MicroRNA-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响

目的:探讨miR-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响。方法:以小鼠前成骨细胞MC3T3-E1为实验对象,对MC3T3-E1细胞进行成骨诱导,分别在0、3、5、7 d应用实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测细胞中Runx2、Osx、ALP、miR-103-3p表达水平,Western免疫印迹（Western blotting）检测Runx2、Osx蛋白表达并进行碱性磷酸酶（ALP）染色。通过脂质体lipofectamine2000瞬时转染miR-103-3p模拟物 （miR-103-3p mimics）及模拟物阴性对照进入MC3T3-E1细胞内,Real-time PCR检测2组细胞miR-103-3p的表达水平,CCK-8试剂盒检测细胞增殖。分别对2组细胞进行成骨诱导,在成骨诱导后0、3、7 d,分别使用Real-time PCR和Western免疫印迹检测2组细胞Runx2、Osx等成骨相关基因mRNA和蛋白的表达变化,并对2组细胞进行ALP染色。实验数据采用SPSS19.0软件包进行统计学分析。结果:MC3T3-E1经成骨诱导0、3、5、7 d后,细胞内Runx2、Osx、ALP转录水平持续显著升高;Runx2、Osx蛋白表达升高。ALP染色逐渐加深。在成骨诱导3、5、7 d的MC3T3-E1细胞中,miR-103-3p水平较诱导前受到持续显著抑制(P<0.05)。瞬时转染miR-103-3p mimics后,MC3T3-E1细胞中的miR-103-3p表达水平较对照组显著上调(P<0.05),细胞增殖受到抑制,Runx2、ALP转录水平显著抑制（P<0.05）,Runx2蛋白表达显著抑制。对转染后的细胞进行成骨诱导3、7 d后,miR-103-3p转染组细胞Runx2、Osx、ALP在转录水平的表达较对照组显著降低,Runx2、Osx在蛋白水平的表达较对照组显著降低,且miR-103-3p转染组细胞ALP活性较对照组显著降低。结论:miR-103-3p可能对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的成骨分化早期起抑制作用。     

Dlx2在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的作用

目的:探讨Dlx2(distal-less homeobox 2)基因过表达对体外培养的小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1 向成骨方向分化的影响.方法:构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序验证.体外病毒转染MC3T3-E1后,以嘌呤霉素行抗性筛选稳定细胞株,以RT-PCR和Western印迹检测转染后细胞中Dlx2的表达.应用实时定量PCR(RT-PCR)检测Dlx2过表达对部分成骨相关基因(ALP、OCN、Runx2、Msx2)表达的影响.以碱性磷酸酶(ALP)活性测定和茜素红染色法检测Dlx2过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响.采用SAS 6.04软件包对数据进行随机设计的方差分析.结果:本实验成功构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序正确.体外转染后筛选出Dlx2稳定高表达细胞株MC3T3-E1-Dlx2,其mRNA和蛋白表达量显著高于对照组.在成骨诱导过程中,MC3T3-E1-Dlx2细胞ALP值在第4、7、14d均高于对照组细胞,茜素红染色显示实验组较对照组和空白组染色深.Dlx2过表达在成骨诱导早期能显著促进ALP和Msx2的表达(P<0.05),晚期则上调OCN表达(P<0.05),而Runx2表达无明显变化(P>0.05).结论:Dlx2过表达上调AIP、OCN等成骨相关基因的表达.促进MC3T3-E1细胞的成骨分化.     

