日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链可变区基因的体外扩增克隆及序列分析

目的 分离日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链可变区（VH）基因并测定其序列。方法 根据鼠免疫球蛋白重链可变区基因FR1和FR4序列的保守性，化学合成体外扩增Ig重链可变区基因的数对引物。以日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30的杂交瘤细胞株基因组DNA为模板，扩增VH基因，将其克隆入pUC19载体，重组子用Sanger′s双脱氧链终止法测定序列，将序列与GeneBank中已发表的抗体序列比较。结果 VH基因全长357bp，属鼠免疫球蛋白重链第Ⅱ亚类，由种系基因V、Dsp2．8与JH4重排而来。该VH基因序列已被GeneBank收录（accession No AF282622）。结论 该VH基因为日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链可变区基因。     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区基因的克隆及序列分析

[目的]分离日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区 (VL)基因并测定其序列。 [方法 ]根据鼠免疫球蛋白轻链可变区基因FR1和FR4序列的保守性 ,化学合成用于体外扩增Ig轻链可变区基因的数对引物。以日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30的杂交瘤细胞株基因组DNA为模板 ,扩增VL 基因 ,将其克隆入 pUC19载体 ,重组子用Sanger的双脱氧链终止法测定序列 ,将序列与GenBank中已发表的抗体序列比较。 [结果 ]VL 基因全长 318bp ,属鼠免疫球蛋白κ轻链第IV亚类 ,由种系基因V与Jκ4 重排而来。该VL 基因序列已被GenBank收录 (accessionNo AF2 0 6 72 0 )。 [结论 ]该VL 基因为日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区基因。     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30对虫卵肉芽…

应用日本血吸虫单克隆抗独特型抗体ＮＰ３０腹腔注射致敏Ｃ５７ＢＬ／６小鼠，继之经脾脏注射虫卵形成的肝虫卵肉芽肿模型。用ＳＥＡ致敏组作阳性对照，ＳＰ２／０腹水组作阴性对照。实验结果表明，在虫卵攻击后第４ｄ，ＮＰ３０致敏组肝虫卵肉芽肿面积、体积即开始明显增加，出现多量嗜酸性粒细胞浸润。     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30的建株...

A hybridoma cell line secreting an IgM monoclonal antibody designated NP30 was obtained from a fusion of SP2/o and spleen cells of a BALB/c mouse chronically infected with schistosoma japonicum for one and a half year and identified by screening with immunized rabbit sera against gut-associated antigen (GAA) and soluble egg antigen (SEA) of S. japonicum, indicating that the NP30 was an anti-anti-antigen or anti-antibody. NP30 was further determined to be an anti-idiotypic antibody (anti-id) which was serologically and functionally identical to GAA, so that it could be portrayed as the internal image of GAA, which might have the potential to be used as an antigenic reagent in immunodiagnostic assays of schistosomiasis japonica.     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30诱导抗卵免疫的研究

目的观察日本血吸虫单克隆抗独特型抗体ＮＰ３０对日本血吸虫雌虫生殖产卵及卵胚发育的影响。方法腹腔注射ＮＰ３０主动免疫Ｃ５７ＢＬ／６小鼠,连续３次,对照组腹腔注射ＳＰ２／０腹水。结果尾蚴攻击感染后第２７天,ＮＰ３０免疫组肝组织内虫卵数下降了３０．９１％,雌虫子宫内虫卵数减少了３８．５５％。尾蚴攻击感染后第３９天,ＮＰ３０免疫组肝组织内的成熟虫卵下降了６６．６３％,死亡虫卵增加了６０．６６％。结论ＮＰ３０主动免疫小鼠具有抗雌虫生殖产卵和抗卵胚发育的双重功效,为一很有希望的血吸虫病抗病疫苗候选分子     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单链抗体基因的构建和表达

