广西藤县人群华支睾吸虫感染调查及其分子鉴定

目的了解广西藤县人群华支睾吸虫的感染状况及其分子鉴定,为当地华支睾吸虫病的防控提供理论依据。方法2016年11月,在广西藤县采用分层整群随机抽样抽取天平镇和金鸡镇各1个自然村作为调查点。收集3岁以上常驻居民的粪便,用改良加藤厚涂片法(一粪三检)检测华支睾吸虫虫卵并计数。通过问卷调查收集被调查者社会人口学等相关信息。从镜检阳性样本中随机选取部分新鲜粪样提取DNA, PCR扩增华支睾吸虫内转录间隔区2 (ITS2),测序后在NCBI核酸数据库作比对分析。结果共调查400人,检出华支睾吸虫虫卵阳性208人,感染检出率为52.0%(208/400),感染者以轻度感染为主(69.2%, 144/208)。天平镇华支睾吸虫感染检出率为66.5%(133/200),高于金鸡镇的37.5%(75/200)(χ2=33.69, P 0.01)。男性感染检出率为58.7%(131/223),高于女性的43.5%(77/177)(χ2=9.18, P 0.01); 30～39岁组感染检出率最高,为63.8%(60/94);高中及以上学历人群感染检出率最高,为68.0%(17/25)。不同年龄组、教育程度人群感染检出率差异有统计学意义(χ2=37.1, 23.02; P 0.01)。PCR扩增出156 bp的华支睾吸虫特异性条带,其序列与越南岘港分离株ITS2 (GenBank登录号:MF319655)的一致性为100%。结论广西藤县人群华支睾吸虫感染检出率为52.0%,属于超重流行区;男性、青壮年是华支睾吸虫高感染人群。广西藤县的华支睾吸虫ITS2序列与越南岘港分离株的基因型一致。     

虫卵ITS-2序列分析鉴别华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的研究

目的建立以分子生物学技术为基础的华支睾吸虫与扇棘单睾吸虫的ITS-2序列分析鉴别方法。方法在华支睾吸虫流行区采集华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫成虫,从成虫虫体分离并收集虫卵。以蛔虫、鞭虫、钩虫、蛲虫做对照虫种,按不同虫种和虫卵数分成5个实验组,各组分别提取DNA,并扩增ITS-2序列,对扩增产物进行测序并作同源性分析以确保为目标片段,根据PCR扩增产物电泳获得的条带判定虫种。结果以华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫虫卵DNA为模板的PCR产物电泳图谱分别在400bp、500bp左右各显示一条明显条带;在以两种虫卵DNA混合液为模板的PCR产物中,电泳图谱在400bp左右和500bp左右各显示明显条带。将测序得到的两种核苷酸序列进行Blast比对后,显示与GenBank中相应的华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫序列高度同源。混入四种肠道线虫虫卵DNA的PCR产物中,除目的条带外,无其他条带。结论该方法可以对华支睾吸虫及扇棘单睾吸虫虫卵进行鉴别,且结果不受常见四种肠道线虫虫卵干扰,敏感性和特异性较高,可作为两虫种的鉴别检测方法。     

改良加藤厚涂片法和PCR法检测华支睾吸虫感染的 效果比较

目的　比较改良加藤厚涂片法（Kato?Katz法）和PCR法对现场人群粪便样本中华支睾吸虫感染的检出率,为华支睾吸虫感染检测方法的选择提供依据。方法　在2016年广西壮族自治区藤县人体华支睾吸虫感染流行病学调查的基础上,随机抽取133份粪便样本,-20 ℃保存。分别采用Kato?Katz法（1粪3检）和PCR法检测华支睾吸虫感染,比较两种方法对华支睾吸虫感染的检出率,采用Kappa分析评价两种检测方法结果的一致性。结果　133份人群粪便样本中,华支睾吸虫感染总检出率为77.44%（103/133）,其中Kato?Katz法检出率为57.14%（76/133）,PCR法检出率为70.68%（93/133）, PCR法检出率显著高于Kato?Katz法（[χ2] = 26.15,P <0.01）。76份Kato?Katz法阳性粪便样本中,88.16%（67/76）的样本PCR法扩增阳性;57份Kato?Katz法阴性样本中,47.37%（27/57）的样本PCR法扩增阳性。PCR法对每g粪便虫卵数（EPG）> 1 000的粪便样本中华支睾吸虫感染的检出率（94.7%,18/19）高于EPG < 1 000的样本（85.96%,49/57）,但差异无统计学意义([χ2] = 1.05,P = 0.436)。两种方法检出率一致性检验结果一般（Kappa = 0.73）。结论　PCR法对人群华支睾吸虫感染的检出率显著高于Kato?Katz法。建议在华支睾吸虫感染度较轻的地区,采用Kato?Katz法结合PCR法进行检测,以提高检出率。     

