吲哚美辛和hTERT-siRNA对胆囊癌细胞的作用

目的研究吲哚美辛和hTERT-siRNA对胆囊癌细胞株GBC-SD的端粒酶活性、细胞增殖、运动的抑制作用;并试从β-catenin／hTERT信号转导途径揭示其分子机制。方法采用端粒酶TRAP、半定量RT-PCR和Western Blot印迹方法检测GBC-SD端粒酶活性、hTERT基因和β-catenin基因mRNA、蛋白质表达水平。四甲基偶氮唑盐（MTT）光吸收法检测琥珀酸脱氢酶（SDH）活性并做细胞增殖计数、运用Transwell小室和划线了解癌细胞侵袭与运动情况。结果质粒pGCsi-H1／GFP-hTERT转染GBC-SD细胞6～24h再加入吲哚美辛后对GBC-SD细胞的端粒酶、SDH活性、细胞增殖、运动、侵袭力均具有很明显的抑制作用,分别同阴性对照pGC-si-H1／NEGative联合吲哚美辛组、单用吲哚美辛组进行比较,差异有显著性（P〈0．01）。pGCsi-H1／GFP-hTERT作用于GBC-SD细胞24h再加入吲哚美辛,检测hTERT mRNA和hTERT蛋白表达,分别与pGCsi-H1／NEGative联合吲哚美辛组、单用吲哚美辛组进行比较,差异有显著性（P〈0．01）。pGCsi-H1／GFP-hTERT作用于GBC-SD细胞24h再加入吲哚美辛,检测β-catenin mRNA和p-catenin蛋白表达．分别与pGCsi-H1／NEGative联合吲哚美辛组、单用吲哚美辛组进行比较,无明显差异（P〉0．05）。结论吲哚美辛可增强hTERT-siRNA抑制GBC-SD细胞端粒酶、SDH的活性,及其增殖、运动、侵袭力,降低hTERTmRNA和hTERT蛋白表达,其机制与β-catenin／hTERT信号转导途径受抑存在一定联系。     

hTERT和β-catenin在胆囊癌中的表达及其临床意义

目的检测hTERT和β-catenin在胆囊癌中的表达情况,分析其与临床病理特征及病人生存期之间的关系.方法收集正常及炎性胆囊、胆囊癌非相关息肉、胆囊癌相关息肉和胆囊癌各20、19、16、82例.用免疫组化方法分别检测hTERT、β-catenin蛋白表达.结果①hTERT在正常及炎性胆囊、胆囊癌非相关息肉、胆囊癌相关息肉和胆囊癌中阳性率分别为0、5.3%、37.5%、84.1%,后两组hTERT表达率显著高于前两组（P＜0.05）,胆囊癌组hTERT表达率亦显著高于第3组（P＜0.001）.β-catenin在正常及炎性胆囊、胆囊癌非相关息肉、胆囊癌相关息肉和胆囊癌中异位表达率分别为5.0%、10.5%、50.0%、51.2%.后两组β-catenin表达率显著高于前两组（P＜0.05）.②hTERT在T1＋T2、T3＋T4和淋巴结阳性、阴性组中的表达率分别为72.7%、92.8%（P＜0.05）和93.6%、71.4%（P＜0.05）,差异有显著性.hTERT表达水平与胆囊癌分化程度、浸润深度、淋巴结有无转移的相关系数分别为0.5、0.4、-0.5（P＜0.01）.β-catenin在T1＋T2、T3＋T4和淋巴结阳性、阴性组中异位表达率分别为33.3%、63.3%（P＜0.01）和57.4%、42.9%（P＜0.05）,差异有显著性.③胆囊癌hTERT阴性、阳性表达累积生存率分别为22.8%、5.9%（P＜0.05）.胆囊癌异位β-catenin阴性、阳性表达累积生存率分别为17.1%、5.7%（P＜0.05）.④胆囊癌hTERT蛋白与β-catenin异位蛋白表达呈正相关（r=0.311,P＜0.05）.结论hTERT和β-catenin蛋白异位表达与胆囊的恶性病变密切相关.hTERT表达与胆囊癌相关息肉及其恶性转化有关.hTERT和β-catenin蛋白与肿瘤不良预后有关.β-catenin异位表达增加与胆囊癌hTERT表达增强相关联.     

