利鲁唑对大鼠背根节神经元诱发簇放电的抑制作用及电流机制

目的 探讨利鲁唑（riluzole）对慢性背根节压迫（chronic compression of dorsal root ganglion,CCD）模型大鼠背根节（dorsal root ganglion,DRG）神经元诱发簇放电（evoked-bursting,EB）的抑制作用及电流机制.方法 33只健康SD大鼠,随机分为正常对照组（n=13）及CCD模型组（n=20）,进行离体膜片钳全细胞记录.结果 CCD术后DRG神经元EB发生率增高,达53%（44/83）,与正常对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;DRG局部给予利鲁唑（1、10、100 μmol/L）浓度依赖性抑制持续性钠电流（persistent sodium current,INaP）,100 μmol/L利鲁唑可抑制阈下膜电位振荡幅度及EB放电.结论 利鲁唑通过阻断INaP抑制EB放电而发挥外周镇痛作用.     

阈下膜电位振荡介导受损DRG神经元的交感敏化现象

目的:在背根节(dorsal root ganglion,DRG)慢性压迫这一神经病理性痛模型研究交感敏化的膜机制. 方法:采用离体细胞内记录,在受损DRG神经元观察去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)对其膜电位的影响. 结果:NE在受损(40/45)及正常(15/22)DRG 神经元均可以诱发膜电位的去极化过程. NE诱发的膜电位去极化有浓度依赖性且可被酚妥拉明阻断. 仅有部分受损DRG 神经元可在NE诱发的膜电位去极化基础上出现阈下膜电位振荡(subthreshold membrane potential oscillation, SMPO)并随后出现重复放电. 当应用TTX选择性地消除SMPO后,虽然NE诱发的膜电位去极化仍然存在,但神经元的重复放电不再产生. 结论:触发及增大SMPO是NE诱发受损DRG 神经元兴奋效应产生的一个关键因素.     

大鼠背根节内两类兴奋性神经元的放电特征

目的:观察大鼠背根节(DRG)神经元兴奋性分类的放电特征.方法:在新鲜分散的中、小型大鼠背根节神经元运用全细胞膜片钳技术,观察给予胞内去极化,超极化电流刺激引起细胞放电的特征.结果:根据大鼠背根节神经元的放电特征可将它们区分为两类兴奋性.1类:神经元兴奋性与刺激强度相关,逐渐增强的去极化刺激可引发频率由低到高的动作电位.一般于超极化刺激后不产生反跳动作电位.动作电位的幅值一致,符合"全或无"定律.2类:神经元的兴奋性与去极化刺激强度关系不明显,神经元放电频率比较稳定,不随刺激强度的增强而增加,放电前后有规律的膜电位振荡.于较弱的超极化刺激后可产生反跳动作电位.动作电位的幅值不一致.结论:大鼠DRG两类兴奋性神经元各具不同的放电特征.     

背根节初级感觉神经元的温度敏感性

目的:观察大鼠背根节 (DRG) 中型神经元的温度敏感性. 方法:在新鲜分散的大鼠背根节中型神经元运用全细胞膜片钳技术,观察给予不同温度梯度刺激下引起细胞放电的特征. 结果:根据大鼠背根节中型神经元在不同温度梯度刺激下的放电特征可将它们区分为两类温度敏感神经元. Ⅰ类神经元的温度敏感性与冷温度变化密切相关,随着温度的升高而引发的逐渐增强的膜电位超级化可引发频率由高到低的动作电位. 随着温度的降低神经元又表现出频率由低到高的动作电位变化. 动作电位的幅值一致,符合"全或无"定律. 该类神经元具有电压依赖性. Ⅱ类神经元的兴奋性与温度变化的关系不明显,随着温度升高或降低,神经元只出现一个动作电位,其频率没有变化,仅仅表现在随温度升高,动作电位的幅值降低,温度降低后,其幅值又恢复. 结论:大鼠DRG两类神经元在温度变化一致的情况下各具不同的冷温度敏感性.     

