人源化Fab段噬菌体抗体库的构建

目的构建人源化Fab噬菌体抗体基因库。方法利用反转录PCR和PCR技术从B细胞淋巴瘤患者外周血淋巴细胞中扩增人IgG抗体重链Fd基因及κ、λ轻链基因,将之克隆入噬菌体载体pComb3,构建人源性Fab噬菌体抗体库,并进行鉴定。结果构建完成了库容量为6.0×108的噬菌体抗体库。结论成功地构建了人源化噬菌体抗体库,为下一步抗CD20抗体的筛选和表达奠定了基础。     

人源天然Fab噬菌体抗体库的构建及抗c-Met抗体的筛选?鉴定

目的:构建大容量人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗c-Met特异性抗体并进行初步鉴定.方法:采集20位健康成人的骨髓淋巴细胞.用PCR扩增人Fab片断抗体基因,插入载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab抗体库.以固相化的抗原对抗体库进行6轮筛选后,随机挑选60个克隆用Phage ELISA、BstO I酶切片断分析进行检测,阳性克隆作可溶性表达和鉴定.结果:构建的Fab噬菌体抗体库的库容为1.2×109,从中筛选到1株与c-Met特异性结合的人源抗体克隆,命名为AM2-26.DNA序列分析证明为人免疫球蛋白可变区基因,Western blot证实为人源抗c-Met Fab抗体片段,ELISA特异性鉴定阳性.结论:构建了大容量人源天然Fab抗体库,从中获得1株抗c-Met人源Fab抗体片段,有望为抗肿瘤药物的研制提供新的候选分子.     

抗人胃癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现文库的构建,初步筛？…

构建抗人胃癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现文库。方法；利用噬菌体表面呈现技术，构建基因文库，经过ｐａｎｎｉｎｇ筛选富集后，用ＥＬＩＳＡ方法检测抗原结合活性，结果：从９４个单个噬菌体克隆中一次筛选到１８个具有抗原结合活性的阳性克隆。     

噬菌体表面展示文库筛选人干细胞因子模拟肽

目的 用噬菌体表面展示文库筛选具有人干细胞因子(hSCF)生物学活性的模拟肽.方法 采用酶联免疫吸附测定法(EUSA)从噬菌体环七肽库和十二肽库筛选与重组hSCF受体(rc-kit/Ig1-3)有较高亲和力的噬菌体克隆,提取噬菌体单链DNA进行序列测定,根据序列测定结果合成阳性小肽,四甲基偶氮噻唑盐(MTT)法检测合成小肽刺激UT-7细胞增殖的活性.结果 经3轮筛选获得11个来源于环七肽库和8个来源于十二肽库与rc-kit/Ig1-3结合活性较高的噬菌体克隆,DNA测序结果显示环七肽库筛选到1个共有序列DPSSPHTH,十二肽库没有筛选到共有序列.序列比对分析显示,这些小肽与hSCF没有同源序列.MTT法测定结果表明,合成的4个小肽均能促进UT-7细胞增殖,其中CE16和LE20刺激效果明显.结论 获得4个具有较高hSCF生物学活性的模拟肽.     

抗人胃癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现文库的构建、初步筛选及鉴定

目的：构建抗人胃癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现文库．方法：利用噬菌体表面呈现技术，构建基因文库，经过ｐａｎｎｉｎｇ筛选富集后，用ＥＬＩＳＡ方法检测抗原结合活性．结果：从９４个单个噬菌体克隆中一次筛选到１８个具有抗原结合活性的阳性克隆．结论：我们所应用的方法为抗肿瘤基因工程抗体的制备提供了一条更为有效的新途径，同时为今后胃癌显像诊断和治疗的基础及临床研究奠定了基础     

从噬菌体抗体库中筛选D二聚体特异的Fab抗体

目的:从人源性噬菌体抗体库中筛选抗人D二聚体单克隆抗体并进行可溶性表达。方法:以人D二聚体标准品为抗原对所构建的噬菌体抗体库进行两轮“吸附-洗脱-扩增”筛选,从中筛选出抗人D二聚体的噬菌体Fab抗体,并在大肠杆菌细胞中进行可溶性表达。结果:经4次电转化构建了库容为2. 8×108cfu的抗体库,滴度为4. 1×1014PFU/mL,Fab基因重组率为46%。经过淘筛后携带抗人D二聚体抗体的特异性噬菌体得到了明显的富集。用试剂盒以ELISA法检测对人D二聚体的结合活性,得到抗人D二聚体单克隆抗体。筛选出的阳性克隆成功在大肠杆菌细胞中可溶性表达筛选出的阳性克隆在大肠杆菌细胞中可溶性表达。结论:人D二聚体标准品对抗体库的淘筛,富集了表面呈现抗人D二聚体的单克隆抗体的噬菌体,成功构建了人源性抗D二聚体噬菌体抗体,并成功在大肠杆菌细胞中可溶性表达。     