联合RNA干扰TR及TERT对膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株端粒酶活性及其增殖的影响

目的 探索联合RNA干扰TR及TERT[小型干扰RNA(siRNA)、人端粒酶RNA(hTR)及人端粒酶逆转录酶(hTERT)]基因对膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87端粒酶活性及其增殖的影响.方法 根据hTRmRNA和hTERTmRNA的序列,分别设计合成3对不同的且能干扰TR和TERT基因表达的siRNA并筛选出最高效抑制序列(pRNAT-TR-Ⅲ、pRNAT-TERT-Ⅲ),构建以hTR、hTERT基因为靶点的联合RNA干扰装置pRNAT-TR-Ⅲ、pRNAT-TERT-Ⅲ(脂质体法)并将其转染BIU-87细胞株,采用荧光定量PCR分析hTR及hTERT mRNA表达,TRAP-ELISA检测端粒酶活性,MTT法检测细胞增殖.结果 分别及联合RNA干扰hTR及hTERT基因后,pRNAT-TERT-Ⅲ,pRNAT-TR-Ⅲ及pRNAT-TERT-Ⅲ、pRNAT-TR-Ⅲ的联合干扰可以特异性抑制BIU-87细胞株中TERT和TR表达(分别减少pRNAT-TERT-Ⅲ TERTmRNA:67%、pRNAT-TR-Ⅲ TRmRNA:41%、pRNAT-TERT-Ⅲ、pRNAT-TR-Ⅲ TRmRNA:57%、pRNAT-TERT-Ⅲ、pRNAT-TR-Ⅲ TERTmRNA:70%.P＜0.05).且膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87的生长和端粒酶活性均明显受到抑制,以联合RNA干扰尤为明显(pRNAT-TERT-Ⅲ:1.80±0.014,pRNAT-TR-Ⅲ:1.95±0.016,pRNAT-TERT-Ⅲ、pRNAT-TR-Ⅲ:1.25±0.012,P＜0.05).结论 联合RNA干扰hTERT及hTR基因能更明显抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长,为其临床应用奠定了基础.     

RNA干扰抑制骨肉瘤MG-63细胞β-catenin的表达

目的通过抑制Wnt信号通路核心蛋白β-catenin在骨肉瘤细胞系MG-63中的表达,探讨β-catenin对MG-63细胞的生长、细胞侵袭性以及耐药性等方面的作用。方法设计合成β-catenin的si RNA序列,LipofectamineTM2000转染入MG-63细胞。用RT-PCR和Western blot法检测干扰后β-catenin的mRNA和蛋白表达情况,利用流式细胞仪检测细胞周期,Transwell法检测细胞侵袭能力,CCK-8法检测细胞增殖,利用阿霉素检测细胞耐药性。结果干扰后,实验组细胞的β-catenin mRNA和蛋白表达较对照组和空白组显著降低(均P<0.05);细胞周期检测实验组与对照组和空白组比较差异无统计学意义(P>0.05);Transwell法结果显示实验组细胞侵袭能力较对照组和空白组显著下降(均P<0.05);CCK-8法检测显示实验组细胞增殖力较对照组和空白组略有降低,但差异无统计学意义(均P>0.05);多柔比星敏感性检测显示实验组较对照组和空白组细胞生长抑制率显著增加(均P<0.05)。结论特异性抑制β-catenin基因表达可抑制骨肉瘤MG-63细胞的侵袭能力,并...     