用于膜片钳研究的大鼠背根神经节细胞急性分离技术的改良

目的通过技术改良,进一步摸索适于膜片钳实验的成年大鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)细胞的急性分离方法。方法应用显微外科技术获取成年大鼠DRG,采用改良的双酶顺序消化(先胶原酶,后胰蛋白酶)及双血清(胎牛血清+马血清)共同培养法,急性分离培养DRG。倒置显微镜下观察神经元的形态,选取已贴壁的细胞,用全细胞膜片钳技术记录其基本膜电生理特性。加入河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)后再次记录DRG神经元的钠离子电流变化。结果本实验可获得形态良好、结构完整的单个DRG神经元,表面光亮,胞膜完整清晰,呈圆形或椭圆形。其静息膜电位为(55.22±4.39)mV,加入TTX后可记录到缓慢失活的河豚毒素不敏感(tetrodotoxin-resistant,TTX-r)的钠离子电流。其中,中等直径DRG神经元高阻封接成功率为73.2%,高于小直径和大直径DRG神经元的封接成功率(P<0.05)。结论经改良的DRG急性分离方法分离效率高、可操作性强。分离得到的中等直径DRG神经元状态良好,更适合膜片钳实验。     

低频刺激抑制GABA介导背根神经节神经元膜去极化反应

目的:探讨低频率电刺激对GABA介导的背根神经节神经元膜电位去极化反应的影响.方法:新鲜分离的大鼠DRG坐骨神经干标本,通过细胞内微电极记录技术,应用波宽5 ms,强度2 V,频率分别为2 Hz和10 Hz的脉冲波作用于大鼠坐骨神经远端,观察刺激前后GABA(3×10-4mol/L)介导的DRG神经元膜电位去极化反应幅值的变化.结果:低频电刺激(2 Hz、10 Hz)对GABA介导的DRG神经元膜电位去极化反应均有抑制作用,10 Hz时抑制作用达到最大,反应幅值从17.00±3.39mV降至12.00±2.45mV(P<0.05).刺激频率增加,电刺激对GABA介导DRG神经元膜去极化反应抑制作用持续时间也逐渐延长,10 Hz时作用持续时间达到最长(>72 min).结论:电刺激可抑制DRG神经元膜GABA去极化反应,从而易化伤害性信息的传入,导致疼痛.     

噪声引起神经元动力学特征的改变

目的:研究噪声对阈下膜电位振荡和神经元放电的影响. 方法:在神经元的HH(Hodgkin-Huxley model, HH)计算机模型上,采用不同频率的正弦波波形刺激,观察神经元的膜电位变化;观察神经元阈下膜电位振荡和放电在不同噪声强度下的变化. 结果:神经元的膜电位在不同的频率刺激时不同,在低频和高频时小,在中间一段频率刺激时明显变大. 在噪声刺激的影响下,阈下膜电位振荡的发生时间明显提前,并且阈下膜电位振荡的幅度显著增加. 结论:神经元存在共振特性,对某一频率范围的刺激有更强的响应;噪声可以降低阈下膜电位振荡发生的膜电位水平,有利于神经元产生阈下膜电位振荡和放电,从而提高神经元的敏感性.     

树胶脂毒素对体外培养的背根神经节神经元的影响

目的 观察树胶脂毒素对体外培养大鼠脊神经背根神经节神经元的影响.方法 对Wistar胎鼠背根神经节神经元行原代培养,采用100 nmol/L浓度的树胶脂毒素对培养的神经元进行处理,运用MTT比色法和细胞形态学分析法,观察树胶脂毒素对神经元存活及形态的影响.结果 背根神经节神经元存活率降低,神经元呈簇状聚集明显,细胞轮廓增强,胞体缩小,突起断裂或变短甚至消失.结论 100 nmol/L浓度的树胶脂毒素对背根神经节神经元有损伤作用.     

