用原位核酸杂交法探讨柯萨奇病毒与克山病的关系

为进一步探讨柯萨奇病毒与克山病的关系，采用柯萨奇Ｂ３病毒（ＣＶＢ３）制备的ｃＤＮＡ探针与黑龙江、山东、云南三省病区克山病尸检心肌组织及胎儿克山病心肌组织的石蜡切片进行了原位核酸杂交，并用脑外伤、ＣＯ中毒等意外死亡健康成人及冠心病、风心病尸检心肌组织和病区、非病区７～８个月引产胎儿心肌组织的石蜡包埋切片作为对照。结果急型克山病８／１３、慢型克山病３４／５０、亚急型克山病２２／２９呈现阳性杂交信号，提示有柯萨奇病毒ＲＮＡ的存在，冠心病２／１５、风心病１／１５、显著低于克山病，而健康成人对照组均为阴性，胎儿克山病一例呈阳性反应，病区引产胎儿心肌组织１０例中有２例也检出柯萨奇病毒ＲＮＡ，而非病区胎心则为阴性。结果提示在一些克山病的发生和发展过程与柯萨奇Ｂ组病毒的感染高度相关。     

原位核酸杂交法探讨柯萨奇B组病毒与云南亚急型克山病的关系

用光敏生物素标记的柯萨奇 B_3病毒 cDNA 探针,与云南病区20例经临床和病理检查确诊为亚急型克山病的心肌组织切片进行原位核酸杂交,以检测柯萨奇 B 组病毒 RNA。结果有18例出现阳性杂交信号,阳性率达90%。说明云南亚急型克山病心肌组织中有柯萨奇 B 组病毒 RNA 的存在。提示云南亚急型克山病的发生与柯萨奇 B 组病毒的持续感染密切相关。     

用原位核酸杂交法探讨柯萨奇B组病毒与克山病的关系──（黑龙江省急型克山病）

为探讨柯萨奇Ｂ组病毒感染与黑龙江省急型克山病的关系。本文用缺口平移法制备生物标记的柯萨奇Ｂ３病毒的ｃＤＮＡ探针与１３例急型克山病尸检心肌组织及脑外伤、ＣＯ中毒等意外死亡的正常成人心肌组织１０例，非病区７～８个月引产胎儿心肌组织１０例的石腊切片进行原位杂交。结果１３例急型克山病中有８例出现阳性杂交信号，即有柯萨奇Ｂ组病毒的ＲＮＡ存在，阳性率达６１．５％。对照组均为阴性，提示黑龙江省急型克山病有柯萨奇Ｂ组病毒感染，可能是急型克山病发病因素之一。     

克山病尸检心肌标本柯萨奇B组病毒RNA片段的序列分析

目的通过原位核酸杂交技术和RT-PCR技术探讨柯萨奇B组病毒感染与吉林亚急型克山病的关系.方法以柯萨奇B组病毒基因组的一段共同序列做寡核苷酸探针,于5′端行生物素标记,检测亚急型克山病患者尸检心肌组织标本中柯萨奇病毒的感染率;选取阳性标本做RT-PCR,并对PCR产物进行核苷酸序列分析,比较其与柯萨奇B组病毒各血清型之间的差异.结果 9例亚急型克山病患者尸检心肌组织标本中有7例原位核酸杂交结果阳性,阳性率为77.78%;所选3例原位核酸杂交结果阳性标本RT-PCR均有长541 bp的DNA条带出现,测序结果表明该片段与柯萨奇病毒B3同区域序列一致,与B1、B4、B5的同源性较大.结论亚急型克山病患者体内有柯萨奇B组病毒RNA存在,柯萨奇病毒可能在克山病的发生发展中扮演重要的角色.     

柯萨奇病毒RNA阳性信号在克山病心肌中形态特征及其与发病的关系

目的：探讨柯萨奇病毒RNA阳性信号在克山病心肌细胞中的特征及病毒感染与发病的关系。方法：以65例不同型别克山病尸检心肌组织蜡块为研究对象，用寡核苷酸探针与组织切片进行原位核酸杂交，以检测柯萨奇B组和A组病毒RNA。结果：急型、亚急型及慢我山病的阳性杂交信号检出率分别为83．0％、87．9％及80．0％。阳性信号在急型、亚急型克山病心肌中颗粒粗大，境界较清晰，但分布比较局限；在慢型克山病中阳性信号多散在分布于各部位心肌细胞内，但颗粒较细小，境界不清。结论：心肌组织蜡块长期保存不影响杂交结果；吉林省各型克山病均与柯萨奇病毒感染密切相关，提示病毒感染是克山病复合病因的重要组成部分。     

