得到的F基因核苷酸序列及推导出的氨基酸序列与GenBank中公布的15株仙台病毒相应序列进行同源性比较，并构建系统进化树。结果副粘病毒Tianjin株与15株仙台病毒F基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别在85．3％～94．5％和90．4％～95．4％之间。进化树分析表明，Tianjin株与仙台病毒BB1株亲缘关系较近，但仍有一定差距，与其他仙台病毒株关系较远。结论副粘病毒Tianjin株很可能不属于仙台病毒现有的Ohita株、Z株及BB1株所代表的3个进化分支，而是独立于这3个分支之外。     

福氏2a志贺菌磷酸烯醇丙酮酸盐合成酶基因的克隆与序列分析

目的：福氏2a志贺菌301株染色体编码与代谢相关的酶类基因，分析结构特点并进行同源性比较，以期部分阐明其与大肠杆菌生化特性相似的分子生物学基础。方法：鸟枪法随机克隆福氏2a志贺菌染色体DNA，经探针杂交和末端核苷酸序列测定筛选出带有磷酸烯醇丙酮酸合成酶（pps）完整基因的阳性克隆，利用exouclease Ⅲ制备嵌套缺失体亚克隆，采用双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列。结果：福氏2a志贺菌301株pps基因（全长2474bp）与大肠杆菌pps基因核苷酸及氨基酸序列的同源性分别为98．8％和97．6％。编码区上游和下游存在较多变异。福氏2a志贺菌301株pps基因与GenBank中其它菌株pps基因的同源性均低于55％。结论：福氏2a志贺菌pps基因苷酸序列与大肠杆菌pps基因核酸序列高度同源。     

四川省流行性乙型脑炎病毒优势基因型的研究

目的了解四川省乙脑主要流行区乙脑病毒的分子生物学特性,为防治提供依据。方法对2007-2010年间分离到的13株乙脑病毒进行PreM和E基因区扩增,采用MEGA5生物学软件完成氨基酸序列和病毒进化树分析。结果基因分型显示13株均属于基因I型。13株病毒之间比较,PreM基因核苷酸和氨基酸同源性为97％-100％和98．7％-100％,E基因核苷酸和氨基酸同源性为97．8％～99．9％和99．6％～100％,其同源性极高。13株病毒与2004年四川分离株比较E基因核苷酸同源性在97．7％～99．6％之间,氨基酸同源性在98．6％-100％之间;PreM基因的核苷酸同源性在96．2％-99．1％之间,氨基酸同源性在97．5％-98．7％之间;与疫苗株P3和SA14—14—2比较E基因核苷酸和氨基酸同源性分别为87．6％～88．3％和97％～97．8％;PreM基因核苷酸和氨基酸同源性分别为84．1％～85．8％和93．7％-96．2％。13株病毒E基因的8个氨基酸毒力位点均没有发生改变。结论四川省乙脑病毒已呈现基因I型为优势型别的态势,其PreM和E区核苷酸和氨基酸高度保守,关键的氨基酸毒力位点没有变化,提示目前使用的疫苗对流行株的感染具有保护作用。     

犬IL-18 cDNA的克隆及其免疫学特性

目的：获得犬白介素-18(cIL-18)基因并探讨其作为基因疫苗佐剂的免疫效果。方法：从犬的外周血中分离白细胞，经ConA刺激培养5～12h。提取犬白细胞总RNA作为模板，通过RT-PCR技术扩增cIL-18 cDNA。将其克隆到载体pMD18-T中测序，并与已发表的序列进行比较。将cIL-18 cDNA克隆入pIRES1 neo中，构建cIL-18真核表达载体。以200txg：200txg的比例，与狂犬病病毒糖蛋白表达载体plGneo混合免疫犬，并与糖蛋白单独免疫犬的免疫应答进行比较。结果：扩增获得单一长约0．6kh核酸带，测序证明长度为582bp，编码193个氨基酸，与从犬肺巨噬细胞中扩增的cIL-18基因的序列完全一致。以构建的表达载体pIIL18与pIGneo混合免疫与用pIGneo单独免疫相比较，前者抗狂犬病病毒特异性抗体的水平显著低于后者；但混合免疫组犬外周血淋巴细胞对特异性和非特异性抗原刺激的反应性显著高于糖蛋白单独免疫组。结论：cIL-18全长为582bp，其真核表达载体具有增强细胞免疫应答的能力，同时可显著抑制体液免疫应答。本研究为cIL-18作为基因疫苗佐剂的研究奠定了基础。     

高原鼠兔血红素氧合酶1的基因克隆及序列分析

 [摘 要] 目的:克隆高原鼠兔血红素氧合酶1（heme oxygenase-1,HO-1）基因cDNA的全长序列,并分析其序列特征,为进一步揭示高原鼠兔低氧适应的分子机制提供有益参考。方法:从高原鼠兔肝组织中提取总RNA,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术和cDNA末端快速克隆（RACE）技术扩增出HO-1基因cDNA全长序列并进行测序,测序结果采用生物信息学的方法进行分析。结果:克隆所得鼠兔HO-1基因cDNA全长片段大小为1 466 bp,与预期一致,编码区长度为873   bp,编码290个氨基酸（GenBank登录号为：JX035934）;序列分析结果显示,核苷酸序列和推测的氨基酸序列相似性比较,与兔、人、牛、小鼠、大鼠、猪和马的HO-1核苷酸序列的同源性分别为89%、87%、85%、79%、84%、85%和85%,与兔、人、牛、小鼠、大鼠、猪和马的HO-1氨基酸序列的同源性分别为89%、85%、84%、80%、79%、82%和67%,显示出高度保守性。构建的基于氨基酸序列的分子系统进化树聚类结果表明,高原鼠兔与兔的进化距离最近。结论: 本实验首次成功克隆出高原鼠兔HO-1基因cDNA全长序列,为从低氧细胞保护角度,进一步探讨青藏高原土著物种适应高原的分子生物学机制研究提供实验依据。     

