识别α-synuclein N端结构域的单克隆抗体鉴定及免疫应用

目的 分析5种识别α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)N端结构域的单克隆抗体1C16、2B8、2P21、3O18和1J6的特异性,为帕金森病(Parkinson’s disease, PD)的早期诊断和免疫治疗提供抗体支持。方法 体外蛋白重组技术获得人源α-syn蛋白(human-α-syn, h-α-syn)、鼠源α-syn蛋白(mouse-α-syn, m-α-syn)、β-syn蛋白、N端人源α-syn蛋白(α-syn/N)和去N端人源α-syn蛋白(α-syn/ΔN)。斑点印迹法鉴定5种单克隆抗体的特异性识别结构域,使用蛋白质印迹技术检测其对变性后的纯蛋白和鼠脑组织的识别情况。结果 抗体1C16可以识别非变性的h-α-syn纯蛋白和小鼠脑组织中的变性的h-α-syn蛋白,不识别m-α-syn和β-syn。抗体1J6仅识别非变性的h-α-syn及α-syn/N纯蛋白,不识别变性后的全长α-syn纯蛋白和小鼠脑组织中的变性h-α-syn蛋白。结论 筛选出的2种单克隆抗体具有特异性,可为本实验下一步生物标志物的酶联免疫吸附法测定检测和针对α-syn的免疫治疗提供基础...     

129位丝氨酸磷酸化α-突触核蛋白DELFIA检测方法的建立及初步应用

目的 建立解离-增强镧系荧光免疫分析 (dissociation enhanced lanthanide fluorescent immunoassay,DELFIA)检测129位丝氨酸磷酸化α-突触核蛋白的方法及初步应用。方法 使用体外蛋白重组技术纯化得到人源α-syn蛋白单体(α-syn),用Polo 样激酶催化α-syn获得磷酸化α-syn单体(phosphorylated α-syn monomer,p-α-syn),用4-氧代壬烯醛制备α-syn聚集体(aggregates of α-syn,OW)及磷酸化α-syn聚集体(aggregates of p-α-syn,OP)。使用Western blotting法和间接ELISA方法验证本实验室前期制备的识别α-syn蛋白N端的多克隆抗体SN16和识别129位丝氨酸磷酸化α-syn蛋白的单克隆抗体C140S。使用SN16作为捕获抗体,C140S作为检测抗体的双抗夹心DELFIA法建立检测OP的标准曲线,并检测Thy1-α-SYN转基因小鼠血浆内OP的变化。结果 考马斯亮蓝染色和Western blotting法检测结果显示体外纯化的人源α-syn蛋白单体(17 000)纯度高,并通过催化获得了p-α-syn、OW和OP纯蛋白,均可用作建立标准曲线的标准抗原。Western blotting和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)结果显示SN16 对α-syn、p-α-syn、OW、OP这4种形式的蛋白均可识别,C140S可以识别p-α-syn和OP,说明SN16和C140S可以用作双抗夹心法的配对抗体。间接DELFIA检测结果显示C140S对OP的识别效率更好。双抗夹心DELFIA检测结果显示,SN16-C140S作为配对抗体检测标准抗原的范围为:0.625~20 ng/mL,并建立了检测OP的标准曲线。Wt及Tg组小鼠血浆中OP在12月龄均较6月龄有所增加(P<0.001),Tg组6月龄小鼠血浆中OP显著高于同月龄Wt组(P<0.001),Tg组12月龄小鼠血浆OP较Wt组有增高的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 本文建立的SN16-C140S配对的双抗夹心DELFIA体系可以检测Thy1-α-SYN转基因小鼠血浆中聚集的磷酸化α-syn变化情况。     

大鼠Ins1基因启动子区域DNA甲基化状态的研究

目的:研究大鼠Ins1(Insulin 1)基因启动子在各种组织中DNA甲基化的状态及在转化分化过程中甲基化的变化情况,为从表观遗传学方面研究Ins1基因表达调控的机制奠定基础。方法:通过RT-PCR检测大鼠胰岛、大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)及大鼠肝干细胞(WB)中Ins1基因的表达情况。采用重亚硫酸盐测序法分析这三种细胞位于转录起始位点上游400 bp的Ins1基因启动子区域DNA甲基化的状态,并用焦磷酸测序法分析大鼠肺、脾、皮肤、小肠、脂肪和肝脏组织的甲基化状态及WB细胞转入PDX1慢病毒后甲基化的变化情况。结果:大鼠胰岛和INS-1细胞中Ins1基因高表达,启动子区域的甲基化程度非常低,而在大鼠肺、脾、皮肤、小肠、脂肪、肝脏组织和WB细胞中Ins1基因不表达,启动子区域的甲基化程度很高,当WB细胞转入PDX1慢病毒后可使Ins1基因启动子区域的甲基化程度降低。结论:Ins1基因的表达受甲基化调控,PDX1单个转录因子虽可降低Ins1基因甲基化程度但并不能使其完全去甲基化并表达Ins1基因。     