非病毒载体介导pBMP-2转染MC3T3-E1细胞的体外成骨分化研究

目的 :探讨非病毒载体Gen Escort TM II介导质粒骨形态发生蛋白2(p BMP-2)转染对MC3T3-E1细胞增殖和体外成骨分化的影响。方法:以非病毒载体Gen Escort TM II介导报告基因质粒增强型绿色荧光蛋白(p EGFP)转染MC3T3-E1细胞,优化转染条件,荧光显微镜和流式细胞仪评价转染效率。p BMP-2转染MC3T3-E1细胞后,MTT法检测细胞增殖情况,染色法检测碱性磷酸酶(ALP)和茜素红S(ARS)的表达,Real-time PCR分析成骨细胞标志基因ALP、骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的表达。结果 :Gen Escort TM II介导p EGFP转染MC3T3-E1细胞后,转染效率达35.02±4.42,MTT结果示基因转染对细胞增殖无影响(P>0.05)。p BMP-2转染组的ALP、ARS表达较p EGFP转染组和未转染组显著,同时Real-time PCR检测结果示,转染后6 d,p EGFP转染组和未转染组相比,p BMP-2转染组的成骨基因ALP、BSP、Runx2、OCN、OPN的表达量差异有显著性意义(P<0.05)。结论:非病毒载体Gen Escort TM II介导BMP-2转染MC3T3-E1细胞可诱导其向成骨方向分化。     

同源盒蛋白(Msx1)过度表达抑制成骨细胞碱性磷酸酶表达的实验研究

目的:观察同源盒蛋白(Msx1)过度表达在成骨细胞MC3T3-E1分化培养过程中对碱性磷酸酶的调节作用,以探讨Msx1蛋白对细胞成骨分化过程的调控机制。方法:将成骨细胞MC3T3-E1分为5组:未转染病毒组作为对照组1(A组);空白腺病毒载体组作为对照组2(B组);未分化组作为空白对照组(C组);分化前1 d转染携带同源盒基因Msx1的腺病毒载体组(D组);分化后1 d转染Msx1腺病毒载体组(E组)。在成骨分化培养基中培养4 d后,检测成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养过程中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性。结果:A、B两组成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养基培养4 d后,ALP活性呈强阳性;C组中未分化成骨细胞MC3T3-E1无ALP活性,D、E两组的成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养4 d后的ALP活性明显较A、B组减低,而且D、E两组间ALP活性无区别。结论:过度表达同源盒蛋白(Msx1)能抑制成骨细胞MC3T3-E1的ALP表达,在其成骨分化的过程中起一定的抑制作用。     

不同浓度无机磷对MC3 T3-E1细胞系成骨及破骨相关基因表达的影响

目的：探讨不同浓度的无机磷液对体外培养MC3T3-E1细胞的成骨和破骨相关基因mRNA表达的影响。方法：体外常规培养MC3T3-E1细胞。根据所用培养液外加无机磷浓度的不同,将实验细胞分为4组：0 mM组（对照组）、1 mM组、3 mM组和5 mM组。每组设3个复孔,培养48 h后收取细胞标本,通过Real-time PCR检测MC3T3-E1细胞成骨和破骨相关基因mRNA的表达。结果：与对照组相比,成骨相关基因ALP、BSP、OC及OSXmR-NA的表达在1 mM组和3 mM组增加,而在5 mM组则减少,差异具有统计学意义（ P＜0.05）;成骨抑制基因SOST及破骨相关基因CTSK、TRAPmRNA的表达,在1 mM 组、3 mM 组和5 mM 组都增加,差异具有统计学意义（ P ＜0.05）。结论：高浓度（5 mM）的无机磷环境对MC3T3-E1细胞的成骨相关基因表达起显著抑制作用,对破骨相关基因表达起显著增强作用,提示高浓度无机磷抑制MC3T3-E1细胞的成骨活性。     

