仙台病毒复制序列对未成熟树突状细胞蛋白表达的影响

目的 研究仙台病毒载体复制序列对未成熟树突状细胞(dendritic cells,DC)蛋白质表达的影响,为联合运用二者进行基因治疗提供依据.方法 提取去除仙台病毒复制序列载体(Sev/△F)、完全序列载体(SeV)转染未成熟DC的总蛋白,定量.双向凝胶电泳分离蛋白质组分,胶体银染显色,PDQuest进行图像分析后选取差异点,胶内酶解后MALDI-TOF MS进行肽指纹图谱鉴定.结果 图像分析结果显示,Sev/△F感染后的DC明显比SeV感染后的DC表达蛋白点多,其中有不少蛋白表达量也明显上调.结论 仙台病毒载体感染未成熟DC后引起蛋白表达的减少,这与SeV的复制序列有关.     

仙台病毒载体对未成熟树突状细胞蛋白表达的影响

目的:研究仙台病毒载体对未成熟树突状细胞(DC)蛋白质表达的影响. 方法:提取转染仙台病毒载体的树突状细胞和对照细胞的总蛋白,定量. 双向凝胶电泳分离蛋白质组分,胶体银染显色,PDQuest进行图像分析后选取差异点,胶内酶解后MALDI-TOF MS进行肽指纹图谱鉴定. 结果:图像分析结果显示,处理组2-DE图缺少了40个以上的蛋白点,对其中明显没有表达的5个蛋白点进行了鉴定. 结论:仙台病毒载体感染未成熟树突状细胞可引起蛋白表达的减少.     

来源于CD14+的树突细胞分化过程中膜脂分子运动及蛋白质构象的变化

目的：树突细胞（Dendritic Cells,DC）是免疫系统中功能最强大的抗原呈递细胞（Antigen Presenting Cells,APC）,它具有独特的向T细胞呈递抗原的能力.为了研究DC分化过程中细胞膜性质和细胞蛋白质构象的变化,以对其基本生物学特性有更好的理解.方法：用免疫磁珠从人外周血单个核细胞分离得到CD14＋单核细胞,用人GM-CSF和IL-4诱导其分化为未成熟的DC后,加入TNF-α使其成熟.用荧光偏振和傅里叶变换红外光谱技术研究各发育阶段细胞膜流动性及其蛋白二级结构的变化.结果：在CD14＋单核细胞分化为未成熟和成熟DC过程中,细胞膜的流动性和蛋白质的α-螺旋、β-片层、β-弯曲和无规卷曲等二级结构均发生了明显改变.结论：成熟DC的膜脂分子运动比单核细胞和未成熟DC更为活跃,同时蛋白质的构.象的主要成分也显著减少.     

供者未成熟树突状细胞对大鼠皮肤移植免疫耐受的诱导

目的探讨供者未成熟树突状细胞 (dendritic cells,DC)对同种异体皮肤移植免疫耐受的诱导效果 ,为抗排斥反应治疗提供依据。方法以供者未成熟树突状细胞术前预处理受者 ,或术后联用环孢霉素 (CSA)。根据实验分组对皮肤移植术后移植皮片存活情况观察。结果对照组、未成熟 DC组、未成熟DC联用环孢霉素组 ,其受体存活时间分别为 6 .86± 1.34d、7.5 7± 1.99d、2 2 .4 3± 4 .4 6 d。未成熟 DC组与对照组之间差别无显著性差异 ,而与未成熟 DC联用环孢霉素组有显著性差异 (P<0 .0 0 1)。结论供者未成熟树突状细胞术前预处理移植受体 ,可明显延长移植物存活时间。     