Molecular cloning, functional characterization and genomic organization of four alternatively spliced isoforms of the human organic cation transporter 1 (hOCT1/SLC22A1)

In this study we report the cloning of four human OCT1 ( hOCT1 / SLC22A1 ) isoforms: a long form, hOCT1G/L554, and three shorter forms (hOCT1G/L506, hOCT1G483 and hOCT1G353). All four variants could be identified in the human glioma cell line SK-MG-1, whereas only two isoforms (hOCT1G/L554 and hOCT1G/L506) were found in human liver cDNA. The hOCT1G/L554 represents the full length hOCT1 since the sequence of this clone is more than 99% identical to previously cloned hOCT1 cDNAs. Elucidation of the gene structure of human OCT1 demonstrated that the other isolated isoforms are alternatively spliced variants. The hOCT1 gene consists of 7 exons and 6 introns. When stably expressed in human embryonic kidney (HEK293) cells, only the full length hOCT1 cDNA mediated decynium-22 (D22)-sensitive uptake of tritiated 1-methyl-4-phenylpyridinium ([³H]-MPP⁺).     

人B细胞活化相关基因BC-1514全长cDNA的克隆与原核表达

目的 克隆与B细胞活化相关的新基因及其原核表达。方法 采用差异显示反转录PCR（DDRT-PCR）技术对人扁桃体活化和静止B细胞mRNA的差异表达进行分析。差异显示的片段经过Northern杂交验证后,作为探针进行入活化B细胞cDNA文库的筛选,将所获得的阳性克隆的编码区经PCR扩增后克隆到原核表达载体pGEX-5X-1中,重组质粒经酶切,测序鉴定后转化大肠杆菌BL-21,以IPTG诱导表达融合蛋白。结果 以在活化B细胞高表达的EST32为探针,经3轮筛选人活化B细胞文库获得一个新的全长为1514bp的cDNA克隆（命名为BC-1514）,重组的BC-1514蛋白可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达,其表达量约占细菌总蛋白量的14.3%左右,BC-1514cDNA的GenBank的登录号为AF304442。结论 获得了1条新的与B细胞活化相关的cDNA克隆并在E.coliBL-21中得到了有效表达。     

5′和3′末端快速扩增法克隆多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2

目的在多发性骨髓瘤患者中KIAA0058基因序列表达明显下调,从正常人骨髓单个核细胞中克隆该序列全长cDNA,以期更好地研究该序列结构,获得其功能信息。方法采用末端快速扩增法(RACE),进行多轮RT-PCR后,对PCR产物进行测序、拼接、证实,与NCBI核酸数据库进行比对。结果该序列全长cDNA长度为1913bp,登陆号为AY430097,与来源于人睾丸cDNA文库的序列DAZAP2同源性高达99%以上。该序列具有较短的5′非翻译区及长的3′非翻译区,开放阅读框序列从第84位碱基至590位碱基,具有poly(A)尾。结论利用RACE法,从骨髓单个核细胞中成功克隆了DAZAP2全长cDNA。     

用标记磁微粒技术克隆牛CD14基因

为获得牛ＣＤ１４ 的全长编码基因，以探讨牛ＣＤ１４ 基因结构与功能的关系，进一步阐明其作用机理，我们用抗牛ＣＤ１４ 的单克隆抗体（ｍＡｂ）ＣＣＧ３３ 标记的磁微粒作为探针，从转染有牛肺泡巨噬细胞ｃＤＮＡ文库的ＣＯＳ７细胞中进行筛选。并对获得的牛ＣＤ１４ ｃＤＮＡ进行了克隆和序列分析。结果表明，牛ＣＤ１４ 基因全长为１１２２ ｂｐ，共编码３７３ 个氨基酸，其中含有信号肽序列和３ 个可识别的Ｎ连接糖基化位点，但缺少穿膜结构域及细胞内区。证实牛ＣＤ１４ 以糖基磷脂酰肌醇（ＧＰＩ） 锚定在靶细胞膜上；其氨基酸序列与人和小鼠ＣＤ１４ 的同源性分别为７３－５ ％ 和６１－４ ％ ，三者共有的保守序列约为５５％ 。     

Cloning of cDNA for the bovine IL-2 receptor (bovine Tac antigen).

We have cloned the Tac analog of the bovine IL-2 receptor (IL-2R) cDNA. Using mouse and human cDNA probes, we isolated five bovine IL-2R clones from a lambda gt11 bovine long-term lymphocyte cDNA library. Three of the clones had inserts of 2600 base pairs (bp), the same size as the bovine IL-2R mRNA visualized on Northern blots. The full-length cDNA contain a 190-bp 5' untranslated region, followed by a 825-bp coding region, and a 3' untranslated region that contain 1600 bp. Comparison of the bovine and human IL-2R-coding sequences revealed 71% homology at the nucleotide level. The 3' and 5' non-coding regions were not as homologous, apart from a specific site in the 5'-untranslated region that contained a 5'-upstream start codon. In this region, 24 of 26 nucleotides were identical for the human and bovine cDNAs. Further analysis of the bovine IL-2R sequence also revealed the following: (i) the hydrophobic domains of the IL-2R protein were more conserved between species than the hydrophilic domains, (ii) the predominant site of intracellular IL-2R phosphorylation in mouse and human was a conserved Ser which was not conserved in the bovine sequence, and (iii) there exists a statistically significant amino acid homology with the AIDS gag protein.