重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

目的　建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法（RAA）。方法　以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列,设计、合成、筛选特异性引物和探针,建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性;通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增,初步评价其检测现场样本的能力。结果　成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法,其可在39 ℃ 20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板,该方法最低检出限为10 拷贝/μL;以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板,该方法最低检出限为3 pg/μL;以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板,检测结果均为阴性。该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本,具备较好的现场样本检测能力。结论　成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法。     

重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

目的　建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法（RAA）。方法　以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列，设计、合成、筛选特异性引物和探针，建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，评价其检测敏感性；分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，评价其检测特异性；通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增，初步评价其检测现场样本的能力。结果　成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法，其可在39 ℃ 20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板，该方法最低检出限为10 拷贝/μL；以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板，该方法最低检出限为3 pg/μL；以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板，检测结果均为阴性。该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本，具备较好的现场样本检测能力。结论　成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法。     

实时荧光定量PCR检测胆囊结石中华支睾吸虫DNA的研究

目的运用基于Taqman探针实时荧光定量PCR技术检测胆囊结石中的华支睾吸虫DNA。方法选取2012年3～4月份40例实施内镜取石保胆手术患者的胆囊结石,通过傅里叶红外光谱法分析结石成分,对结石研磨涂片镜检观察,并提取其DNA,运用实时荧光定量PCR技术检测华支睾吸虫基因。结果 40例患者的胆囊结石按主要成分可分为胆色素性结石(25例),胆固醇性结石(6例),混合性结石(9例)。结石涂片镜检有23例发现华支睾吸虫虫卵(阳性率57.5%),其中胆色素性结石19例,混合性结石4例。实时荧光定量PCR检测华支睾吸虫DNA阳性率为65.0%(26/40),其中包括23例镜检虫卵阳性标本及3例镜检阴性标本。结论运用实时荧光定量PCR在胆囊结石中检测出华支睾吸虫DNA,敏感性高于镜检法查虫卵。这不仅为华支睾吸虫感染诱发胆囊结石形成提供了分子生物学证据,同时也提供了一种诊断华支睾吸虫感染的有效手段,对胆囊结石病人的病因诊断、临床治疗以及术后预防复发等具有重要的指导意义。     

大连地区华支睾吸虫病流行病学调查

目的调查大连地区北三市（瓦房店、普兰店和庄河）华支睾吸虫病流行情况。方法采集大连地区北三市6种淡水鱼类，通过压片法、动物接种法检查华支睾吸虫感染情况，通过对当地人群粪便检查、体检和问卷调查等方式进行华支睾吸虫感染流行病学调查。结果瓦房店和普兰店2市麦穗鱼（鲤科）、棒花鱼（鲤科）等6种鱼类均发现有华支睾吸虫囊蚴感染，检出率71．5％，鲤科的棒花鱼检出率最高。问卷调查当地居民有生食或半生吃淡水鱼虾的习惯，但粪便检查未发现有感染者。动物解剖检查在2只犬的胆囊中发现华支睾吸虫虫卵。结论大连地区为华支睾吸虫病自然疫源地。     

不同地域株华支睾吸虫基因差异的研究

目的探讨湖北、广东、辽宁和韩国4地华支睾吸虫的基因差异,为华支睾吸虫种下分型提供依据。方法取湖北、广东两地的华支睾吸虫,提取基因组DNA,PCR特异性扩增18S rDNA V4区并测序;登陆GenBank,检索中国辽宁(AF217100)和韩国(AF408144)的华支睾吸虫18S rDNA的登录序列,应用系统发生学分析法对所有序列进行排列比较,分析4地华支睾吸虫的基因差异,并构建系统发生树,分析其亲缘关系。结果获得的湖北和广东两地华支睾吸虫18S rDNA V4区的碱基数分别为392 bp和440 bp。通过对18S rDNA V4区基因序列的比较与进化树的构建,证实4个地域株华支睾吸虫的18S rDNA V4区具有较高的同源性(98%~100%),彼此间遗传距离较小(0~0.013);在系统发生树中,湖北株和广东株华支睾吸虫形成一个支系,韩国株和辽宁株华支睾吸虫形成另外一个支系。结论以18S rDNA V4区为分子标记的DNA序列分析表明,湖北、广东、辽宁和韩国4地华支睾吸虫存在基因差异,但亲缘关系较近,即起源于共同的祖先。     