粉尘螨和细菌脂多糖诱导哮喘儿童树突状细胞成熟分化的特点

目的 探讨户尘螨过敏性哮喘儿童,其单核细胞来源的树突状细胞（dendritic cells,DC）经粉尘螨（dermatophagoides farinae,Df）和细菌脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激后的成熟分化特点.方法 户尘螨过敏性哮喘和正常儿童的外周血单个核细胞用白细胞介素4（rhIL-4）和粒-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）诱导分化成未成熟DC,然后用Df和LPS刺激DC成熟;用流式细胞仪检测DC的表面分子CD1a、CD83、HLA-DR,以判断Df和LPS对哮喘和正常儿童DC成熟分化的影响.结果 哮喘儿童单核细胞经IL-4和GM-CSF诱导后,未成熟DC（HLADR＋-CD1a＋）和自发成熟DC（HLADR＋-CD83＋）的比例均明显高于正常儿童（P=0.022和P=0.037）.但经Df刺激后,哮喘儿童成熟DC的比例显著低于LPS刺激后（P=0.009）,未成熟DC的比例则高于LPS刺激后（P=0.03）,也高于正常儿童Df刺激后的未成熟DC比例（P＜0.001）.结论 哮喘患儿DC在Df刺激下,其成熟和分化过程中存在异常,成熟过程延迟,但其在哮喘细胞免疫调节异常中的作用需要进一步研究.     

小鼠骨髓源性树突状细胞和DC2.4中RelB基因表达水平的比较研究

目的比较研究体外分离培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞(bonemarrow-deriveddendriticcells,BM-DC)和DC2.4中核转录因子RelB基因的表达水平。方法无菌从C57BL/6小鼠股骨和胫骨中取出骨髓细胞,利用rmGM-CSF和rmIL-4联合诱导体系扩增骨髓前体细胞的方法产生未成熟的BM-DC,未成熟的BM-DC在培养结束前18h经LPS刺激获得成熟的BM-DC;DC2.4细胞系用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液于37℃,5%CO2条件孵箱中培养。用流式细胞术分析它们的表型,用RT-PCR和免疫荧光染色法检测成熟的BM-DC、未成熟的BM-DC和DC2.4,RelBmRNA和其蛋白的表达。结果流式细胞术分析显示MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD40在未成熟的BM-DC和DC2.4中均呈低水平表达,在成熟的BM-DC中则呈高水平表达;共刺激分子CD86在成熟的BM-DC和DC2.4中均呈高水平表达,而在未成熟的BM-DC中呈低水平表达。RT-PCR和免疫荧光染色法检测结果均显示,RelB基因在未成熟的BM-DC和DC2.4中均呈低水平表达;而在成熟的BM-DC中呈高水平表达,成熟的BM-DC与未成熟BM-DC及DC2.4均存在显著差异(P<0.01)。结论RelB基因的表达与小鼠BM-DC的成熟状态密切相关。RelB基因在DC2.4中呈低水平表达,提示DC2.4是一种不成熟的DC细胞系。DC2.4具有的未成熟DC的特点可能与RelB基因的低水平表达有一定关系。抑制骨髓DC中RelB基因的表达,有可能诱导产生具有耐受原性的未成熟的DC。     

DC2.4表面分子与RelB基因表达的关系

目的 探讨DC2.4表面分子表达水平与RelB基因表达间的关系.方法 用RPMI 1640完全培养液培养DC2.4细胞系,光学显微镜观察培养细胞的形态特征;透射电镜观察DC2.4的细胞结构;流式细胞术分析DC2.4的表面标记(MHC-Ⅱ、CD86和CD40);RT-PCR检测DC2.4的RelB表达水平.结果 光镜观察DC2.4细胞表面有明显的树突状突起,形态极不规则;透射电镜显示DC2.4细胞内含许多质地均匀的脂滴,可见吞噬小泡样的结构.流式细胞术显示MHC-Ⅱ类分子和CD40呈低水平表达,而CD86分子却呈高水平表达;RT-PCR结果显示RelB呈低水平表达,与骨髓源性DC中的未成熟状态DC的RelB表达水平接近.结论 DC2.4具有强吞噬功能,其表面CD40分子和细胞内RelB基因均呈低水平表达,提示DC2.4是一种未成熟状态的细胞系.     