目的　构建日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单链抗体 (scFv)基因。　方法　通过PCR方法体外扩增并经测序验证的重链、轻链可变区 (VH、VL)基因先后重组入原核表达质粒 pTHA90相应的位点上 ,中间通过一连接肽 (Gly4 Ser) 3基因连接构建成单链抗体基因 (scFv) ,连接产物转化相应受体菌Top1 0 ,提取质粒 ,酶切鉴定重组克隆。表达产物经ELISA方法测定活性。　结果　重组克隆经酶切鉴定可见预期大小的片段 ,表明重组成功。表达产物经ELISA检测 ,OD4 92 值为 1 .0 6 ,高于阴性对照 3倍以上 ,证实具有与相应抗原结合的能力。　结论　成功地构建了scFv基因 ,且其表达产物保留了抗体的亲和性和特异性     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30保护性免疫力持续时间的研究

目的确定日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30主动免疫诱导保护性免疫力的持续时间.方法实验组昆明种小鼠腹腔注射NP30 10 μg/鼠,主动免疫3次,每次间隔2周,对照组腹腔注射生理盐水.末次免疫后8、12、16、20、24周感染日本血吸虫尾蚴(40±1)条,尾蚴感染后40 d行足垫试验.结果 NP30末次免疫后8、12、16周感染日本血吸虫尾蚴的减虫率为21.43%～41.16%,分别与对照组相比差异有显著性;足垫试验结果显示8、12周实验组与对照组差异有显著性.结论 NP30主动免疫诱导的保护性免疫力持续约4个月;足垫试验结果与细胞免疫有关.     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30对虫卵肉芽肿免 …

目的 研究日本血中有虫单克隆抗独特抗体ＮＰ３０对虫卵肉芽肿的影响。方法 ＮＰ３０腹腔注射主动免疫ＩＣＲ小鼠,对照组腹腔注射ＳＰ２／０腹水,分别在尾蚴攻击感染后第４、８、１２、１６、２０、２４周处死,观察和比较虢人虫卵肉肿的形成和演变。应用计算机图像分析技术,测量虫卵肉肿大小。结果 尾蚴攻击感染第１２以后。ＮＰ３０免疫组虫卵肉芽肿的直径明显低于ＳＰ２／０对照组。虫卵肉芽肿的为时相提前,并出现２种特殊     

日本血吸虫单克隆抗抗独特型抗体NP48单特异性双链抗体的构建表达与初步鉴定

目的构建和表达日本血吸虫单克隆抗抗独特型抗体NP48单特异性双链抗体，并初步鉴定表达产物活性。方法应用SOE法扩增双链抗体基因VH-linker—VL（Diabody，简称D）。将D重组入原核表达载体pBAD／g Ⅲ。表达质粒转化E、coli TOP10，左旋阿拉伯糖诱导表达。对D的表达产物进行分离纯化，采用Dot—ELISA法检测纯化蛋白与NP30、可溶性虫卵抗原（SEA）、可溶性成虫抗原（SWAP）的结合活性。结果测序证实双链抗体基因D构建成功；构建了D的原核表达系统，诱导表达产物主要以包涵体形式存在，分子量约为27kD；经纯化、变性复性后用Dot—ELISA法鉴定结果表明，D表达的纯化蛋白可与NP30特异性结合。结论所构建、表达的NP48单特异性双链抗体具有亲本单抗的部分特性。     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30对血吸虫病肝纤维化 …

为研究日本血吸虫单克隆抗独特型抗体ＮＰ３０对血吸虫病肝纤维化的影响，将４５只ＩＣＲ小鼠随机分为两组，实验组腹腔注射ＮＰ３０，对照组腹腔注射ＳＰ２／０腹水。尾蚴攻击感染后第４、８、１２、１６、２０、２４周分别处死小鼠取肝、ＶＧ组化染色和Ⅰ、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白（ＦＮ）免疫组化染色，应用ＮＹＤ－１０００型计算机图像分析系统对肝纤维化程度进行定量测定，实验结果表明，ＶＧ染色显示实验组肝组织胶原的平均光     