利用噬菌体表面展示技术构建人肝癌细胞的cDNA表达文库

目的:筛选对人肝再生增强因子(hALR)高反应性的肝癌细胞株,以此作为细胞来源,利用噬菌体展示技术构建出含有其cDNA表达文库,为进一步从文库中筛选hALR相互作用蛋白奠定基础.方法:hALR刺激不同肝癌细胞株,从中筛选出对hALR刺激有高反应性的细胞株.以Poly ATtract System1000提取mRNA,用T7Select10-3 Orient Express cDNA CloningSystem和Random Primer构建它的cDNA噬菌体表面展示文库;以噬菌体滴度分析和PCR评价文库质量.结果:hALR对不同肝癌细胞株均有不同程度的促增殖作用,且呈明显的剂量依赖关系.对QGY促增殖作用最强,以它作为建库细胞.对所建文库进行噬菌体滴度分析,表明原始cDNA文库含有2×107独立的重组子;随机挑取重组子进行PCR鉴定,发现插入长度在0.2～2kb,平均为0.6kb,能够较好地代表来源细胞中mRNA所表达的几乎所有信息.结论:hALR对所检测的肝癌细胞株均有促增殖作用;QGY细胞对hALR刺激有最高的反应性;以它为基础,构建出库容量为2×107的高质量噬菌体表面展示文库.     

噬菌体展示技术构建重组人TNF-α单链抗体库

目的 应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)的单链抗体库.方法 利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经免疫BALB/c小鼠淋巴细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库.由Linker-primer mix经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体.再用RS primer mix以单链抗体为模板进行第二次聚合酶链反应,从而获得全套抗rhTNF-α的单链抗体基因.以SfiⅠ/NotⅠ,位点定向插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,转化大肠杆菌TG1后,经M13KO7辅助噬菌体拯救,构建成全套抗rhTNF-α单链抗体表面展示文库.结果 成功构建了rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库.经M13KO7超感染后,噬斑计数滴度为2.1×1011 pfu.结论 rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建,为研究rhTNF-α抗体结合位点,了解其结构与功能的关系以及研究用于临床免疫治疗的新型抗体打下了基础.     

噬菌体展示技术构建重组人TNF-α单链抗体库

目的应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)的单链抗体库。方法利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经免疫BALB/c小鼠淋巴细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库。由L inker-prim erm ix经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体。再用RS prim erm ix以单链抗体为模板进行第二次聚合酶链反应,从而获得全套抗rhTNF-α的单链抗体基因。以SfiⅠ/NotⅠ,位点定向插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,转化大肠杆菌TG1后,经M13KO7辅助噬菌体拯救,构建成全套抗rhTNF-α单链抗体表面展示文库。结果成功构建了rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库。经M13KO7超感染后,噬斑计数滴度为2.1×1011pfu。结论rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建,为研究rhTNF-α抗体结合位点,了解其结构与功能的关系以及研究用于临床免疫治疗的新型抗体打下了基础。     

人源性大肠癌抗原基因噬菌体表达文库的构建及鉴定

目的构建人源性大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库。方法从人大肠癌组织中提取总RNA,用RT-PCR合成cDNA第1链,用LD-PCR合成cDNA第2链,除去小于500 bp的小片段,与去磷酸化的λTriplEx2噬菌体左、右臂连接,体外包装,构建成cDNA噬菌体表达文库。转化E.coliXL1-Blue感受态细胞,滴定文库的滴度,确定文库容量大小;用ITPG诱导和X-gal显色测定重组率;用SfiⅠ酶切鉴定插入的cDNA片段大小。结果构建成含2.39×106 pfu/ml重组噬菌体的人大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库,重组率为97.5%,插入cDNA片段大小范围从600~4 000 bp,平均长约1 400 bp。结论成功构建高质量人源性大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库,适合于大批量筛选cDNA克隆的大肠癌相关抗原基因。     