华支睾吸虫病合并胆结石胆囊炎1例分析

目的了解1例患者出现华支睾吸虫病、胆结石、胆囊炎三联症的有关发病原因与临床表现,分析有关发病因素。方法直接涂片法检查患者T型管引流液中华支睾吸虫卵,kato-katz法检查粪便中华支睾吸虫卵,吡喹酮驱虫药物治疗。结果无论肉眼或镜下对患者T型管引流液中排出的虫体经鉴定结果一致,均为华支睾吸虫成虫。对患者采用吡喹酮总量120 mg/kg体重,3 d分服9次服完的驱虫治疗与对症处理的治疗方案,经治疗半月、1月、3月复查与回访,临床症状与体征消失,治后半月、1月及3月的粪便均未再检获华支睾吸虫卵。结论该患者出现的华支睾吸虫病、胆结石、胆囊炎三联症为有华支睾吸虫病的流行或有发病的地区所少见。     

江西省信丰县华支睾吸虫病和防治相关知识知晓情况调查

目的 了解江西省信丰县华支睾吸虫病和防治相关知识知晓情况,为开展华支睾吸虫病防治工作提供科学依据。方法 以吃“鱼生”习惯为线索调查信丰县华支睾吸虫病潜在流行区,2016年开展人群粪检,并检测淡水鱼囊蚴及淡水贝类雷蚴、尾蚴,同时检查猫、犬和猪等保虫宿主粪便。对华支睾吸虫病防治知识知晓情况进行问卷调查。 结果 信丰县26个村的居民有生食淡水鱼习惯,吃“鱼生”者占调查人数的19.51%,其人群平均华支睾吸虫感染率为21.56%,纹沼螺华支睾吸虫感染率为0,淡水鱼华支睾吸虫感染率为8.24%,保虫宿主华支睾吸虫平均感染率为2.27%。人群华支睾吸虫感染率随年龄升高而呈现上升的趋势,吃“鱼生”与人群华支睾吸虫感染率呈正相关（r = 0.88,P < 0.01）。仅有11.46%的调查对象了解吃“鱼生”会感染华支睾吸虫,知道华支睾吸虫对身体有危害者仅占5.28%。 结论 信丰县5个乡（镇）26个村为华支睾吸虫病流行区;加强华支睾吸虫病危害和感染途径的健康教育、逐步改变居民吃“鱼生”的习惯是控制当地华支睾吸虫病流行的根本措施。     

SYBR Green荧光定量粪检PCR法检测日本血吸虫感染的敏感性研究

目的建立快速、敏感、特异的检测日本血吸虫感染的SYBR Green荧光定量PCR法,准确评估其敏感性。方法将计数的日本血吸虫虫卵掺人健康水牛粪样中,制备人工阳性粪样。采用改良QIAamp DNA Stool Kit粪样DNA提取方法,提取人工阳性粪样DNA,进行SYBR Green荧光定量PCR,建立Ct值与粪样中克粪虫卵数（EPG）的关系;提取单独（不与牛阴性粪样混合）日本血吸虫虫卵DNA与虫卵生理盐水冲洗液DNA,行定量PCR检测,以对本方法进行严格质量控制。结果每200mg粪样仅含1个虫卵时,荧光定量PCR仍呈阳性,人工阳性粪样EPG的对数与PCR的Ct值存在线性关系。结论SYBR Green荧光定量粪检PCR法检测日本血吸虫虫卵DNA敏感性高,EPG对数与PCR的Ct值存在线性关系。     