miR-497-5p在前成骨细胞MC3T3-E1分化和矿化中的作用及机制探讨

目的：研究微小RNA(miR)-497-5p在前成骨细胞MC3T3-E1分化和矿化中的作用，并探讨其相关机制。方法：取第3代MC3T3-E1细胞，分别转染miR-497-5p过表达质粒miR-497-5p mimics、低表达质粒miR-497-5p inhibitor和阴性对照质粒miR-497-5p NC，设为miR-497-5p mimics组、miR-497-5p inhibitor组和miR-497-5p NC组。取不做处理的细胞作为空白组。成骨诱导后14天，检测碱性磷酸酶（ALP）活性；免疫印迹法检测成骨分化相关蛋白骨钙素（OCN）、I型胶原（COL-I）蛋白表达量；茜素红染色法观察矿化情况；免疫印迹法检测Smad泛素化调节因子2(Smurf2)蛋白表达量；双荧光素酶实验验证miR-497-5p与Smurf2的靶向关系。采用SPSS 25.0软件包进行统计学分析。结果：与空白组、miR-497-5p NC组相比，miR-497-5p mimics组ALP活性显著增强，OCN、COL-I蛋白表达量及矿化结节面积构成比显著升高，Smurf2蛋白表达量显著降低（P<0.05...     

ClC-3氯通道参与TGF-β通路调控PTH的促成骨分化作用机制研究

目的：：初步探究电压门控氯通道3(ClC-3)在甲状旁腺激素(PTH)调节成骨分化过程中的作用机制。方法：采用基因转染的方法,分别用特异性siRNA调节成骨细胞MC3T3-E1中转化生长因子β1(TGF-β1)及ClC-3基因的表达水平,采用实时定量RT-PCR检测ClC-3、TGF-β1及碱性磷酸酶(ALP)、骨唾液蛋白(BSP)、骨钙素(OC)、核心结合蛋白因子2(Runx2)等成骨相关因子的基因表达情况,并用Western blot及免疫荧光方法检测CLC-3和TGF-β1蛋白的表达情况。结果：在PTH间断刺激下,成骨细胞中仅干扰TGF-β1基因表达后,ClC-3氯通道基因及蛋白表达水平增强;仅干扰ClC-3氯通道基因后,TGF-β1基因及蛋白表达水平升高。同样在PTH间断刺激下,在分别干扰ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因后,成骨相关基因表达水平较对照组明显降低(P<0.05);然而共同干扰两者之后成骨相关基因表达较对照组无明显差异(P>0.05)。结论：ClC-3氯通道通过TGF-β通路参与介导了PTH在成骨细胞中促进成骨细胞分化的作用。     

不同质量分数的钛-铜合金对MC3T3-E1细胞分化的影响研究

目的　探究不同质量分数的钛-铜合金对MC3T3-E1细胞分化的影响,并寻找促进细胞分化作用最佳的含铜质量分数。方法　将不同质量分数的钛-铜合金样片分组,设组1（cp Ti）为对照组,组2（Ti-2wt%Cu）、组3（Ti-5wt%Cu）、组4（Ti-10wt%Cu）为实验组。将MC3T3-E1细胞按2 × 104/孔的密度接种到包埋样片的24孔培养板中行共培养。在第3、5、10和15 d时,用微量酶标法检测成骨细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性表达情况;在第7、14和21 d时,分别用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测上清液中Ⅰ型胶原蛋白（COL-Ⅰ）、骨钙素（OC）活性表达情况。采用SPSS 20.0统计分析软件包对所有检测数据进行单因素方差分析,比较各组间差异。 结果　Ti-2wt%Cu最有利于ALP活性表达（P＜0.05）,共培养第10 d时达最大值;Ti-5wt%Cu最有利于COL-Ⅰ活性表达（P＜0.05）,共培养第7 d时达最大值;Ti-5wt%Cu最有利于OC活性表达（P＜0.05）,共培养第14 d时达最大值。 结论　与cp Ti相比较,低质量分数钛-铜（Ti-2wt%Cu、Ti-5wt%Cu）对MC3T3-E1细胞分化有促进作用,表现为时间依赖性;高质量分数钛-铜（Ti-10wt%Cu）对MC3T3-E1细胞分化有抑制作用。相对而言,Ti-5wt%Cu合金对MC3T3-E1细胞分化作用最佳。     

MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导成骨模型的建立及Ano5基因表达的研究

目的 建立MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导成骨模型,探讨Ano5基因表达与成骨细胞形成的关系,了解其对成骨分化的影响.方法 MC3T3-E1 Subclone 14细胞贴壁培养,加入条件培养基,分别培养至0d、3d、7d、14d、21d.倒置显微镜下观察细胞形态,通过碱性磷酸酶活力测定和茜素红染色,鉴定成骨细胞.利用REALTIME-PCR检测Ocn、Colα1、Opg/Rankl、Osterix和Runx2等成骨相关因子的基因表达水平,同时检测Ano5基因在成骨细胞形成过程中的表达趋势.结果 体外诱导MC3T3-E1 Subclone 14倒置光学显微镜下观察细胞形态呈梭形.成骨细胞碱性磷酸酶活力逐渐增高.成骨诱导培养至14d和21d,茜素红染色可见细胞表面出现矿化结节.成骨相关因子基因表达均逐渐增高,至21d达到高峰.Ano5基因从诱导分化的第3d开始表达,随后表达量逐渐增高,至14d达到高峰,21d表达量下降.结论 在MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导分化为成骨细胞过程中,Ano5基因表达量逐渐升高,至14d达到高峰,21d开始表达量具有下降趋势.     

“壳-芯”结构电纺纤维膜对MC3T3-E1细胞体外早期成骨分化的影响

［摘要］　目的　研究载有骨形态发生蛋白(BMP-2)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)“壳芯结构”静电纺丝纤维膜(PP-B)对MC3T3-E1细胞体外早期成骨分化的影响。方法　通过同轴静电纺丝的方法制备PLGA/PCL-BMP-2纤维膜(PP-B),以不含BMP-2的PLGA/PCL电纺纤维膜(PP)为对照组。通过透射电子显微镜观察PP-B膜的“壳-芯”结构;用ELISA法检测BMP-2的体外释放行为;收集PP-B膜的浸出液培养细胞,用碱性磷酸酶(ALP)活性检测法检测其释放的BMP-2对MC3T3-E1细胞的影响;将MC3T3-E1细胞接种到纤维膜上,通过CCK-8法检测1d、3d、5d、7d的增殖情况;以碱性磷酸酶(ALP)活性为早期骨向分化指标,检测其7d的活性;用实时荧光定量逆转录PCR检测细胞接种7d时成骨指标Bmp2、Alp、Col1、Msx2、Runx2的表达。结果　透射电镜结果表明,同轴静电纺丝法制备的PP-B静电纺丝可形成连续均一的“壳-芯”结构;ELISA结果显示,PP-B膜可以实现BMP-2的持续释放;ALP活性检测结果证实本实验条件下制备的负载BMP-2的同轴静电纺丝支架能保持生长因子的部分活性。CCK-8结果显示PP-B膜和PP膜上的MC3T3-E1细胞在1、3、5、7d都持续增殖;ALP活性检测及染色结果显示PP-B膜上的MC3T3-E1细胞的ALP活性高于PP膜(P<0.05);实时荧光定量逆转录PCR结果显示接种在PP-B膜上的MC3T3-E1细胞的相关成骨基因Bmp2、Alp、Col1、Msx2、Runx2的表达高于PP膜(P<0.05)。结论　本实验制备的PP-B膜能促进MC3T3-E1细胞在体外的早期成骨分化。     

Emdogain promotes osteoblast proliferation and differentiation and stimulates osteoprotegerin expression

PURPOSE: The purpose of this study was to investigate the effects of EMD on the growth and differentiation of osteoblastic cells (MC3T3-E1) and on the expression of osteoprotegerin (OPG), a key cytokine that inhibits osteoclastogenesis and osteoclast function. STUDY DESIGN: MC3T3-E1 cells were treated with 100 microg/mL EMD in serum-free medium for 1, 2, 3, 5, and 7 days, or in 2% fetal bovine serum (FBS) for 3 weeks. Cells incubated without EMD served as negative control. At the end of each incubation period, cell numbers were counted and total cellular mRNA was extracted. Northern blot analysis and RT-PCR were performed to determine the mRNA levels of core binding factor alpha (Cbfa1), collagen alpha1 (I), bone sialoprotein (BSP), osteocalcin (OC), insulin-like growth factor I (IGF-I), and OPG. Alkaline phosphatase (ALP) activity was also determined and compared between treatment and control groups. RESULTS: A marked increase in cell numbers was observed in EMD-treated groups from day 2 to day 7 (P < .01). mRNA expression of collagen alpha1 (I), BSP, OC, OPG, and IGF-I were up-regulated in cells treated with EMD. ALP activity was significantly increased by EMD treatment after 3-week culture under differentiating conditions (P < .05). The expression of Cbfa1 was not affected by EMD treatment from day 1 to day 5; the levels were elevated after culturing for 3 weeks in EMD-treated cells. CONCLUSIONS: EMD promotes both proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells and indirectly inhibits osteoclastogenesis and osteoclast function by stimulating the expression of OPG.     

