大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及成骨成脂诱导

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离、纯化、扩增的方法及诱导BMSCs成骨成脂分化,提供理想的组织工程种子细胞。方法采用贴壁筛选法分离BMSCs,通过不断传代进行纯化和扩增培养,并绘制细胞生长曲线。诱导后检测油红O染色和矿化结节。结果 BMSCs在体外分离培养扩增,细胞形态为长梭形,流式检测分析P3和P5细胞表面标记物CD44、CD90为阳性,CD45为阴性。细胞生长曲线呈S形。经成脂诱导培养,脂肪的特异性油红O染色为阳性;经成骨诱导培养,形成了矿化结节。结论本实验分离培养的细胞具有BMSCs的表面标记特征和诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的潜能,为BMSCs在组织工程中的应用提供基础理论和实验依据。     

人骨髓间充质干细胞体外诱导培养成骨的实验研究

目的 观察人骨髓间充质干细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法 抽取人骨髓组织，梯度离心后，保留贴壁细胞传代，稳定传代后改用含地塞米松、β—甘油磷酸钠和维生素C的诱导培养液，通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色、骨钙素免疫组化染色等方法进行观测。结果 原代人骨髓间充质干细胞10～12d左右即可长满，并可稳定传代，传代细胞5～6d即可传代，在诱导培养液中2周形成多层结构，并聚集成细胞钙化结节。诱导培养细胞碱性磷酸酶染色，骨钙素免疫组化染色阳性。结论 人骨髓间充质干细胞经合理的体外诱导培养后，符合成骨细胞的形态特征和生物学特性，可为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞。     

大鼠颅骨骨缝间充质干细胞与骨髓间充质干细胞成骨及成脂能力比较研究

目的 分离培养大鼠颅骨骨缝间充质干细胞(CSSCs)、骨髓间充质干细胞(BMSCs),比较两种间充质干细胞体外成骨、成脂诱导的差异.方法 采用出生后5天的SD大鼠,分离培养CSSCs和BMSCs,并进行鉴定.体外对CSSCs和BMSCs进行成骨成脂诱导,采用免疫荧光检测,碱性磷酸酶(ALP)染色,茜素红染色,油红O染色...     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的采用原代培养符合实验要求的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,进行生物学特性分析,为进一步骨组织工程实验研究奠定基础。方法采用全骨髓冲洗手段,结合密度梯度离心与贴壁培养方式体外分离兔BMSCs,倒置显微镜观察细胞形态,MTT绘制细胞生长曲线,ALP染色试剂盒检测细胞成骨性能。结果原代培养12d后可获得纯化的兔BMSCs,经成骨条件培养液诱导培养后,形态相对稳定,具有成骨性能。结论采用骨髓冲洗结合密度梯度离心与贴壁培养方式能够成功分离培养大量较纯化的兔BMSCs,第1～3代细胞体外培养生长状态好,形态稳定且贴壁率较高,可以作为后续骨组织工程实验种子细胞。     

成人骨髓间充质干细胞体外培养及诱导分化的研究进展

目的 探讨成人骨髓间充质干细胞体外培养及诱导分化的研究现状及发展前景.方法 查阅国内外公开发表的相关文献,进行分析、归纳、总结.结果 成人骨髓间充质干细胞可在体外大量扩增,并诱导分化为骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等多种组织细胞.结论 成人骨髓间充质干细胞具有成为种子细胞的潜力,在细胞移植方面有广阔前景.     

人骨髓间质干细胞体外培养及诱导成骨的鉴定

目的 优化人骨髓间质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)体外分离培养方法,对hBMSCs体外培养及诱导成骨能力进行鉴定.方法 密度梯度离心法分离hBMSCs,流式细胞分析法(FACS)对细胞表面抗原、细胞活力、细胞周期进行检测.以含地塞米松(1×10-7 mmol/L)、β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)、抗坏血酸(35.22 mg/L)的DMEM培养液对hBMSCs进行诱导分化,相差显微镜和透视电镜观察细胞形态,Gomori钙钴法进行碱性磷酸酶染色(ALP),免疫组化检测Ⅰ型胶原,茜素红法进行钙结节染色.结果 hBMSCs可在体外分离扩增,表达CD44、CD105和CD106,不表达CD34和CD45,细胞活力为92.3%,G0-G1细胞占94.2%.经成骨培养液诱导后细胞形态由长梭形向多边形转变,ALP染色、Ⅰ型胶原染色及钙结节染色均为强阳性.结论 hBMSCs可在体外长期、稳定培养,具有向成骨细胞分化的潜能.     