日本血吸虫SjPGK基因克隆和序列分析

目的　克隆日本血吸虫磷酸甘油酸激酶 (Sj PGK)编码基因片段 ,分析其核苷酸序列。方法　根据曼氏血吸虫磷酸甘油酸激酶 (Sm PGK) c DNA序列设计并合成一对引物 ,以日本血吸虫成虫总 RNA为模板 ,采用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)特异性扩增 Sj PGK基因片段 ,将其克隆入p MD18- T载体中 ,经双酶切分析和 PCR鉴定 ,将阳性克隆进行脱氧核糖核酸序列测定 ;运用BL AST程序 ,将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与 NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果　 RT- PCR特异性扩增出一条长约 830 bp的条带 ;重组质粒的双酶切和以其脱氧核糖核酸为模板的 PCR均可见一条与 RT- PCR产物相同的条带 ;脱氧核糖核酸序列测定和分析结果表明 :Sj PGK基因片段长为 830 bp,与 Sm PGK的核苷酸同源性为 85 % ,分值为 6 72 ;氨基酸同源性为 94 % ,分值为 4 73。结论　成功地克隆了 Sj PGK编码基因片段 ,为寻找日本血吸虫新的抗感染疫苗候选分子奠定基础     

日本血吸虫磷酸甘油酸激酶基因T/A克隆及序列分析

目的获取日本血吸虫磷酸甘油酸激酶(SjPGK)编码基因片段,分析其核苷酸序列,为日本血吸虫病疫苗研制提供候选抗原分子。方法根据曼氏血吸虫磷酸甘油酸激酶(SmPGK)cDNA序列设计1对引物,采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法,从日本血吸虫成虫总RNA中扩增SjPGK基因片段。利用T/A克隆法,将其克隆入pMD18T载体,经双酶切分析和PCR鉴定,将阳性克隆进行脱氧核糖核酸序列测定;运用Blast程序,将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果RTPCR特异性扩增出1条长约830bp大小的条带;经酶切和PCR鉴定表明所构建的质粒pMD18TSjPGK中含有所扩增的基因序列;脱氧核糖核酸序列测定和分析,SjPGK基因片段长为830bp,与SmPGK的核苷酸同源性为85%,分值为672;氨基酸同源性为94%,分值为473。结论成功克隆SjPGK编码基因片段,为进一步实验提供了条件。     

日本血吸虫CuZn-SOD基因全长cDNA的识别及真核表达载体的构建

目的　识别日本血吸虫大陆株铜锌超氧化物歧化酶 (SjCuZn SOD)基因 ,构建SjCuZn SOD的真核表达载体。方法　将曼氏血吸虫 (Sm )的CuZn SOD全长cDNA序列上网比对 ,寻找Sj相关EST。设计特异性引物从尾蚴cDNA文库扩增相应序列 ,经双酶切、连接、转化 ,克隆入 pcDNA3 .0真核表达质粒 ,并鉴定阳性克隆。　 结果　找到Sj相关EST(登录号BU794891) ,核酸阅读框 (ORF)分析和BLAST比对分析等方法判断为SjCuZn SOD完整的cDNA编码序列 ,含462bp完整阅读框 ,编码 15 4aa。经单双酶切、PCR扩增、核酸测序鉴定 ,验证成功构建了 pcDNA3 .0 SOD真核重组表达载体。　结论　成功构建真核重组表达载体 pcDNA3 .0 SOD ,为在真核表达系统研究SjCuZn SOD基因功能奠定了基础     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆和序列分析

目的　克隆并鉴定日本血吸虫酪氨酸羟化酶(TH)基因,探讨其他信号蛋白在信号传导中对TH的调节及其之间的分子作用机制,从而为血吸虫新型疫苗的设计和药物开发开辟新的途径。　方法　以曼氏血吸虫的 TH cDNA为模板设计引物,以日本血吸虫成虫mRNA为模板逆转录合成cDNA链,将扩增出的日本血吸虫TH蛋白编码基因序列,克隆入 pGEM T easy载体,用单酶双切法和DNA测序进行鉴定,并与曼氏血吸虫的TH基因序列进行同源性比较。　结果　自日本血吸虫RNA经逆转录得到一长度为 480 bp的 DNA片段,经测序与曼氏血吸虫 TH的同源性为 87%。结论　成功扩增出日本血吸虫TH的中间编码区域,为进一步扩增日本血吸虫TH基因全长以及后续实验奠定了基础。     