大鼠不同脑区线粒体中α-突触核蛋白含量与各种氧化和抗氧化指标的关系

目的分析大鼠不同脑区线粒体中α-突触核蛋白(α-synuclein,α-SYN)含量与氧化应激水平及其相互关系,探讨帕金森病(Parkinson’s disease,PD)选择性损伤神经元的原因。方法采用Percoll密度梯度离心法提取脑组织线粒体、Western blotting法和ELISA法测定线粒体中α-SYN含量;通过检测脑组织主要氧化指标丙二醛(malonaldehyde,MDA)和抗氧化指标总抗氧化能力(total anti-oxidation capability,T-AOC)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的含量判定氧化应激水平。结果不同脑区线粒体中的α-SYN含量不同,其中,PD易损区纹状体、海马与嗅球中的线粒体中α-SYN的含量较高,而PD非易损区额叶皮质和小脑中的线粒体中α-SYN含量较低,易损区与非易损区线粒体中的α-SYN含量的差异有统计学意义。不同脑区各种氧化和抗氧化指标应有所不同,但差异无统计学意义,与线粒体中的α-SYN含量没有明显关系。结论不同脑区线粒体中α-SYN含量不同,但与氧化应激水平无相关性。     

焦磷酸测序检测RARβ2基因启动子甲基化方法的建立

目的：建立基因启动子甲基化的焦磷酸测序检测方法,为基因启动子甲基化标志物的检测奠定基础。方法：从正常人全血中提取基因组DNA。采用复合巢式PCR的方法扩增目的基因,克隆构建对照标准品质粒。使用甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2基因启动子CpG岛的5个甲基化位点,双脱氧测序验证。将阳性和阴性对照标准品质粒PCR扩增产物按不同比例混合后进行焦磷酸测序,检测每个点的甲基化程度,制作校正曲线。结果：构建了甲基化特异性焦磷酸测序阴性对照和阳性对照标准品。经焦磷酸测序检测后,阴性对照标准品甲基化程度为0％,阳性对照标准品甲基化程度为100％,与双脱氧测序结果一致。经对混合样品检测,甲基化频率符合线性关系,线性相关性大于0.99,斜率约为1,并且所有位点的标准偏差约为1％。结论：成功构建了甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2启动子区域甲基化阳性对照和阴性对照标准品质粒。建立了甲基化特异性焦磷酸测序检测基因启动子甲基化的方法。     

α-突触核蛋白和葡糖脑苷脂酶在食蟹猴不同脑区的表达

目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)及葡糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase,GCase,GBA)在食蟹猴不同脑区的表达。方法 Western blotting方法及免疫组织化学法检测α-Syn和GBA在食蟹猴纹状体和小脑皮质的表达。酶活性分析法检测GBA活性。免疫荧光双重标记法观察α-Syn和GBA的共定位。结果α-Syn和GBA在胞质和神经末梢中存在共定位。α-Syn、GBA在纹状体和小脑部位均有表达,但α-Syn在纹状体表达量高于小脑,而GBA在纹状体表达量低于小脑。此外,纹状体的GBA酶活性低于小脑。结论不同脑区α-Syn、GBA表达量不同,α-Syn表达量与GBA表达量呈反向关系。     