hTERT-RNAi表达载体抑制子宫内膜癌细胞生长研究

目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)的RNA干扰表达载体pSilencer-hTERT对子宫内膜癌Ishikawa-3-H-12细胞生长的抑制作用。方法:将pSilencer-hTERT转染人子宫内膜癌Ishikawa-3-H-12细胞,24、48、72、120、144 h后分别采用蛋白印迹技术检测hTERT蛋白表达,MTT法检测细胞增殖,原位末端标记法检测细胞凋亡。结果:pSi-lencer-hTERT转染后48 h Ishikawa-3-H-12细胞mRNA表达36.2%±3.4%、蛋白表达44.2%±4.1%降低最明显,与空质粒对照组96.5%±2.2%、98.3%±2.0%比较差异有统计学意义(P<0.01)。pSilencer-hTERT处理后48 h细胞增殖抑制率70.8%±4.1%最高,72 h凋亡细胞阳性率69.3%±4.7%最高,与空质粒对照组8.2%±1.5%、7.4%±2.2%比较差异有统计学意义(P<0.01)。pSilencer-hTERT的这些作用可持续144 h。结论:pSilencer-hTERT能有效、持续抑制人子宫内膜癌Ishikawa-3-H-12细胞生长,可望成为其基因治疗的有效工具。     

胆囊癌组织端粒酶活性的检测及其意义

目的: 探讨胆囊癌组织中端粒酶活性表达及意义。方法: 采用TRAP-PAGE-银染法检测22例胆囊癌及28例慢性胆囊炎新鲜组织中端粒酶活性。结果: 28例慢性胆囊炎组织中,无端粒酶活性阳性表达;22例胆囊癌组织中,端粒酶活性表达阳性者18例,阳性率为81.8%,两者差异有显著性(P<0.005)。端粒酶活性表达与胆囊癌的分化程度及淋巴结转移均无关(P>0.05)。结论: 检测端粒酶活性对胆囊癌诊断有一定参考价值。     

RNAi沉默Polo-like kinase-1基因表达对大肠癌细胞端粒酶活性的影响

 目的 探讨polo-like kinase-1（PLK1）基因对大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的影响。 方法根据PLK1基因序列特点,设计并用化学方法合成小干扰核糖核酸分子（small interfering RNA,siRNA）,转染人大肠癌SW480细胞后,分别采用实时定量PCR和Western blot检测PLK1基因mRNA和蛋白表达水平。分别采用MTT法和TRAP-ELISA方法检测PLK1基因转染对大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的影响。 结果 所设计的5个siRNA均能明显抑制大肠癌SW480细胞PLK1 mRNA水平,以P4效果最好。以P4转染处理大肠癌细胞后,PLK1 mRNA水平和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性。MTT和TRAP-ELISA方法检测发现,P4siRNA转染组细胞增殖和端粒酶活性明显受到抑制,且呈浓度和时间依赖性（P＜0.05,P＜0.05）。 结论 PLK1基因对大肠癌细胞增殖具有重要的调控作用,以PLK1 siRNA转染处理大肠癌细胞,可明显抑制大肠癌细胞的恶性增殖,其机制可能与抑制端粒酶活性有关。     

平阳霉素对人舌癌Tca8113细胞凋亡和端粒酶活性的影响

目的 探讨平阳霉素(PYM)处理人舌癌Tca8113细胞前后细胞增殖活性和凋亡以及人类端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白表达和端粒酶活性的改变，进一步揭示平阳霉素的抗癌机理并初步探讨端粒酶作为化疗敏感性指标的可行性。方法 以1／2血药峰值浓度的平阳霉素处理人舌癌Tca8113细胞12～72h，应用MTT法检测细胞增殖活性，光镜观察细胞凋亡变化特征并计算凋亡指数，用间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白含量，同时行TRAP-PCR-ELIsA端粒酶活性检测。结果 Tca8113细胞在平阳霉素作用后，细胞增殖活性明显下降；出现明显的凋亡；hTERT蛋白表达下降的同时端粒酶活性也相应下降，而且四者都有一定的时间依赖性。结论 平阳霉素可使细胞增殖活性明显下降，诱导凋亡产生，下调hTERT蛋白表达及抑制端粒酶活性，且这四者有一定的相关性。     