噬菌体抗体库几种筛选方法的比较

目的：对多种不同的噬菌体抗体库筛选方法进行比较研究。方法：应用抗原固相化吸附筛选法,生物素化抗原液相筛选法和解离速率筛选法对半合成噬菌体抗体库或轻链替换库进行抗角蛋白噬菌体抗体的筛选,比较各自的筛选效率和优缺点。结果：3种方法筛选抗角蛋白抗体均获成功,抗原固相化吸附筛选法效果可靠,所获抗体特异性高但抗原消耗量大,生物素化抗原液相筛选法方法敏感且节省抗原,可以根据实验目的和抗体库性质灵活调节筛选体系,其不足是筛选获得的克隆中容易出现非特异性结合的克隆,而解离速率选是选择性获得高亲和力抗体的有效手段,结论：不同的筛选策略各具优势,在实际应用中可根据不同的实验目的选择相应的筛选方法。     

钠泵抑制物噬菌体单链抗体库的构建

目的　应用噬菌体展示技术构建钠泵抑制物单链抗体库 .方法　用 OUA- OVA(ouabain- ovalbumin)免疫小鼠 ,取脾脏 ,分离淋巴细胞 ,提取 m RNA,逆转录成 c DNA第一链 ,用简并引物经 PCR分别扩增轻、重链抗体库 ,经重叠延伸PCR由 L inker将轻、重链拼接成 Sc Fv(单链抗体 ) ,用 RS引物以 Sc Fv为模板进行第 2次 PCR,同时在 5 及 3 端分别加上 Sfi I,N ot I酶切位点 .经 Sfi I,N ot I酶切后 ,在 T4连接酶的作用下将 Sc Fv与 p CANTAB 5 E噬菌粒连接 ,电转化进入TG1大肠杆菌 ,挑取 12个单菌落提取质粒用 Eco R 和 H ind 进行酶切鉴定 ,后经 M13KO7辅助噬菌体拯救 ,离心收集上清即为全套 Sc Fv基因的噬菌体表面展示文库 .结果　以OU A- OVA免疫小鼠 ,检测血清中抗体效价可达 (1∶ 2×10 6 ) ,用通用引物分别扩增出轻、重链片段的大小为 32 5 bp和 34 0 bp,将两者拼接得到约 72 0 bp大小的单链抗体库 ,以8× 10 1 1 的转化效率转染 TG1细胞 ,Eco R 和 H ind 酶切后 ,12个单菌落所提噬菌粒 DNA中有 10个切出了约为 2 .1kb的目的条带 ,所构建的噬菌体抗体库库容量约为 1.2× 10 8.经 M13KO7超感染后 ,测噬斑滴度为 9× 10 1 4 pfu· L- 1 .结论　成功地构建了钠泵抑制物噬菌体单链抗体库 .     

抗人卵巢癌单链抗体噬菌体表面呈现文库的构建、初步筛选及鉴定

目的：构建抗人卵巢癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现库。方法：利用噬菌体表面呈现技术，构建基因库。经过panning筛选富集后，用ELISA方法检验抗原结合活性。结果：从单个噬菌体克隆中筛选到26个具有抗原结合活性的阳性克隆。结论：噬菌体表面呈现技术为构建抗人卵巢癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现库提供了一条更为有效的新途径。     

大肠癌抗原cDNA噬菌体表达库的构建及鉴定

目的 :构建人源性大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 .方法 :从人大肠癌组织中提取总RNA ,纯化mRNA ,用RT PCR反转录合成cDNA第一链 ,用LD PCR合成cDNA第二链 ,除去小于 5 0 0bp的小片段 ,与去磷酸化的λTriplEx2噬菌体连接 ,体外包装 .转染E .coliXL1 Blue大肠杆菌 ,滴定文库的滴度 ,确定文库容量大小 ,用ITPG和X gal测定重组率 .用SfiⅠ酶切鉴定插入的cDNA片段大小 .结果 :构建成含 2 .39× 10 6重组子的人大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 ,重组率为 97.5 % ,插入外源cDNA片段大小范围从 1～ 4kb ,平均长约 2 .4kb .结论 :成功构建人大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 ,适合于大批量筛选cDNA克隆的大肠癌相关抗原基因     