亚硝基化的二硫键异构酶介导甲基苯丙胺致小鼠相关脑区α-突触核蛋白表达升高

目的 研究亚硝基化的二硫键异构酶(PDI)对甲基苯丙胺(METH)致小鼠海马及纹状体区α-突触核蛋白(α-SN)表达的影响.方法 利用C57小鼠METH亚急性中毒模型,使用一氧化氮合酶(NOS)抑制剂N-硝基-L-精氨酸(L-NNA)与METH共同造模,实验分为对照组、L-NNA组、METH组、METH+L-NNA组.Western Blotting技术检测各组海马及纹状体区内一氧化氮合酶(NOS)、PDI及其S亚硝基化(PDI-SNO)和α-SN表达情况.一氧化氮试剂盒检测各组一氧化氮含量.结果 METH给药后NOS、一氧化氮含量、PDI-SNO、α-SN表达较对照组均明显升高(P<0.05);L-NNA与METH共处理后与METH组对比,NOS表达下降(P<0.05),一氧化氮含量明显减少(P<0.05),能够显著抑制PDI-SNO表达(P<0.05),伴随α-SN表达降低(P<0.05).而MET H+L-NNA组、L-NNA组与对照组比较均无明显差异(P>0.05).结论 METH作用后诱导NOS活化,一氧化氮含量升高, PDI发生显著S亚硝基化而功能失活,导致相关脑区α-SN表达升高,而NOS抑制剂L-NNA能部分缓解METH神经毒性作用.     

一种检测帕金森患者血浆促进α-突触核蛋白寡聚体形成能力的方法

目的 建立一种检测帕金森病（Parkinson＇s disease,PD）患者血浆促进外源性α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）寡聚体形成的方法.方法 利用本室自制的鼠抗人α-Syn单克隆抗体建立检测α-Syn寡聚体的酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent,ELISA）方法.将不同质量浓度（200、100、50、25、12.5 μmol/L）重组人α-Syn在正常人和PD患者血浆中分别振荡孵育（37 ℃、280 r/min）24、48、72、96 h.用所建立的ELISA法检测振荡后血浆中的α-Syn寡聚体含量.结果 所建立ELISA方法可以特异性检测α-Syn寡聚体,不识别α-Syn单体.重组人α-Syn在质量浓度为100 μmol/L、血浆稀释3倍以下、振荡孵育48 h条件下可以在PD患者血浆中形成较多的寡聚体,并与对照血浆中形成的α-Syn寡聚体含量对比差异最大.结论 成功建立了一种检测PD患者血浆促进α-Syn寡聚体形成能力的方法,该方法可以用于诊断PD患者血浆的潜在病理变化.     

菖蒲郁金汤对帕金森病小鼠的神经保护作用及机制探讨

[目的] 观察菖蒲郁金汤对帕金森病(Parkinson‘s disease,PD)小鼠的治疗作用以及对多巴胺(dopamine,DA)能神经元的保护作用,并探讨其可能的作用机制。[方法] 将36只C57BL/6雄性小鼠随机分为正常对照组、MPTP模型组、菖蒲郁金汤组,每组12只。MPTP模型组和菖蒲郁金汤组采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)腹腔注射,30 mg/(kg·d),连续7 d,建立PD小鼠模型,正常对照组给予等量0.9%氯化钠溶液腹腔注射,连续7 d。菖蒲郁金汤组在MPTP注射的同时开始给予20 g/(kg·d)菖蒲郁金汤灌胃21 d,MPTP模型组和正常对照组分别在MPTP、0.9%氯化钠溶液注射的同时给予20 g/(kg·d)的0.9%氯化钠溶液灌胃21 d。最后给药结束后1、7和14 d时对各组小鼠分别进行行为学评价。14 d时处死小鼠,取小鼠中脑黑质部位脑组织,应用酪氨酸羟化酶免疫组化染色检测DA能神经元存活数目,免疫印迹法检测α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)和自噬特异性蛋白微管相关蛋白1轻链3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3 Beta,LC3B)的蛋白表达;取纹状体脑组织,电镜观察神经元超微结构变化及自噬小体。[结果] 与MPTP模型组比较,菖蒲郁金汤组小鼠1、7、14 d时爬杆时间缩短(均P＜0.05),旷场试验的总距离和旷场平均速度均增加(均P＜0.01),7、14 d时悬挂实验分值增加(均P＜0.05);菖蒲郁金汤组小鼠中脑黑质DA神经元存活数目增加(P＜0.01),而且染色浓度增加,α-Syn蛋白表达下调(P＜0.01),微管相关蛋白1轻链3B-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3 Beta-Ⅱ,LC3B-Ⅱ)/微管相关蛋白1轻链3B-Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light chain 3 Beta-Ⅰ,LC3B-Ⅰ)比值增加(P＜0.01)。电镜显示,与MPTP模型组比较,菖蒲郁金汤组纹状体神经元胞质水肿、空泡变性现象减轻,线粒体膜结构相对完整,可见自噬溶酶体。 [结论] 菖蒲郁金汤可有效减轻PD小鼠行为症状,对DA能神经元具有保护作用,通过增强神经元细胞的自噬活性从而促进异常聚集α-Syn的自噬性清除可能是其主要作用机制。     