RGD多肽修饰的无机小牛骨粉对MC3T3-E1细胞黏附、增殖及分化的影响

目的:研究小鼠前成骨细胞MC3T3-E1在RGD修饰的无机小牛骨粉上的黏附、增殖及分化。方法:浸泡法制备RGD/Bio-Oss复合材料。MTT法检测细胞1 h、2 h、3 h黏附,扫描电镜观察细胞黏附形态,DNA浓度定量分析细胞1 d、3 d、5 d、7 d的增殖。碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞7 d、14 d的分化。结果:1 h、2 h、3 h细胞黏附结果Bio-Oss/RGD组明显高于Bio-Oss组及空白对照组;1 d、3 d、5 d、7 d Bio-Oss/RGD组和Bio-Oss组的DNA浓度差别无统计学意义,但都低于空白对照组;细胞分化第14天时Bio-Oss/RGD组的结果明显高于Bio-Oss组与空白对照组。结论:RGD对细胞黏附及分化有一定的促进作用,但对细胞增殖无显著促进作用。     

多孔钛的骨传导性及其孔隙结构对MC3T3-E1细胞早期分化的影响

目的 探讨多孔钛的骨传导性及其孔隙结构对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1早期分化的影响.方法 碳酸氢铵造孔剂结合粉末冶金法制备6组由不同平均孔隙率及不同平均孔径组合的多孔钛试样,即AⅠ（43.1±0.7）％和（154.8±11.9） μm AⅡ：（40.9±1.5）％和（295.6±8.5） μm AⅡ （44.3±1.1）％和（560.4±25.6） μm;BⅠ：（53.3±1.2）％和（191.6±3.7） μm; BⅡ.（51.7±2.7）％和（303.8±8.2） μm; BⅢ：（49.9±3.9）％和（583.1±21.7） μm,Ta2级商业致密纯钛作为对照组;每组3个试样.MC3T3-E1细胞接种于24孔板3h贴壁后置入多孔钛试样,培养3d和5d后激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察经FITC微丝蛋白荧光探针标记的细胞.MC3T3-E1细胞接种于已置入试样的24孔板,培养7d和14d后测定碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,评价细胞的早期分化能力;培养21d后茜素红染色观察细胞晚期矿化结节.结果 MC3T3-E1细胞贴壁后,5d可长人多孔钛孔内及表面.7d和14d多孔钛组ALP活性显著高于对照组（P＜0.05）;其中BⅠ组在14d的ALP活性显著高于其它各组（P＜0.05）.21d多孔钛试样表面及孔隙内均可见钙结节形成.结论 在本实验条件下,多孔钛具有一定的骨传导性;平均孔隙率为53.3％且平均孔径为191.6 μm的多孔钛利于MC3T3-E1细胞的早期分化.     