克山病患者心肌肠道病毒VP1结构蛋白检测

目的 探讨肠道病毒感染与克山病发病的关系。方法 应用抗柯萨奇B5病毒(Coxsackie B5 virus，CVB5)VP1蛋白单克隆抗体，采用免疫组化方法，检测黑龙江、山东、云南省克山病病区急型、亚急型、慢型、潜在型克山病死亡病例心肌标本83例，风心病10例，冠心病10例，心肌炎21例，扩张型心肌病29例，非病区非正常死亡的正常人10例，病区发病季节非克山病死亡病例13例。结果 克山病83例心肌标本中有74例VP1结构蛋白阳性，阳性率89．2％；风心病、冠心病、非正常死亡健康人VP1阳性检出率均为10％；心肌炎、扩张型心肌病VP1阳性检出率分别为66．7％和70％；病区发病季节非克山病死亡病人VP1阳性检出率为38．5％。结论 来自3省份的各型克山病死亡病例心肌标本中均能检出肠道病毒VP1结构蛋白，克山病的发生与肠道病毒感染高度相关。     

用原位核酸杂交法探讨柯萨奇B组病毒与黑龙江慢型克山病的关系

克山病是原因未明的地方性心肌病，慢型克山病有关病毒病因的研究未见有关报道，作者用生物素标记的柯萨奇Ｂ３病毒的ｃＤＮＡ探针与黑龙江病区慢型克山病尸检心肌组织及非正常死亡成人心肌组织和非病区７￣８个月引产胎儿心肌组织进行了原位杂交，以检测柯萨奇Ｂ组病毒ＲＮＡ。结果１３例慢型克山病中有９例呈现阳性杂交信号，阳性率达６９．２％，两对照组均为阴性。表明黑龙江慢型克山病心肌组织中有柯萨奇Ｂ组病毒ＲＮＡ的存在，     

克山病患者心肌中肠道病毒VP1抗原的检测

目的为进一步探讨肠道病毒感染与克山病的发病关系.方法应用抗柯萨奇B5病毒的VP1壳蛋白的单克隆抗体,采用免疫组化方法,对黑龙江、山东、云南3省区急型、亚急型、慢性、潜在型克山病患者尸检心肌共83例,风心病10例,冠心病10例,心肌炎21例,扩张型心肌病29例,非病区非正常死亡的正常人10例,病区发病季节非克山病死亡病人13例的尸检心肌进行了检测.结果克山病尸检心肌83例中有74例阳性,阳性率89.2%;风心病、冠心病、非正常死亡健康人的阳性检出率分别为10%,心肌炎,扩张型心肌病的阳性检出率分别为66.7%和70%;病区发病季节非克山病死亡病人心肌阳性检出率为38.5%.结论 3省区各型克山病心肌中均能检出肠道病毒VP1结构蛋白,支持克山病的发生与肠道病毒感染高度相关.     

用原位核酸杂交法探讨柯萨奇B组病毒与克山病的关系

为探讨柯萨奇Ｂ病毒感染与黑龙江省急型克山病的关系。本文用缺口平移法制备生物标记的柯萨奇Ｂ３病毒的ｃＤＮＡ探针与１３例急型克山病尸检心肌组织及脑外伤、ＣＯ中毒等意外死亡的正常成人心肌组织１０例，非病区７－８个月引产胎儿心肌组织１０例的石腊切片进行原位杂交。     

柯萨奇B_4病毒感染与克山病及其病区病毒性心肌炎

目的　探讨柯萨奇 B4病毒与克山病及其病区病毒性心肌炎的关系。方法　采用寡核苷酸探针的原位核酸杂交方法 ,结合病理学观察 ,对比研究克山病与病毒性心肌炎的异同。结果　克山病与病毒性心肌炎各自具有特征性的病理学改变 ;发病区 88.89%的病毒性心肌炎出现阳性杂交信号 ,而且几乎每例的所有心肌细胞均见阳性杂交信号 ;95 .2 4%的亚急型克山病出现阳性杂交信号 ,且半数以上的标本几乎所有的心肌细胞内出现阳性杂交信号 ;阳性信号在病毒性心肌炎和亚急型克山病的心肌细胞内的分布及阳性信号颗粒的形态并无明显区别。结论　柯萨奇 B4病毒与克山病及其病区病毒性心肌炎密切相关 ,其不同的病变特征可能是由于组成病因网的诸因素发生变动所致     

克山病的心肌损伤与细胞凋亡

为探讨克山病的心肌损伤与细胞凋亡的关系，采用Ｏｎｃｏｒ公司的细胞凋亡原位检测试剂盒（ＴＵＮＥＬ）对３０例克山病尸检心肌组织进行了检测，其中急型、亚急型、慢型克山病心肌组织各１０例，以因交通事故死亡的５例正常人尸检心肌组织作为对照，结果显示，急型、亚急型、慢型克山病心肌组织中凋亡细胞阳性检出率分别为２／１０、８／１０与７／１０。５例正常心肌组织中，未检出凋亡细胞，以上结果提示：在克山病的发生发展中有凋亡机制参与。     