一种适合膜片钳记录的成年大鼠背根神经节细胞培养方法

目的建立一种适合膜片钳研究的成年大鼠背根神经节（D0rsal root ganglion,DRG）细胞培养方法。方法分离并培养成年大鼠DRG神经元,显微镜下观察培养神经元的形态,膜片钳技术记录培养神经元的基本膜电生理特性及ATP激活电流。结果培养的DRG神经元形态结构完整;其静息膜电位在正常范围内,可记录到诱发动作电位及钠电流;在膜片钳全细胞记录模式下,能稳定地记录到ATP诱发电流。结论培养的成年大鼠DRG神经元适合膜片钳试验。     

糖尿病大鼠背根神经节神经元TTX-R钠离子通道电流变化及意义

目的:通过研究大鼠糖尿病神经病理性疼痛(DNP)中背根神经节(DRG)神经元TTX-R钠离子通道特征的变化,以探讨此疾病引起痛觉过敏可能的发生机制。方法:8只SD大鼠腹腔注射链尿佐菌素诱导制作糖尿病神经病理性疼痛模型(DNP组),取L5⁶DRG,贴壁消化法行神经元培养,电生理全细胞膜片钳记录离子通道电流;8只同月龄大鼠为正常对照。结果:大鼠糖尿病神经病理性疼痛小直径DRG神经元TTX-R INa电流密度较对照组增高。与对照组比较激活曲线向超极化移动3.9 mV(P<0.05),DNP组具有重复放电的神经元的比率增加。结论:大鼠糖尿病神经病理性疼痛小直径DRG神经元TTX-R钠通道电流的变化是痛觉过敏形成的原因之一。     

miR-340对背根神经节神经元兴奋性和钠通道电流的作用

目的：观察miR-340对小鼠背根神经节神经元兴奋性和电压依赖性钠通道电流的作用。方法：采用全细胞膜片钳技术记录神经元放电和钠通道电流。结果：在给予miR-340-3p前DRG神经元的膜静息电位为-49.50±4.76 mV,灌流miR-340-3p后膜的静息电位为-52.13±5.32 mV,差异无统计学意义（P＞0.05）,提示miR-340未影响神经元静息膜电位。在给予miR-340-3p前诱发动作电位数为1.8±0.75个,灌流miR-340-3p后诱发动作电位数为5.6±0.51个,差异具有统计学意义（P＜0.05）,提示miR-340可增高神经元诱发放电频率。电流-电压曲线表明在激活电压从-30 mV至0 mV时,miR-340-3p明显增加钠通道电流密度,差异具有统计学意义（P＜0.05）。激活曲线也表明,miR-340-3p使钠通道激活曲线左移,半激活电压从-22.6 mV增加至-27.4 mV。结论：miR-340对背根神经节神经元的兴奋作用可能是介导坐骨神经损伤神经病理性疼痛的机制之一。     

胰岛素样生长因子 1对背根神经节神经元谷氨酸损伤的保护作用

目的探测胰岛素样生长因子 1（IGF 1）对背根神经节（DRG）神经元谷氨酸（Glu）损伤的保护作用。方法Wistar胎鼠DRG神经元分散培养48?h后,用Glu（200?μmol/L）造成神经元损伤,并同时给予IGF 1（10?nmol/L）,观察添加IGF 1和未添加IGF 1孵育的Glu损伤的神经元的活细胞生长状况,并用流式细胞仪检测神经元的凋亡率,用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检测细胞内钙离子荧光强度。结果用IGF 1孵育的神经元生长状况良好,凋亡率、细胞内钙离子荧光强度均低于无IGF 1孵育的标本。结论IGF 1可通过减低钙离子内流,抑制细胞凋亡,从而对Glu损伤的DRG神经元产生保护作用。     