华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a类抗原基因的克隆、表达和免疫学诊断价值评价

目的采取免疫学方法筛选华支睾吸虫成虫cDNA表达文库,寻找新的抗原基因。方法使用华支睾吸虫病人混合血清以及华支睾吸虫排泄分泌抗原的免疫小鼠血清,分别免疫学筛选华支睾吸虫成虫λ ZAP cDNA表达文库;将阳性噬菌体克隆、测序以及核苷酸序列比对分析;将目的基因的编码区克隆至原核表达质粒pET28a(+)中,采用制备不带N端融合标签的天然蛋白的策略表达融合蛋白,使用组氨酸标签亲和纯化柱（Ni NTA树脂）纯化融合蛋白;采用间接ELISA法,检测血清中的特异性抗体,共检测35例华支睾吸虫虫卵粪检阳性血清,36例正常人血清,15例日本血吸虫、15例卫氏并殖吸虫和13例猪囊尾蚴病人血清,评价重组蛋白的免疫学诊断价值。结果发现华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a（GRA2a）类抗原基因家族,将其中的Cs4抗原基因植入重组表达质粒pET28a(+)的NcoI位点,成功实现融合蛋白的表达,并进一步纯化得到可溶性重组蛋白。采用间接ELISA法检测血清中的特异性抗体,该ELISA法的敏感性为80.0%,特异性为97.2%,总符合率为88.7%;日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴病人血清的假阳性率分别为6.7%、6.7%和7.7%。经核苷酸序列同源性比较,华支睾吸虫GRA2a类抗原是迄今为止尚未进行功能研究的华支睾吸虫特异性抗原。结论发现华支睾吸虫GRA2a类抗原基因家族;成功构建重组表达质粒,并表达、纯化出可溶性重组蛋白;该抗原具有较高的免疫学诊断价值。     

判别分析法在华支睾吸虫病筛查中的应用

目的采用逐步判别分析法建立华支睾吸虫病判别函数,探讨其在华支睾吸虫病筛查中应用的可行性。方法在黑龙江省哈尔滨市木兰县采取整群随机抽样法,抽取10个沿江村屯常住人口作为调查对象,采用改良加藤厚涂片法检测受检者粪便中的华支睾吸虫虫卵。设计华支睾吸虫病调查表,用EpiData 3.1软件建立数据库并录入数据,用SPSS 15.0软件对数据进行判别分析。采用逐步判别分析法筛选变量,然后采用Fisher判别法建立判别函数,通过与改良加藤厚涂片法结果进行对比,评价判别函数的判别能力。结果判别函数中慢性胆囊炎、胆管炎、性别、吃生鱼、腹胀、民族、腹痛、年龄等8个变量有统计学意义,华支睾吸虫病判别正确率为88.75%。结论利用SPSS软件的强大数据处理和分析能力,可以快速简便地建立华支睾吸虫病判别分析函数。该函数具有较高判别分析能力,能够快速筛检本地区华支睾吸虫病患者,同时为其他华支睾吸虫病流行区建立快速筛检模式提供借鉴。     

医院就诊华支睾吸虫病患者的流行特征及风险因素分析

目的探讨黑龙江省就诊患者中华支睾吸虫病的流行现状,并分析风险因素,为制定防治策略提供理论基础。方法收集就诊于黑龙江省哈尔滨医科大学人体寄生虫病研究所的疑似华支睾吸虫病患者2 359人,采用KatoKatz法和酶联免疫法分别检测疑似患者的6 718份粪便样本和2 359份血样,并通过问卷调查收集患者的相关信息。结果疑似患者中华支睾吸虫的感染者为513例;疑似患者感染率在≥29岁人群中较高(P0.05);农村疑似患者感染率和血检阳性率均高于城市(P均0.05);生食鱼虾是感染华支睾吸虫病的风险因素。结论华支睾吸虫病仍然是黑龙江省主要流行的食源性寄生虫病之一,生食或半生食鱼虾的饮食习惯是感染华支睾吸虫的风险因素。     

2种棘球绦虫IgG抗体检测试剂盒应用效果比较

目的 观察不同厂家生产的2种棘球绦虫IgG抗体检测试剂盒的检测效果。 方法 采用2种不同厂家生产的棘 球绦虫IgG抗体检测试剂盒检测相同数量的棘球蚴病人、 正常人血清, 以及卫氏并殖吸虫、 华支睾吸虫、 日本血吸虫和猪囊 尾蚴病人血清, 统计2种方法的特异性、 敏感性和交叉反应性。 结果 2个厂家生产的棘球绦虫IgG抗体检测试剂盒的特 异性和敏感性均为100％。深圳康百得公司生产的试剂盒与卫氏并殖吸虫病、 华支睾吸虫病、 日本血吸虫病和猪囊尾蚴病 的交叉反应率分别为25.00％、 26.09％、 10.00％和87.50％; 珠海海泰公司生产的试剂盒的交叉反应率分别为5.00％、 13.04％、 20.00％和93.75％。2种试剂盒间, 卫氏并殖吸虫病检出率差异有统计学意义 （P ＜ 0.05）, 其他检出率差异均无统 计学意义 （P均 ＞ 0.05）。结论 2个厂家生产的棘球绦虫IgG抗体检测试剂盒均具有敏感性高、 特异性强、 简便快速等优 点; 但需进一步解决与其他寄生虫病的交叉反应问题, 以提高早期诊断的准确性。     