早发型帕金森病患者红细胞α-突触核蛋白水平及临床意义研究

目的 探讨早发型帕金森病患者外周红细胞α-突触核蛋白水平是否存在特异性改变。方法 纳入47例早发型帕金森病患者,52例健康受试者。采集受试者外周静脉血标本并分离红细胞,用电化学发光免疫法检测红细胞中α-突触核蛋白水平。对其中25例早发型帕金森病患者进行随访,2年后再次采集静脉血标本和临床评估。结果 早发型帕金森病患者红细胞总体和聚集体形式的α-突触核蛋白水平均显著高于健康对照组[总体1.28(0.94, 2.13)vs 0.57(0.41, 0.70),P<0.001;聚集体202.18(152.16, 244.22)vs 128.40(107.61, 157.02),P<0.001]。2年随访后帕金森病患者运动功能和认知功能较基线无显著进展,而红细胞聚集体形式的α-突触核蛋白水平较基线时特异性升高[211.66(159.71, 263.73)vs 170.12(139.31, 233.42),P=0.046]。结论 外周红细胞α-突触核蛋白检测对于早发型帕金森病同样具有较好诊断价值,进一步证实上述指标是诊断帕金森病潜在的生物标志物。     

α-突触核蛋白促进原代神经元及转基因小鼠神经细胞表面NMDA受体的内在化

目的在原代培养神经元及转基因动物水平上,研究α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）对神经细胞表面N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）受体的影响及其机制。方法免疫荧光标记法和Western blotting测定NMDA受体（NMDA receptor,NMDAR）和Rab5B质量分数。Rab5B反义寡核苷酸抑制Rab5B基因表达。以原代培养神经细胞及转基因小鼠为模型,观察α-Syn蛋白增多对细胞膜NMDAR质量分数的影响以及Rab5B的作用。结果在细胞及动物水平,α-Syn明显上调Rab5B表达,促进NMDAR的内在化。而抑制Rab5B表达可消除α-Syn致NMDAR的内在化。结论α-Syn通过上调Rab5B的表达促进NMDAR的内在化。     

不同亚型的帕金森病及多系统萎缩患者血浆α-突触核蛋白寡聚体浓度分析

目的 比较不同亚型帕金森病（Parkinson's disease,PD）和多系统萎缩（multiple system atrophy,MSA）患者血浆促进α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）寡聚体形成的能力。方法 选择性别与年龄匹配的健康受试者（Control）、震颤为主型PD（tremor dominant,PD-TD）、姿势不稳与步态困难为主型PD（postural instability gait difficulty,PD-PIGD）、小脑萎缩型MSA（MSA of cerebellar type,MSA-C）和混合型MSA（MSA between cerebellar and parkinsonism type,MSA-C+P）患者各10例,抽取血浆,与重组人α-Syn振荡孵育。Western blotting法和ELISA法检测各组α-Syn寡聚体形成量。结果 PD和MSA组α-Syn寡聚体形成量显著高于对照组（P<0.05）。虽然PD组α-Syn寡聚体形成量略高于MSA组,但差异无统计学意义。亚型分析显示,α-Syn寡聚体形成量在PD-PIGD组高于PD-TD组（P<0.05）,在MSA-C组高于MSA-C+P组（P<0.05）。结论 PD与MSA及其不同亚型患者血浆促进α-Syn寡聚体形成的能力不同。     

甲基化特异性熔点曲线分析检测FMR1基因CpG岛甲基化状态方法的建立

目的建立一种可靠的检测脆性X智力障碍1基因(FMR1)CpG岛甲基化状态的方法。方法用亚硫酸氢钠对基因组DNA进行脱氨基修饰,以修饰后的DNA为模板,利用荧光定量PCR仪扩增FMR1基因CpG岛序列并进行熔点曲线分析,并对PCR产物进行克隆测序,验证其甲基化状态。结果分析包含10个CpG位点FMR1基因CpG岛105bp片段显示,非甲基化与甲基化引物扩增产物之间熔点温度相差2.5℃;克隆测序显示两者之间未被修饰的胞嘧啶相差7个。结论所建立甲基化特异性熔点曲线分析方法可以有效地检测FMR1基因CpG岛甲基化状态,为临床诊断脆性X综合征提供依据。     