克山病病区12例急性心肌炎临床病理分析

目的 探讨云南省克山病病区急性致死性心肌炎暴发流行及其猝死的原因。方法 对１２例在季节性群体发病中收集到的死亡病例,作临床病理资料总结分析。结果 此类心肌炎暴发浒具有一定的发病特点,心肌病变主要表现为间质性炎症反应,在９例心肌组织中,有８例肠道病毒ＲＮＡ阳性。结论 肠道病毒感染可能是云南克山病病区急性心肌炎暴发流行的主要病因。     

2008年陕西省克山病病情调查结果分析

目的 掌握陕西省克山病病情现状,为今后克山病防治决策提供科学依据.方法 2008年在陕西省克山病病区范围内采用整群分层随机抽样的方法选取19个病区县(区),每个病区县(区)选取1个病区村作为调查点,对调查点内3岁以上全体居民进行临床检查和心电图描记,可疑心脏异常者拍摄后前位2 m距离X线胸片:采集调查点部分居民主食粮样,测定粮硒水平.结果 共调查病区居民10 228人,检出克山病患者110例,总检出率为1.08%(110/10 228).其中潜在型克山病92例,检出率为0.90%(92/10 228);慢型克山病18例,检出率为0.18%(18/10 228);无急型、亚急型克山病病例检出.潜在型克山病心电图异常改变以完全性右束支传导阻滞[占48.57%(51/105)]、ST-T改变[占19.05%(20/105)]、多发性室性早搏[占10.48%(11/105)]、左心室肥大[占5.71%(6/105)]、左前分支传导阻滞[占5.71%(6/105)]多见,而慢型克山病以心房纤颤[占24.00%(6/25)]、左心室肥大[占20.00%(5/25)]、完全性右束支传导阻滞[占20.00%(5/25)]为主.可疑心脏异常者X线心胸比例增大率为18.08%(32/177).调查点小麦、玉米、小米、大米含硒量分别为(01096±0.028)、(0.089±0.029)、(0.087±0.016)、(0.047±0.016)mg/kg.结论 陕西省克山病病情处于基本控制后的平稳低发态势,潜在型、慢型克山病是目前患病的主要临床类型.病区居民粮食含硒量明显升高.已达到非病区水平.     

山东省亚急型克山病患儿与柯萨奇B组病毒的关系

为探讨山东省亚急型克山病患儿与柯萨奇Ｂ组病毒的关系，用缺口平移法制备生物素标记的ＣＯＸＢ３病毒的ｃＤＮＡ探针，与亚包型克山病病例尸检心肌组织９例及１５例脑外务，ＣＯ中毒等意外死亡的正常民人心肌组织和１０例非病区７～８个月胎儿心组织切片进行原位杂交，结果９例山东亚急型克山病的５例检测到ＣＯＸＢ组病毒的ＲＮＡ，阳性率为５５．５％（５／９），而对照组均为阴性，结果提示ＣＯＸＢ组病毒感染是山东省亚急性型克     

2004年陕西省黄陵县克山病监测报告

目的监测陕西省黄陵县2004年克山病发病情况。方法将监测点区全体居民作为监测对象进行全面检查,并对监测点区的粮硒及儿童发硒进行检测。结果(1)无急型、亚急型克山病发生,潜、慢型克山病的检出率为11%;(2)新发潜在型克山病1例;(3)儿童发硒及大米含硒量病区明显低于非病区(P<0.05)。结论陕西省黄陵县监测点克山病的检出率呈缓慢上升态势,潜在型克山病仍有新发。     

2008年云南省克山病病情调查结果分析

目的 掌握2008年云南省克山病病情,为克山病防治提供科学依据.方法 在云南省克山病病区抽取6个县(市)的18个自然村作为调查点,调查对象为调查点的居民.收集各调查点户籍人口与常住人口资料,对调查对象进行以心血管系统疾病为主的临床检查,并描记心电图;可疑克山病者拍摄2 m后前位胸部正位X线片,按<克山病诊断标准>(GB 17021-1997)确诊克山病病例.每个调查点采集10份主食粮食样品及10份男性儿童枕后头发样品进行含硒量测定.结果 2008年全省6个县(市)18个调查点共调查9818人,共检出潜在型和慢型克山病34例,总检出率为0.35%(34/9818),其中检出潜在型克山病32例,检出率为0.33%(32/9818),检出慢型克山病2例,检出率为0.02%(2/9818);急型和亚急型克山病未检出.在检出的34例克山病现患病例中,5～14岁占67.65%(23/34).18个调查点中,共描记心电图9818份,心电图有异常改变的有677份,异常率为6.90%(677/9818);共拍摄X线胸片56例,心胸比例≤0.50者占83.93%(47/56),0.51～0.55者占8.93%(5/56),0.56～0.60者占7.14%(4/56).18个调查点采集大米、头发样品各180份,大米样品含硒量最低的为永胜县[(0.006±0.001)mg/kg],最高的为通海县[(0.027±0.009)mg/kg],平均为(0.013±0.010)mg/kg;发硒最低的为永胜县[(0.145±0.043)mg/kg],最高的为通海县[(0.297±0.062)mg/kg],平均为(0.252±0.078)mg/kg.结论 云南省克山病检出率较低,但检出病例集中在5～14岁年龄段,说明克山病致病因子仍然活跃.调查点外环境粮食及居民发硒水平处于较低水平以及各地差异比较大,有必要在克山病重病区开展补硒预防克山病工作.     