加巴喷丁对大鼠背根神经节神经元高电压激活钙电流的影响

目的 探讨加巴喷丁对正常大鼠与神经病理性痛大鼠不同损伤部位的背根神经节神经元高电压激活(HVA)钙电流的影响及其原因.方法 雄性SD大鼠,周龄4～6周,采用左侧L5脊神经结扎(SNL)术制备大鼠神经病理性痛模型.于结扎后第14天时采用酶消化法急性分离结扎侧L4背根神经节神经元(SNL-L4组)、L5背根神经节神经元(SNL-L5组),另取正常大鼠L4,5背根神经节神经元作为对照组.采用全细胞膜片钳技术记录加巴喷丁对3组神经元HVA钙电流的作用.结果 在10、100、300 μmol/L浓度下,加巴喷丁对SNL-L5组峰值钙电流的抑制率[(18.5±1.7)%、(32.0±2.6)%、(32.7±2.8)%]高于SNL-L4组[(16.0±1.9)%、(26.9±2.0)%、(27.4±2.3)%]和对照组(均P<0.05).加巴喷丁作用后,SNL-L5组钙通道稳态失活曲线向超级化方向移动幅度较其他两组明显.与其他两组比较,SNL-L5组加巴喷丁敏感性钙电流中N型钙电流比例升高(均P<0.05).结论 加巴喷丁对神经病理性痛大鼠L5背根神经节神经元HVA钙电流的抑制作用增强,其可能与神经损伤后钙通道激活特性的改变以及N型钙电流比例的升高有关.

Abstract：

Objective To compare the effects of gabapentin on high-voltage-activated calcium (HVA) current in dorsal root ganglion (DRG) neurons in normal and nerve-injured rats and understand the reasons of their differences. Methods Pathogen-free male SD rats(weight 180-220 mg)aged 4-6 weeks were used. The animals were anesthetized with intraperitoneal pentobarbital sodium 50 mg/kg. L5 spinal nerve was ligated between DRG and sciatic nerve and cut distal to the ligature. The animals were decapitated at Day 14 post-operation. L5 (SNL-L5 group) and L4 DRGs (SNL-L4 group) were respectively isolated and the ganglionic neurons enzymatically dissociated. The control group of rats was not operated. The lumbar DRG neurons of normal rats were treated similarly. The HVA-Ca2+ current was recorded by the technique of whole cell patch clamp. Results Compared with the SNL-L4 group [(16.0±1.9)%, (26.9±2.0)%, (27.4±2.3)%] and the control group, gabapentin inhibited the peak calcium current highlier at 10, 100 and 300 μmol/L in the SNL-L5 group [(18.5±1.7)%, (32.0±2.6)%, (32.7±2.8)%] (P<0.05). The steady-state inactivation curves shifted to more hyperpolarized potentials in the SNL-L5 group. The N-type relative contribution to the gabapentin-sensitive HVA-Ca2+ current was markedly elevated in the SNL-L5 group compared with that in other two groups (P<0.05). Conclusion Gabapentin enhances the inhibition of HVA-Ca2+ current in injured DRG neurons following spinal nerve ligation in rats. The alteration in the activation of electrophysiological properties and the increase of N-type relative contribution to the total HVA-Ca2+ current may be involved in the mechanism.     

丙戊酸钠对大鼠损伤背根节神经元异位自发放电的抑制作用

目的: 探讨丙戊酸钠(sodium valproate, VPA)对损伤背根节神经元异位自发放电的影响及其时间和剂量关系. 方法: 分离背根单纤维,引导来自损伤背根节(dorsal root ganglion, DRG)神经元的异位自发放电,观察不同浓度VPA对放电频率和放电模式的影响. 结果: VPA可抑制异位自发放电,降低其放电数,并具有剂量依赖关系. 结论: 局部应用VPA可抑制DRG神经元自发放电,这可为外周应用VPA进行镇痛治疗提供依据.     

GABAA受体α2亚基参与神经病理性痛

目的探讨GABAA受体α2亚基参与神经病理性痛的可能机制。方法分别运用全细胞膜片钳和免疫荧光技术观察坐骨神经压榨性损伤(CCI)模型手术侧、手术对侧及假手术组背根神经节(DRG)神经元GABAA受体特异性激动剂Muscimol激活电流幅度以及GABAA受体α2亚基表达。结果①CCI模型鼠热缩足反射潜伏期与假手术组或手术对侧组相比显著缩短(P<0.01)。②Muscimol在DRG上记录到3种典型的反应形式,均对特异性GABAA受体阻断剂Bicuculline敏感。③在3组DRG神经元上,Muscimo(l0.1～1 000.0μmol/L)引起浓度依赖的内向电流。假手术组、CCI模型鼠手术侧和对侧组DRG神经元上1 000μmol/L Muscimol引起内向电流幅度分别为(1 487.0±92.9)、(541.0±63.3)和(1 945.0±284.4)pA,组间比较差异有统计学意义,3组的EC50值差异无统计学意义。④GABAA受体α2亚基表达于DRG神经元膜上,CCI模型手术侧组DRG神经元GABAA受体α2亚基较假手术组表达减少,而手术对侧表达增强。结论神经病理性痛可能通过下调GABAA受体α2亚基的表达使GABA介导的突触前抑制作用减弱,易化伤害性信息的传入,产生痛觉敏化。     