体外培养大鼠骨髓间充质干细胞成骨基因表达谱的检测

目的:探讨体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)成骨相关基因的表达谱,明确体外培养大鼠骨髓MSC的成骨潜能。方法:体外培养SD大鼠骨髓MSC,取第3代细胞提取总核糖核酸(RNA),制备杂交探针,并运用SuperArray公司提供的大鼠Oligo GEArray骨再生基因芯片(每张芯片可测113种基因)进行杂交,化学发光检测,通过X线胶片或台式扫描获得化学发光的芯片图像,使用网上提供的综合型GEArry表达分析配套软件(GEArryExpression Analysis Suite)进行完整的芯片数据分析。结果:检测体外培养大鼠骨髓MSC的113种成骨相关的基因,其中有31种基因表达强度较低,45种基因呈中等强度表达,37种基因表达强度较高。结论:体外培养大鼠骨髓MSC具有部分成骨细胞基因表型特征,但成熟成骨细胞的特征基因表达量较低,提示大鼠MSC是具有较强成骨细胞分化潜能的成纤维样细胞。     

人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化

目的: 建立体外分离培养获得人脂肪间充质干细胞（human adipose derived mesenchymal stem cells,hADSCs）的方法,并观察其形态、免疫表型、生物学特性。初步探讨其体外成骨过程中出现成脂现象的原因及机制。方法 ： 剖宫产手术获得腹部皮下脂肪,0.15%Ⅰ型胶原酶消化法获得人脂肪间充质干细胞并进行体外培养。行MTT细胞增殖实验绘制增殖曲线,使用流式细胞及细胞免疫荧光技术检测细胞表面抗原,行成骨成脂分化鉴定其分化潜能。通过RT PCR技术检测成骨成脂过程中过氧化物酶体增殖物激活受体γ 2（peroxisome proliferator activated receptorγ 2,PPARγ 2）和骨桥蛋白mRNA表达情况。结果 ： 通过分离培养,获得了大量旋涡状生长的人脂肪间充质干细胞。MTT法显示细胞增殖能力强。流式细胞鉴定结果显示,CD29、CD73、CD105、CD166高表达,CD31、CD34、CD45、HLA DR低表达。细胞免疫荧光结果与之相符。hADSCs在特定诱导条件下,具有成骨成脂分化潜能。在成骨分化过程中同时伴有成脂发生。RT PCR结果显示,与对照组相比,成脂诱导组PPARγ 2 mRNA有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,成骨诱导组骨桥蛋白,PPARγ 2 mRNA均有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义（P<0.01）。结论： 建立了一种分离培养hADSCs简单可靠的方法。获得的细胞具有贴壁生长、增殖活性强、干细胞表型以及多向分化等特征。hADSCs体外成骨过程中,三酰甘油的形成对成骨具有一定的促进作用。     

人骨髓间充质干细胞体外增殖及成骨分化的增龄变化

目的观测年龄对人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)体外增殖、成骨分化的影响.方法使用密度梯度离心法分离不同年龄人骨髓MSCs进行培养,保留贴壁细胞传代,观察细胞生长情况,检测其增殖活性、细胞周期、碱性磷酸酶活性.结果低龄hMSCs较高龄hMSCs体外生长快、增殖期比例大、MTT及碱性磷酸酶活性高.结论hMSCs的增殖和成骨分化的能力和活性随着年龄的增加而降低,建立其参数可满足组织工程种子细胞在临床应用中不同患者的要求.     

兔骨髓间充质干细胞分离培养及向成骨细胞表型的诱导分化

目的观察兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养增殖的生长特征及体外诱导条件下的成骨能力情况.方法抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液,经密度梯度离心分离出MSC,用塑料培养板贴壁培养进一步纯化MSC,并培养增殖.观察MSC的生长特征,测定其生长曲线及贴壁率.对第2代MSC进行成骨矿化诱导,测定其碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨矿化情况.结果MSC为贴壁生长,以均一的梭形的成纤维细胞样生长,增殖能力强.在成骨诱导剂作用下,MSC具有成骨能力,诱导后ALP活性明显提高,并且出现矿化结节.结论获得的兔骨髓MSC生长增殖旺盛,分离培养MSC是可行的,且MSC具成骨分化潜能.     