PAX1基因启动子甲基化检测对宫颈癌及 宫颈癌前病变筛查的价值研究

目的 探讨配对盒基因家族PAX1基因启动子异常甲基化在宫颈癌和癌前病变早期诊断中的价值.方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）、高分辨率溶解（HRM）技术,对人乳头瘤病毒（HPV）感染的正常宫颈脱落细胞、宫颈炎脱落细胞、CIN Ⅰ脱落细胞、CINⅡ～Ⅲ脱落细胞及宫颈癌脱落细胞中的PAX1基因启动子进行甲基化检测,比较两种方法对不同级别宫颈病变的敏感度和特异度.结果 两种方法宫颈癌脱落细胞组与正常＋宫颈炎脱落细胞组以及CINI,CINII～III宫颈脱落细胞组相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）.MSP法和HRM法检测PAX1基因启动子甲基化筛查宫颈癌的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为54.55％,89.66％,66.67％,83.87％和72.73％,87.93％,69.57％,89.47％.结论 PAX1基因启动子甲基化对于宫颈癌临床诊断具有重要价值,HRM技术应用前景广阔.     

卵巢癌组织和血清中RASSF1A基因甲基化的检测及临床意义

目的：检测卵巢肿瘤组织和血清中Ras相关区域家族1A（Ras association domain family 1A,RASSF1A）基因启动子区异常甲基化,并探讨其与卵巢癌的关系。方法：收集新鲜的卵巢癌组织及其对应的血清标本67例,采用半巢式甲基化特异性PCR技术分别检测肿瘤组织DNA和血清游离DNA中RASSF1A基因启动子异常甲基化情况。结果：卵巢癌患者血清和癌组织中RASSF1A基因甲基化的检出率分别为28.4%和40.3%。卵巢良性肿瘤组织和血清以及健康志愿者血清中均未发生RASSF1A基因甲基化。癌组织中RASSF1A基因的甲基化状况与血清中出现RASSF1A基因甲基化关系密切（P＜0.01）;卵巢癌患者血清和癌组织中RASSF1A基因的甲基化改变与肿瘤的临床分期、细胞分化程度、组织学类型无明显相关性（P＞0.05）;与淋巴结转移密切相关（P＜0.01）。结论：检测血清DNA 的RASSF1A基因异常甲基化有可能成为辅助卵巢癌诊断的有效方法之一。     

帕金森病相关基因α-突触核蛋白和PINK1对Nurr1的调节作用

目的 探讨帕金森病相关基因α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)和PTEN诱导的蛋白激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)对转录因子Nurr1的调节作用。方法 利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)的方法检测α-syn与Nurr1的相互作用。同时,在PINK1基因敲减的细胞模型中,通过双荧光素酶报告系统检测PINK1对Nurr1转录激活活性的调节作用。结果 FRET检测显示,CFP-α-syn与YFP-Nurr1之间发生了荧光共振能量转移的现象。其FRET效率大约为20.52%。提示α-syn与Nurr1之间可能存在直接的相互作用。对于PINK1基因敲减的细胞进行研究发现,在PINK1被抑制表达24 h或48 h后, Nurr1的活性显著下调。结论 以往研究提示α-syn可能是Nurr1的抑制因子。研究显示α-syn可能与Nurr1直接结合而抑制其活性。 而PINK1对Nurr1可能存在一个正性调节作用。因此,二者对Nurr1的调节可能存在一个相互协调、相互制约的关系。     

α-1,3-半乳糖苷转移酶基因沉默小鼠的建立初探

目的获得转α-1，3-半乳糖苷转移酶沉默基因的小鼠。方法将α-1，3-半乳糖苷转移酶沉默基因用显微注射的方法导入小鼠受精卵。结果移植注射胚853枚，其中移植312枚1．细胞胚于11只爱体鼠，6只受孕（54．5％）均中途流产（解剖发现子宫角明显增粗、充血、残骸）；移植注射胚541枚2-细胞胚于23只受体鼠，18只受孕（78．3％），11只受孕均中途流产了，3只足目剖宫产荻14只死胎，平均体重214g，未检测到阳性；4只12日龄左右剖宫获21只残骸有7只阳性。结论通过显微注射的方法，α-1，3-半乳糖苷转移酶沉默基因可以整合，但要得到整合成活个体还有待进一步研究。