Effect of acetylcholine on membrane potential in toad dorsal root ganglion neurons and its underlying ionic basis

Intracellular recordings were made to investigate the responses of membrane potential to acetylcholine (ACh) on neurons in isolated toad dorsal root ganglion (DRG). In the 73 neurons examined, 67 were of type A, and the remaining 6 of type C cell. The resting membrane potential of these two types of cells was −67.5±1.3 mV (× ±SE). During the application of ACh (4 × 10^-4–6 × 10^-4 mol/L), the changes in membrane potential were as follows: 1) hyperpolarization, with amplitude of 9.1±3.0 mV (X ± SE; n = 23); 2) depolarization, with amplitude of 12.9 ±2.2 mV (X ±SE; n = 20); 3) biphasic response, i.e., hyperpolarization with amplitude of 8.0±2.4 mV (X±SE) followed by depolarization with amplitude of 10.9±2.1 mV (X±SE) (n=24); no effect (n=6). The hyperpolarization induced by ACh was blocked by superfusion with atropine (1.3 × 10^-5 mol/L; n = 23), while ACh depolarization was blocked by the mixture of d-tubocurarine (1.4 × 10^-5 mol/L) and hexamethonium (1.4 ×10^-5 mol/L) (n = 18). When ACh caused hyperpolarization, the membrane conductance wascin reased by 13.8% and the reversal potential was about -96 mV (n=3). TEA (20 mmol/L) superfusion enhanced ACh depolarization amplitude by 48.2 ±3.2 % (× ± SE;n = 6), and depressed ACh hyperpolarization amplitude by 79.4 ±4.3 % (× ± SE; n= 8).MnCl₂ (4 mmol/l) superfusion decreased the amplitudes of ACh depolarization and hyperpolarization by 54.2 ±7.2 % (X ±SE; n= 5) and by 69.2±6.4 % (X±SE; n = 14) respectively. These results suggest that the depolarization and hyperpolarization induced by ACh are mediated by nicotinic and muscarinic receptors on the soma of toad DRG neurons separately, and it seems that ACh hyperpolarization involves activation of calcium-activated potassium conductance.     

褪黑激素对新生大鼠海马神经元延迟整流钾电流的影响

目的 用膜片钳技术观察褪黑激素对电压门控性延迟整流钾电流(Ik)的影响,探讨褪黑激素在中枢神经系统的作用机制及其生物学意义.方法 选择7～12 d原代培养的新生Wistar大鼠海马锥体神经元,用膜片钳电压钳全细胞记录模式观察Ik的基本电生理特点,并观察不同浓度褪黑激素,包括1、10、100 nmol/L、1、10、100 μmol/L和1 mmol/L对Ik的幅度及动力学特性的影响.结果 利用海马锥体神经元的钾电流对4-AP、TEA的敏感性及电生理特性的不同可分离出激活、失活缓慢,具有强烈外向整流特性的延迟整流钾电流.褪黑激素对海马锥体神经元Ik的影响是快速、可逆、呈电压依赖性的,但对其激活曲线没有影响.褪黑激素对Ik的作用具有浓度依赖性.1～100nmoI/L的褪黑激素可逐渐递增地增加Ik幅度;1～100 μmol/L褪黑激素对Ik的增加程度随浓度增加而增大,而1 mmol/L褪黑激素的增加程度却减小.结论 褪黑激素可逆地增强体外培养新生大鼠海马神经元的Ik电流,这或许参与了神经元损伤和记忆损害的某些环节.