RNA干扰对膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株端粒酶活性及其增殖的影响

目的 探讨针对人端粒酶RNA(hTR) 及其催化亚基(hTERT) 的小干扰RNA (siRNA) 对膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87端粒酶活性及其增殖的影响. 方法 根据人TR mRNA和TERT mRNA的序列,分别设计合成3对不同的且能干扰TR和TERT基因表达的siRNA(TR-siRNA, TERT-siRNA),通过脂质体法将其转染膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株,采用荧光定量PCR分析TR、TERT mRNA 表达,TRAP-ELISA检测端粒酶活性,MTT 法检测细胞增殖. 结果 3对TERT-siRNA和3对TR-siRNA中,pRNAT-TERT-Ⅲ和pRNAT-TR-Ⅲ可以特异性抑制BIU-87细胞株中TERT和TR表达(分别减少67%和41%,P<0.05),且BIU-87细胞株的生长和端粒酶活性明显受到抑制. 结论 TR-siRNA和TERT-siRNA能特异且高效阻断各自基因表达,降低端粒酶活性,进而抑制BIU-87细胞的增殖.     

RNA干扰Heparanase基因表达对胆囊癌侵袭性影响的体外研究

目的:利用RNA干扰技术沉默人胆囊癌GBC-SD细胞中乙酰肝素酶(heparanase,HPA)基因的表达,探讨抑制HPA基因后对GBC-SD细胞侵袭性的影响.方法:构建靶向人HPA基因miRNA重组质粒,采用脂质体转染法将质粒转染入人胆囊癌GBC-SD细胞,RT-PCR检测转染前后HPA mRNA表达情况,选出对HP...     

hTERT转染神经干细胞端粒酶活性及hTERT mRNA检测

目的以逆转录病毒PLXSN为载体,将hTERT基因转染入体外培养的人神经干细胞,检测神经干细胞端粒酶活性及hTERT mRNA表达情况,为建立永生化神经干细胞系提供一种新的思路.方法体外扩增人神经干细胞及基因转染后,应用PCR-ELISA法检测神经干细胞端粒酶活性,荧光定量PCR法检测hTERT mRNA表达情况.结果通过逆转录病毒介导的hTERT基因转染人神经干细胞后,端粒酶活性明显升高,持续表达,hTERT mRNA也早期呈高水平表达,但继之下降,维持在一个较低水平.结论转染hTERT基因后的神经干细胞具有表达高水平端粒酶活性,并稳定表达,这为建立基因工程的永生化神经干细胞系奠定了基础.而hTERT mRNA则逐渐下降,并维持在一个较低水平,不能作为检测神经干细胞增殖和分化能力的指标.     

hTERT反义寡核苷酸对宫颈癌Hela细胞体外增殖的影响

目的观察人类端粒酶催化亚基(hTERT)反义寡核苷酸(ASODN)对Hela细胞增殖和细胞周期的影响。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测ASODN对Hela细胞增值能力及细胞生长的影响，用流式细胞仪检测细胞周期和细胞增殖指数。结果不同浓度的ASODN转染细胞后，均不同程度地影响细胞的生长。ASODN作用细胞后，使细胞周期发生变化，表现为G0／G1期细胞增多，S期细胞减少，细胞增殖指数下降。结论以hTERT基因为靶点的反义寡核苷酸能抑制Hela细胞的体外生长，使细胞阻滞于G0／G1期。     