日本血吸虫14—3—3抗原编码基因的克隆及序列测定

为了寻找日本吸虫病新的诊断和候选疫苗分子,设计合成引物,以日本血吸虫成虫cDNA第一链为模板,用PCR法扩增出日本血吸虫14－3－3抗原（Sj14-3-3）基因编码序列,其大小约784bp,将其克隆入pGEM-T载体,重组质粒pGEM-T-Sj14-3-3经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段,序列测定结果表明具有一个长度为765bp的完整开放阅读框,与曼氏血吸虫14－3－3核苷酸序列有高度同源性。本实验克隆了日本血吸虫14－3－3抗原的编码基因,并进行了序列测定,为进一步研究提供了条件。     

日本血吸虫卵壳蛋白基因的克隆与表达

目的：在体外高效表达具有生物学和免疫学活性的日本血吸虫卵壳蛋白，探讨其作为抗卵免疫靶抗原的可能性。方法：采用PCR技术扩增日本血吸虫卵壳蛋白基因，将其克隆到pcDNA3质粒，在HeLa细胞中高效表达，对表达产物进行鉴定和免疫原性研究。结果：特异扩增日本血吸虫卵壳蛋白基因编码序列（618bp），构建了真核表达质粒pcDNA3／ESG，在HeLa细胞中高效表达卵壳蛋白，其表达量高达24．4％，分子量约为22kDa，dot－ELISA和Westernblot分析显示，表达蛋白能与感染兔血清及虫卵免疫血清产生较强的免疫反应；此外，表达蛋白还能特异刺激经虫卵免疫后的BALB／c小鼠脾细胞增殖，其转化率达44．57％。结论：成功地构建重组质粒pcDNA3/ESG, 并在HeLa 细胞中高效表达卵壳蛋白基因, 表达的重组蛋白具有较强的免疫活性。     

日本血吸虫单克隆独特型抗体的筛选及初步鉴定

目的 从本实验室已建立的IgG类抗日本血吸虫抗原不同表位的单抗中筛选抗独特型抗体NP30的独特型抗体（id,Ab1)。方法 应用间接DLISA经典法,NP30作为抗原包板。加IgG各亚类杂交瘤细胞培养上清孵育,用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗鼠IgG捕捉。结果 单抗NP56与NP30呈阳性反应,NP56的Ig同型为IgG2b。免疫组织化学显示NP56与虫卵内毛蚴头腺及毛蚴膜呈阳性反应。结论 NP56是NP30的特异性id,可用于NP30模拟抗原的鉴定。     

日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定

[目的 ]探索研制血吸虫病疫苗的新路径 ,对日本血吸虫线粒体相关蛋白进行基因克隆及特性鉴定。[方法 ]分析本室筛选日本血吸虫成虫cDNA文库获得的 1个cDNA片段 (Sj338 2 4)的开读框序列 ,在其上下游分别设计引物A和B ,并以该cDNA片段为模板进行PCR扩增后 ,将该片段重组于pGEM T中并进行DNA测序鉴定及检索。再经酶切后将该基因片段亚克隆入表达载体pGEX 6P 1,并进行蛋白表达、纯化及抗原性鉴定。 [结果 ]该目的基因PCR产物全长共 487bp ,其开读框由 45 9bp组成 ,编码 15 3个氨基酸经残基组成的多肽。DNA序列同源性分析发现Sj338克隆基因与人及褐鼠的线粒体外膜蛋白的部分编码基因较高度同源。重组质粒pPEX 6P 1 Sj338能高效融合表达 ,理论蛋白的分子量为 17kDa。SDS PAGE和Westernblotting检测结果表明 ,重组蛋白rSj338具有良好的抗原性。 [结论 ]Sj338可能为日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因 ,重组蛋白有望成为新的疫苗候选分子。