噬菌体抗体库的构建及抗肝癌抗体的筛选

目的　构建噬菌体抗体库及筛选抗人肝癌特异性噬菌体抗体。　方法　以ＲＴ－ＰＣＲ法从经Ｂｅｌ７４０４细胞免疫的ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠脾淋巴细胞扩增免疫球蛋白的Ｆｄ 段及к链基因,克隆到表达载体ｐＣＯＭＢ３Ｈ－ＳＳ中并将抗体Ｆａｂ 段表达于单链噬菌体表面,构建噬菌体抗体库;以Ｂｅｌ７４０４细胞为抗原对噬菌体抗体库进行４轮“吸附－洗脱－扩增”的亲和筛选,挑取部分克隆检测与抗原的结合活性。　结果　建成容量为２×１０６ＣＦＵ 的噬菌体抗体库,在亲和筛选过程中,噬菌体收获率逐轮得到提高,第４轮为第一轮的２４５ 倍,含Ｆａｂ 基因的克隆比率也由２６％ 增到８３％ ,挑取的１０ 个克隆中有８ 个与Ｂｅｌ７４０４细胞有结合活性。　结论　噬菌体抗体库技术系高效筛选体系,为肿瘤单克隆抗体的制备提供了有效的途径     

人胃癌组织基因组文库的构建

为了分离和研究人胃癌致癌基因的结构及调控。方法：我们以ｃ－ｃｙｃ癌基因扩增为指标，通过打点杂交从四对人胃癌组织及其癌旁正常组织中挑选出１例差异明显的人胃鳞状细胞癌组织。提取其基因组ＤＮＡ，经Ｓａｕ３Ａ部分酶解后回收１５～２０ｋｂ的插入片段。用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将段与λ噬菌体ＥＭＢＬ４载体臂进行重组。结果：经外包装构建了人胃癌组织基因组库。经滴度测定，库容量为１．１×１０＾６重组噬菌体。克隆效率为２     

从噬菌体随机十二肽库中筛选乙酰胆碱酯酶的抑制肽

目的从随机肽库中筛选乙酰胆碱酯酶（ACHE）的抑制性多肽。方法以人AChE作为靶标，应用噬菌体随机12肽库进行筛选，经过3轮筛选，对阳性克隆进行测序并进行序列分析及抑酶活性测定。结果筛选得到6个能与人AChE较强结合的噬菌体克隆，其中有4个克隆可以抑制AChE的酶活性，其保守序列为W（S／P）HY。结论通过噬菌体肽库技术能够筛选到抑制人AChE活性的多肽，为进一步研究AChE的多肽抑制剂奠定了基础。     

正常人天然IgG抗体噬菌体呈现库的构建

目的 建立一个正常人天然ＩｇＧ抗体委员长 菌体呈现库。方法：从一献血员取５０ｍＬ新鲜血液,分离淋巴细胞。提取ＲＮＡ,逆转录合成ｃＤＮＡＰＣＲ扩增重链Ｆｄ和轻链ｃＤＮＡ,依次将ＰＣＲ产物插入载体ｐＣｏｍｂ３Ｈ相应位点。以点印迹检测噬菌体表面Ｆａｂ的表达,结果 所有４个ＩｇＧ亚类的重链Ｆｄ片段、部分κ轻链和λ轻链ｃＤＮＡ得到扩增。先期插入的重链Ｆｄ的实际库容达１．１×１０＾６,插入率２０％。后期插入的     

人源性大肠癌自然致敏噬菌体抗体Fab呈现库的构建与筛选

目的 构建大肠癌病人自然致敏淋巴结抗体Ｆab段噬菌体呈现库,初步筛选相关抗大肠癌抗体。方法取大肠癌病 人转移淋巴结,提取淋巴结总ＲＮＡ,逆转录ＰＣＲ扩增重链Ｆｄ和Ｋ轻链ｃＤＮＡ。依次将ＰＣＲ产物插入载体pＣomb３的 相应部位,构建人源性大肠癌噬菌体Ｆab基因库,并应用噬菌体表面呈现技术对该抗体库进行淘选及鉴定。结果所选 ２种Ig亚类的重链 Ｆd片段、２种κ轻链cＤＮＡ得到扩增。 Ｆd片段和κ轻链均插入pＣomb３的重组率为４０％,Ｆab噬菌 体表达库容达１．４８×１０６。经３轮淘选,抗体库得到约１２０倍的富集。３轮抗体库的点印记免疫染色均显示有Ｆab表达;酶 联免疫吸附实验显示其与大肠癌抗原有结合活性。结论成功构建了大肠癌病人自然致敏淋巴结抗体Ｆab段噬菌体呈 现库,利用噬菌体抗体库技术,可筛选相关抗大肠癌抗体。