克山病病区粮喂养大白鼠的免疫学实验研究和克山病患者的免疫状态初步探讨

本文报道了克山病病人的免疫功能变化及用克山病病区粮喂养大白鼠的免疫功能改变,研究结果表明,克山病病区人群的免疫功能一般偏低,慢性和潜在型克山病患者免疫球蛋白水平增高,尤以IgA和IgM为显著。克山病患者的抗核抗体阳性率增高,循环免疫复合物水平也有增高的趋势,患者心肌组织中有IgG的沉积,表明克山病患者有免疫学改变,并具有自身免疫反应特点;用克山病病区粮喂养大白鼠,可使其免疫功能受到一定影响,主要表现为T细胞数的减少及T细胞功能的降低,病区粮加硒后对其影响不明显,提示病区粮因素所致的机体免疫功能改变在克山病的发病过程中可能有一定影响,而硒可能只是免疫学改变的一个因素而已。     

desmin基因exon6 A360P错义突变与慢型及潜在型克山病心肌损伤的关系

目的 探讨desmin基因exon6 A360P错义突变与克山病心肌损伤的关系及exon6 A360P错义突变是否是慢型及潜在型克山病损伤的易感基因.方法 在陕西省克山病病区黄陵县店头镇和非病区西安市长安区,采用单纯随机抽样的方法,抽取年龄相匹配的慢型和潜在型克山病患者(病例组)30例及病区(内对照组)和非病区对照(外对照组)各30例.采集外周血5 ml,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,盐析法制备基因组DNA.采用PCR方法,用特异性的Bsp1286 Ⅰ内切酶对可能发生突变的exon6位点进行酶切.设内对照,在desmin基因exon4位点进行酶切,判定标准为在122 bp和60 bp处各出现1个条带.琼脂糖凝胶电泳分析desmin基因exon6 A360P错义突变位点,判定标准为desmin基因exon6位点酶切后在184 bp和66 bp处各出现1个条带.结果 琼脂糖凝胶电泳结果显示,内对照desmin基因exon4在Bsp1286 Ⅰ酶切前,在182 bp处仅出现1条条带;在酶切后,被切成2个片段,在122 bp和60 bp处各出现1个条带.慢型及潜在型克山病患者desmin基因exon6在Bsp1286 Ⅰ酶切前和酶切后,均在250 bp处出现了1个条带;病区和非病区对照组desmin基因酶切后,也是在250 bp处出现了1个条带.3组结果相同,desmin基因exon6没有被Bsp1286 Ⅰ酶切开,A360P没有发生错义突变.结论 慢型和潜在型克山病患者未检出desmin基因exon6 A360P错义突变位点,desmin基因exon6 A360P错义突变不是克山病心肌损伤的易感基因.     

陕西省克山病病区粮食和人群硒水平调查

目的了解陕西省克山病病区粮食和人群硒水平。方法按整群分层抽样的方法,于2006-2007年,在陕西省克山病区范围内抽取6个病区县（区）的12个自然村作为调查点,采集调查点居民户自产主食粮食小麦和玉米515份,克山病患者和病区健康人发样307份、全血248份及非病区健康人血样64份,用2,3-二氨基萘荧光法、原子荧光法和化学比色法分别测定粮食、发硒、全血硒含量和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力。结果病区居民粮食（小麦、玉米）硒含量为（0.045±0.036）和（0.035±0.025）mg/kg,克山病患者发硒含量（0.376±0.091）mg/kg低于病区健康人（0.384±0.077）mg/kg,差异无统计学意义（P〉0.05）;克山病患者全血硒含量（0.071±0.017）mg/L低于病区健康人（0.077±0.017）mg/L,差异有统计学意义（P〈0.05）,病区健康人明显低于非病区健康人（0.090±0.016）mg/L,差异有统计学意义（P〈0.01）;克山病患者GSH-Px（75.16±12.10）U/L低于病区健康人（85.70±14.66）U/L,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论病区粮食和人群硒水平明显升高,与生活水平的提高和膳食结构的明显改善有关。