PTENp53及hTERT在I型子宫内膜癌中的表达

目的：探讨PTEN、p53及hTERT在I型子宫内膜癌中的表达,为子宫内膜癌的早期诊断和治疗提供理论依据。方法：应用免疫组织化学SABC法同步检测49例子宫内膜癌中的p53、PTEN、hTERT的表达,取同期49例正常的子宫内膜组织做对照,数据采用SPSSl3．0软件处理,计数资料进行x检验,等级资料进行秩和检验。结果：PTEN蛋白在子宫内膜癌中阳性表达率为40．8％,低于正常子宫内膜组97．9％,且阳性表达与子宫内膜癌的组织分级、FIGO分期、淋巴转移、肌层浸润深度呈负相关;相反,hTERT和p53两种蛋白在子宫内膜癌组阳性表达率（67．3％、38．8％）均高于正常子宫内膜组,并子宫内膜癌恶性程度及FIGO分期呈正相关。结论：与正常子宫内膜相比,PTEN在子宫内膜癌中表达减少,而P53及hTERT呈表达升高,三者均可作为子宫内膜诊断及判定预后的标记物。     

CD151基因对前列腺癌细胞增殖、转移的促进作用及其机制

目的研究人前列腺癌细胞株PC3细胞转染CD151基因后其增殖和迁移能力的变化及机制。方法用FuGENE HD分别将质粒pAAV-CD151(CD151组)、pAAV-GFP(GFP组)转染入PC3细胞,并设加入等体积PBS的对照组。48 h后采用Western blot检测CD151蛋白、磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK)和总ERK的表达。采用MTT法检测CD151基因对PC3细胞增殖的影响,采用Boyden趋化小室研究CD151基因对PC3细胞迁移的影响。结果与对照组和GFP组相比,CD151组的CD151蛋白表达水平明显增加(均P<0.05);磷酸化ERK的表达量亦明显高于其它两组;细胞增殖能力比对照组和GFP组明显增高[相对吸光度值分别为:(0.245 7±0.006 4)vs(0.175 2±0.007 4)、(0.179 0±0.008 4)];细胞迁移数(107.8±9.6)亦显著高于对照组和GFP组[(53.0±7.6)和(57.0±5.2),P<0.05]。结论 CD151在前列腺癌细胞的增殖、转移中起着重要作用,是肿瘤转移的重要分子基础,其分子机制可能是CD151对ERK信号通路的激活。     

反义hTERT在体外对HL-60细胞的抑制作用

[目的 ]探讨反义hTERT表达质粒是否能够抑制HL - 6 0细胞增殖能力及端粒酶活性。 [方法 ]通过脂质体法将反义hTERT表达质粒导入HL - 6 0细胞中 ;以G4 18进行筛选得到阳性克隆 ;以MTT法和体外集落形成实验检测反义hTERT表达质粒对HL - 6 0细胞增殖的抑制作用 ;以TRAP -PCRELISA法来研究反义hTERT对HL - 6 0细胞的端粒酶活性的抑制作用。 [结果 ]转染反义hTERT表达质粒组与空白对照及空质粒组相比 ,细胞增生速度明显较慢 ,克隆形成能力明显下降 (P <0 .0 1) ;反义hTERT对HL - 6 0细胞的端粒酶活性具有明显的抑制作用。 [结论 ]本研究构建的端粒酶反义hTERT表达质粒能够抑制HL - 6 0细胞的体外增殖能力及其端粒酶活性。     

藏红花素对CNE2细胞的增殖及迁移抑制作用

目的探讨藏红花素(crocin)对人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的增殖和迁移抑制作用及其可能的作用机制。方法使用高倍显微镜观察不同浓度crocin作用后的细胞形态变化,CCK-8法测定细胞增殖能力的改变,Transwell小室实验分析细胞迁移能力变化,RT-PCR技术测定bi-1基因mRNA表达变化。结果藏红花素作用于CNE2细胞24h后,可抑制其增殖和迁移能力,且呈剂量依赖关系,但当药物浓度超过0.8 mmol/L时,细胞形态发生明显改变,细胞死亡增加。RT-PCR结果显示,不同浓度的藏红花素作用于CNE2细胞24h后,bi-1基因的mRNA表达明显下调。结论藏红花素对CNE2细胞有增殖和迁移抑制作用,并可影响抗凋亡基因bi-1的表达,其机制可能是通过调控bi-1基因的表达实现的。