小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养和鉴定

目的采用全骨髓贴壁培养法分离和体外培养小鼠骨髓间充质干细胞,并通过形态学观察和排除鉴定法进行初步鉴定。方法无菌分离小鼠胫骨和股骨,剪开骨干骺端,用RPMI1640培养基反复液冲洗骨髓腔,收集并过滤离心。DMEM—LG培养基重悬细胞,将细胞悬液转入0．1％明胶包被的培养瓶中,37℃,5％CO2常规进行原代培养并传代。在培养过程中,取不同代数的细胞做CD45流式标记鉴定。结果采用全骨髓贴壁培养法获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化。第4-5代骨髓间充质干细胞形态单一均匀,呈典型的极性漩涡状生长,并不表达白细胞标志抗原CD45。结论本实验可稳定获得均质性良好的小鼠骨髓问充质干细胞,并初步通过鉴定。     

大鼠骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)最佳的体外分离培养方法,并研究其基本的生物学特性。方法采用密度梯度离心和贴壁培养两种方法分离大鼠的MSCs,进行形态学观察及增殖生长方面的测定;免疫细胞化学染色鉴定表面标志。结果大鼠MSCs体外培养呈梭形;细胞生长曲线为“S”型;密度梯度离心法原代培养15d达到80%～90%的融合,而改良的直接贴壁法只需要5d;细胞周期显示G0/G1期88.29%;免疫细胞化学染色显示CD44表达阳性,CD34、CD45为阴性。结论两种方法均可获得骨髓间质干细胞,但贴壁培养法操作更简便、快速,具有对细胞活性影响较小,更利于其贴壁和增殖的优点。MSCs体外培养条件下生长性状稳定,适于做组织工程的种子细胞。     

犬骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定

[目的]探讨分离、培养、纯化和鉴定犬骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）方法,观察MSCs体外生长特征。[方法]自犬髂后上棘抽取骨髓约10ml,1．073g／ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过及时、反复传代对MSCs进行纯化和扩增培养,测定生长曲线,并进行形态学观察。流式细胞仪检测扩增后MSCs细胞周期及表面抗原特性。[结果]MSCs在含10％小牛血清的IMEM中生长性状相对稳定,1、3、5代细胞生长曲线基本一致,增殖速度快。流式细胞仪检测表明MSCs强表达干细胞标记CD44,而不表达造血干细胞特异抗原CD34、CD11a、CD14和HLA-DR。第2代（P2）末MSCs周期显示有82．4％的细胞处于G0／G1期。[结论]密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离、纯化和培养犬骨髓MSCs。     

大鼠骨髓间质干细胞的BrdU体外标记和体内示踪研究

目的探讨骨髓间质干细胞(BMSCs)的体外标记和体内示踪技术。方法分离培养并鉴定大鼠BMSCs,进行5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记后,体外培养被标记的BMSCs,观察其连续传代后的BrdU可标记时间和标记效率;建立大鼠胃黏膜损伤模型,将分离纯化的BrdU标记BMSCs移植到损伤的胃黏膜下,体内观察BrdU对活体移植BMSCs的示踪作用。结果免疫组化显示体外培养大鼠BMSCs的CD44、CD90表达阳性,CD14、CD45表达阴性,显微结构表现出干细胞特征。进行BrdU标记后,标记阳性率随标记时间延长而增高,48h达高峰,72h仍维持高阳性率。终浓度为10μmol/L的BrdU孵育48h、72h阳性标记率高于5μmol/L BrdU组(P<0.05),但与15μmol/L BrdU组阳性标记率差异无统计学意义(P>0.05),并且连续传代培养21d后也可检测到。BrdU可示踪BMSCs在损伤的胃黏膜下局部定植。结论 BrdU在浓度为10μmol/L、标记时间48h至72h标记效率较高;BrdU标记可用于一定时间段内BMSCs移植入体内后定植和生长的动态示踪观察方法。     

淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的:探讨淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法:采用差速贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定表面标志。取第3代细胞加入10-6mol/L淫羊藿苷培养基,对照组仅加入等量普通培养基进行培养。通过镜下观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞表面标志,碱性磷酸酶试剂盒测定诱导细胞碱性磷酸酶活性,组织化学染色观察钙化结节形成能力。结果:体外培养的细胞表达CD29、CD44、CD105、CD166。淫羊藿苷诱导组细胞碱性磷酸酶呈阳性反应并有钙化结节形成,而对照组未见钙化结节形成。结论:淫羊藿苷能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,可视为一种良好的骨诱导活性因子。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与原代培养

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的体外分离与原代培养过程中应注意的问题。方法全骨髓贴壁培养筛选法分离和培养大鼠BMSCs,通过不断换液及传代纯化培养的细胞。结果大鼠BMSCs传至P3代后,形态为均匀分布的梭形成纤维样细胞。结论全骨髓贴壁培养筛选法操作简便,需要的骨髓量少,原代培养时更符合细胞生长的微环境,是培养大鼠BMSCs的理想方案。     

人骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化条件的优化研究

目的探讨使人骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞诱导分化的高效诱导体系。方法按照不同浓度的地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C分将实验为4组,并设立空白对照组,诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化,应用碱性磷酸酶钙钴法染色检测分化的成骨细胞的成骨特性。结果在地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸钠10-2mol/L、维生素C 3×10-4mol/L时,积分光密度值最高。结论 MSCs具备较强的增值能力和良好的成骨特性,可为骨缺损修复技术优化提供基础。     

脂肪干细胞的分离提取、鉴定及与脂肪颗粒的混合移植研究

目的分离提取脂肪干细胞(ADSCs),对其进行成脂、成骨的鉴定,并与脂肪颗粒混合移植,观察移植后的脂肪组织的存活情况。方法取大鼠腹股沟脂肪,磷酸盐缓冲液清洗,0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化1 h,离心,取沉淀,用含10%血清的DMEM培养基进行培养、传代,取第3代ADSCs用于成脂、成骨鉴定;另取第3代ADSCs用于移植,分为两组:ADSCs(密度为5×107/mL)0.9 mL+脂肪颗粒0.6 mL组、脂肪颗粒1.5 mL组,分别移植于大鼠背部两侧,共移植24只大鼠,分别于2周、1、3个月时脱颈椎处死8只大鼠,再取出背部脂肪组织。结果大鼠ADSCs成脂、成骨诱导后,经油红O、茜素红染色呈阳性,移植2周、1个月时,两组取出的脂肪组织的体积变化不大;但移植3个月后,取背部脂肪组织,称重:脂肪颗粒1.5 mL组平均重量为(0.4551±0.0024)g,而ADSCs(密度为5×107/mL)0.9 mL+脂肪颗粒0.6 mL组的平均重量为(0.7798±0.0033)g,两组脂肪组织的重量差异有统计学意义(P<0.05)。结论原代分离、培养的ADSCs生长状况良好,具有向成脂、成骨分化的能力,与脂肪颗粒混合移植后组织的存活率高,并能够改善脂肪颗粒单独移植时的液化吸收情况。     

山羊骨髓间充质干细胞分离培养及向软骨细胞诱导分化

目的 探讨体外分离、培养山羊骨髓间充质干细胞(BMSCs),并将其诱导分化为软骨细胞表型,明确其向软骨细胞分化的能力.方法 抽取10月龄健康中国青山羊骨髓,贴壁法培养BMSCs,体外培养至第4代时进行流式细胞术鉴定,并加入成软骨诱导培养基,其成分包括10% FBS高糖DMEM培养基、6.25 μg/ml 胰岛素、6.25 μg/ml 转铁蛋白、50 μmol/ml抗坏血酸、100 nmol/L地塞米松及10 ng/ml TGF-β1.分别于0、1、2、4周行细胞化学染色、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹试验(Western blot)检测II型胶原和Aggrecan的表达.结果 山羊BMSCs生长良好,传至第4代时细胞纯度较高.加入诱导培养基后,山羊BMSCs在1、2、4周均可看到软骨细胞表型的表达,并且随着时间的延长,其II型胶原及Aggrecan基因和蛋白的表达量逐渐增加,2周时即可达到较好的诱导效果.结论 本实验采取一种简易的方法 分离、培养并向软骨细胞方向诱导分化山羊BMSCs,证实其具有分化为软骨细胞的潜能,为山羊用于骨软骨组织工程的体内研究提供了实验基础.