Little effect of praziquantel or artemisinin on clonorchiasis in Northern Vietnam. A pilot study

The first choice for treatment of Clonorchis sinensis infections is praziquantel. Experimental data suggest that artemisinin derivatives are active against C. sinensis. The efficacy of both drugs against clonorchiasis was evaluated in a pilot study in clonorchiasis patients in an endemic area in the North of Vietnam. Twenty-one patients received praziquantel 25 mg/kg o.d. for three days, the regular regimen in that area, and 21 patients were treated with artemisinin 500 mg b.i.d. for 5 days. Faecal egg counts were performed before as well as 6 days and 5 weeks after treatment. In the praziquantel group the faecal egg count decreased significantly from a mean value of 1632 eggs per gram faeces (epg) to 37 epg 5 weeks after treatment (P < 0.01) but, surprisingly, the eradication rate (95% confidence limit) at week 5 was only 29% (11-52%). In the artemisinin-treated group the reduction of the egg count was insignificant: from 1103 to 542 epg (P > 0.05). The proportion of patients (95% c.l.) with C. sinensis eggs in their stool on week 5 was 90% (70-99%) in the artemisinin group and 71% (48-89%) in the praziquantel group (P > 0.05) and the eradication rate (95% c.l.) at week 5 was only 10% (1-30%). With a sensitivity of detection of eggs in stool > 0.89, this implies a statistically significant but clinically unsatisfactory reduction for treatment with praziquantel. Sensitivity is probably less. For artemisinin there was no significant reduction. In conclusion, for human clonorchiasis in the North of Vietnam, the efficacy of praziquantel 25 mg/kg o.d. for 3 days was unsatisfactory and artemisinin for 5 days is not an effective alternative.     

肝脏肝吸虫卵肉芽肿

目的探讨肝脏肝吸虫卵肉芽肿，病理特征。方法6例肝脏肝吸虫卵肉芽肿患者，分析其临床资料，病理常规，免疫组化。结果肝吸虫卵所致的肝脏病变有：①含中央坏死的假结核结节；②体积较大的含大量虫卵的慢性虫卵结节；③脓肿样急性广泛性炎症：④窦道样病变；⑤胆管黏膜被虫卵病变取代；⑥细胆管增生，微虫卵肉芽肿形成等。结论人类肝吸虫感染除虫体外虫卵亦可引起肝脏明显的病变，如各种卵肉芽肿、细胆管增生等，这与日本血吸虫卵所致病变在形态上有一定区别。     

金湖县华支睾吸虫病现状调查

目的了解金湖县华支睾吸虫病流行现状,为制定防治方案提供科学依据。方法在金湖县选择2个监测村,采用改良加藤法对居民进行粪检,同时采用ELISA法进行血清学检查,对血清学阳性而粪检阴性者再粪检复查。采用压片镜检法检测中间宿主淡水鱼感染华支睾吸虫囊蚴情况。收集保虫宿主猫、犬粪便进行病原学检查,同时开展流行因素及病例调查。采用Epidata3.02、Excel2003和SPSS15.0软件进行数据处理和统计学分析。结果血清学共检测514人,阳性75人,阳性率14.59%。其中男性阳性率为10.38%,女性为17.55%,两者差异有统计学意义(P0.05);除6～岁年龄组未发现阳性者外,其余各年龄组均有阳性;农民和学生阳性率分别为14.20%和25.00%。粪检451人,发现华支睾吸虫感染者3例,感染率为0.67%。检测淡水鱼3种共119条,感染率为6.72%。检测猫、犬粪便11份,均未发现华支睾吸虫卵。结论金湖县属华支睾吸虫病低度流行区,且存在潜在流行因素。防治的重点是加强宣传教育,养成良好的饮食习惯。     

中华按蚊击倒抗性突变PCR检测方法的建立

目的建立可靠的中华按蚊拟除虫菊酯击倒抗性的PCR检测方法。方法基于课题组前期研究发现的拟除虫菊酯抗性中华按蚊钠离子通道蛋白（VGSC）L1014位点的突变机制,即TTG突变为TTT和TGT,设计特异AS-PCR引物,进行中华按蚊拟除虫菊酯杀虫剂抗性突变检测。结果设计的AS-PCR引物和建立的反应体系可以分别扩增出现已发现的中华按蚊击倒抗性的TTG（T）杂合、TTT纯合、TG（T）G（T）杂合、TG（T）T杂合,PCR电泳图结果与测序图结果一致。结论成功建立中华按蚊击倒抗性突变的PCR检测方法,可用于现场中华按蚊的击倒抗性检测。