PADRE/MUC4 重组腺病毒转染树突状细胞诱导特异性CTL体外杀伤作用研究

目的:观察PADRE/MUC4重组腺病毒转染树突状细胞(DC)诱导特异性细胞毒性T细胞(CTL)及体外特异性杀伤作用.方法:pAd-CMV-PADRE/MUC4转染HLA-A2健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)来源的未成熟DC,TNF-α诱导成熟后与自体PBMC混合培养刺激3周,Cr51和Elispot实验检测CTL体外杀伤活性.结果:Cr51和Elispot检测结果显示PADRE/MUC4转染DC可以诱导产生特异性CTL,而pAd-CMV-GFP组和空白对照组不能产生有效特异性CTL.结论:腺病毒载体介导多表位嵌合基因(PADRE/MUC4)转染未成熟DC,在体外可以诱导产生特异性CTL,对表达MUC4肿瘤细胞具有杀伤效应.     

非小细胞肺癌13防御素-1表达与树突状细胞浸润的关系

目的 探讨β防御素-1(Human beta-defensin-1,HBD-1)表达和树突状细胞(Dendritic cells,DC)浸润与非小细胞肺癌免疫的关系.方法 采用免疫组化方法检测、分析非小细胞肺癌组织和癌旁正常肺组织HBD-1的表达变化,并进一步分析其变化与未成熟树突状细胞(Immaturity dendritic cells,iDCs)浸润之间的关系.结果 非小细胞肺癌组织HBD-1蛋白表达显著高于正常肺组织,且在腺癌组织表达程度高于鳞状细胞癌组织,其表达与临床分期无关.同时肺癌内存在显著的iDCs浸润,HBD-1表达水平与之呈正相关.结论 在非小细胞肺癌组织内存在高水平的HBD-1蛋白表达,其表达程度与癌组织DC的浸润有关,提示HBD-1可能通过趋化未成熟的DC而在机体抗肿瘤免疫中发挥作用.     

不同浓度粒巨噬细胞集落刺激因子在未成熟树突状细胞培养中的效果研究

目的:探讨不同浓度细胞因子在培养小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞(Dendritic cells,DC)中的作用,寻找培养所需最佳细胞因子浓度.方法:分别用低、中、高剂量粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor,GM-CSF)联合或不联合白细胞介素4(Interlenkin-4,IL-4)培养小鼠骨髓源性未成熟DC,对其进行形态学观察和细胞表型检测.结果:培养第7 d,低剂量组DC数量最少、突起细小,CD80、CD86及主要组织相容(Major histocompatibility complex,MHC Ⅱ)类分子表达低,如联合IL-4培养口1提高DC数量;中等剂量组与高剂量组DC较低剂量组为多,CD80、CD86及MHCⅡ类分子表达亦较前者提高,但二组无明显差异,有无联合IL-H4培养的差异亦不显著.结论:GM-CSF低剂量时,可诱导出纯度较高的末成熟DC,而GM-CSF中等剂量和高剂量时,无论是否联合诱导IL-4培养,诱导未成熟DC的产量及纯度无明显差异.     

JAK2/STAT3途径在IL-6抑制LPS诱导的树突状细胞分化成熟中的作用

目的 观察JAK2/STAT3信号途径在IL-6抑制LPS诱导的小鼠髓源性树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)分化成熟中的作用.方法 分离小鼠骨髓细胞,采用黏附法结合GM-CSF和IL-4刺激法在体外培养BMDCs;用相差倒置显微镜观察BMDCs的形态特点;用LPS诱导DCs成熟;采用流式细胞术观察IL-6处理与否,LPS诱导的BMDCs在表型上的变化;Western blot检测BMDCs细胞质p-JAK2、总STAT3和P-STAT3的表达水平.结果 形态观察和FCM分析的结果表明:体外成功培养了纯度较高的高表达CD11c的BMDCs,LPS能明显诱导BMDCs表面MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD80、CD86、CD40的表达上调;而经过IL-6处理后,LPS诱导BMDCs表面MHC-Ⅱ类分子、CD80、CD86、CD40表达上调的能力被显著削弱(P＜0.01).Western blot结果显示,与单独用LPS处理的BMDCs相比,经IL-6处理后的BMDC中p-JAK2、P-STAT3表达随作用时间增加而明显上调,提示IL-6促进JAK2/STAT3信号途径活化.结论 JAK2/STAT3信号途径参与了IL-6抑制LPS诱导的BMDCs成熟过程.     