硫酸软骨素蛋白聚糖对MC3T3-E1细胞株矿化的影响

目的:观察硫酸软骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycan,CSPG)对前成骨细胞株MC3T3-E1矿化过程中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和钙离子沉积量的影响。方法:MC3T3-E1细胞株在含不同浓度CSPG(0、5、10、15 mg/L)诱导液中培养,不加CSPG组为对照组,其余3组为实验组,细胞诱导14 d时行ALP染色和活性检测,21 d时行茜素红染色和钙离子沉积量检测。结果:与对照组比较,各实验组ALP和茜素红染色面积随CSPG浓度增加逐渐减小,颜色变浅;定量分析结果显示,钙离子沉积量整体差异有统计学意义(P<0.05),ALP活性整体差异无统计学意义。结论:在本实验周期内,CSPG以剂量依赖方式抑制MC3T3-E1细胞株钙离子的沉积。     

钛表面RGD/仿生磷酸钙复合涂层对MC3T3-E1细胞黏附、增殖、分化的影响

目的:研究钛表面RGD/仿生磷酸钙复合涂层对MC3T3-E1细胞黏附、增殖和分化的影响。方法:1)两步法在钛表面制备仿生磷酸钙涂层,扫描电子显微镜(SEM)观察形态,X射线衍射(XRD)、傅立叶转换红外光谱(FTIR)检测表征;2)RGD固定至仿生磷酸钙涂层;3)实验分3组:纯钛组,钛/仿生磷酸钙涂层组,钛/RGD/仿生磷酸钙复合涂层组,细胞分别接种至3组材料表面。4)SEM观察细胞接种4 h和24 h的形态;5)结晶紫染色检测细胞接种4 h和8 h的黏附情况。6)MTT法检测细胞1、3、7 d的增殖活性;7)检测细胞3、7、14 d的ALP活性。结果:SEM细胞形态观察及结晶紫染色结果显示,RGD/仿生磷酸钙复合涂层组的细胞黏附效果优于对照组。MTT结果显示RGD/仿生磷酸钙复合涂层组的细胞增殖活性强于对照组。ALP检测结果显示RGD/仿生磷酸钙复合涂层组的成骨分化活性高于对照组。结论:钛表面RGD/仿生磷酸钙复合涂层对MC3T3-E1细胞的黏附、增殖、分化均有促进作用。     

牙龈卟啉单胞菌脂多糖对成骨细胞EphA2表达的调控

目的：研究小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1在成骨分化过程中,牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Pg-LPS）对EphA2表达的影响。方法：使用终浓度1mg/L的Pg-LPS与MC3T3-E1共培养,分别在第3、7、14天3个时间点,采用RT-PCR和Western-Blot技术测定EphA2的表达和成骨相关基因的表达,并通过PNPP法测定碱性磷酸酶活性。结果：RT-PCR结果提示,在第3天和第7天,实验组比对照组EphA2基因表达分别增高4.5倍和1.3倍,两组之间存在显著差异（P〈0.05）。同时成骨标志物ALP和Sp7基因表达降低,与对照组相比差异有显著性,但Runx2和ColⅠ基因的表达则无明显差异。但是在第14天,实验组和对照组之间EphA2和成骨相关基因表达均无显著性差异。Western-Blot结果提示,在第7天实验组比对照组EphA2蛋白表达增加。结论：Pg-LPS对前成骨细胞系MC3T3-E1细胞,在成骨分化的早期和中期能够促进EphA2的表达,但是在成骨分化晚期对EphA2的表达则无明显作用。     

透钙磷石涂层浸提液掺锶对 MC3T3-E1细胞成骨相关因子表达的影响

目的：探讨透钙磷石与锶对成骨细胞的协同作用。方法：电化学沉积制备含透钙磷石涂层钛片,浸提法制备其浸提液,向配制好的浸提液中分别加入0．1％、0．5％和1％的锶。将 MC3T3-E1细胞置于掺锶的浸提液中进行培养,检测不同含锶量的透钙磷石涂层浸提液中 MC3T3-E1细胞活性、ALP 活性,RT-PCR 检测 bFGF 和 VEGF mRNA 表达。结果：含透钙磷石涂层钛片浸提中锶的浓度为0．1％、0．5％和1％时,培养的 MC3T3-E1细胞增殖率、ALP 活性、bFGF 和 VEGF mRNA 表达均高于无锶对照组（P ＜0．05）。结论：掺锶透钙磷石对 MC3T3-E1细胞成骨功能有促进作用。