IL-6抑制LPS诱导的小鼠髓源性DCs成熟的实验研究

目的观察白细胞介素-6(IL-6)对于内毒素(LPS)诱导的小鼠髓源性树突状细胞(DC)成熟效应的抑制作用。方法分离小鼠骨髓细胞,采用黏附法结合GM-CSF和IL-4刺激法在体外培养髓源性DCs(BMDCs)。用相差倒置显微镜观察BM-DCs的形态特点。用LPS诱导DC成熟。采用FACS结合混合淋巴细胞反应,观察IL-6处理与否,LPS诱导的BMDCs在表型和刺激同种淋巴细胞增殖功能上的变化。结果形态观察和FACS分析的结果表明:体外成功培养了纯度较高的高表达CD11c的BMDCs,LPS能明显诱导BMDCs表面MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD40的表达上调;而经过IL-6处理后,LPS诱导BMDCs表面CD80、CD86、CD40表达上调的能力被显著削弱(P0.05)。混合淋巴细胞反应显示,与单独用LPS处理的BMDCs相比,经IL-6处理后的BMDCs刺激同种淋巴细胞增殖的能力明显减弱,并呈剂量依赖关系(P0.05)。结论IL-6能明显抑制LPS诱导的BMDCs成熟,可能是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一。     

Hela细胞蛋白质分离和肽质量指纹谱鉴定方法的建立

目的研究Hela细胞总蛋白质的分离及利用肽质量指纹谱对蛋白质进行鉴定的方法。方法提取了Hela细胞的总蛋白质,通过双向电泳技术对蛋白质进行了分离,并应用图像扫描仪及图像分析软件获取蛋白质点的数字化信息。对其中不同丰度的蛋白质点,进行胶内酶切后,通过基质辅助激光解吸/电离直角型飞行时间质谱(MALDIO-TOF-MS)分析,再将检测出的多肽质量数通过Mascot搜索引擎检索NCBInr数据库。结果获得了Hela细胞总蛋白质双向电泳图谱及蛋白质点的数字化信息,通过MALDIO-TOF-MS检测得到的肽质量指纹谱再经过网上公共数据的检索从而获得3个蛋白质点分别是α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、γ-肌动蛋白(γ-actin)和过氧化物酶2(peroxiredoxin 2)。结论Hela细胞总蛋白质双向电泳的分离效果较好,肽质量指纹谱法能有效地对Hela细胞的蛋白质斑点进行鉴定。     

Effects of augmenting the migratory ability of mouse BMDC on immunotherapy

Objective： Being antigen-presenting cells, dendritic cells （DCs） transport captured antigen from peripheral tissues to T cell zone of lymph nodes via lymphatic vessels. This migration is essential for the presentation of antigen that leads to priming of effector T cell responses. In this study, we tried to promote the migratory ability of mouse bone marrow-derived dendritic cells （BMDCs） loaded with antigen of breast cancer, and its immunological effect in vivo. Methods： After being loaded with breast carcinoma antigen, BMDCs were cultured with medium containing PGE2, LTC4, or Bryo-1 respectively. Phenotypic changes, CCR7 expression, chemotaxis assay, mixed lymphocyte response, specific T lymphocyte cytotoxicity assay and anti-tumor immune efficacy of BMDCs were observed. Results ： PGF2 and LTC4 promoted maturation, CCR7 expression and migratory ability of BMDCs compared with control group in vitro. In vivo PGE2 and LTC4 group vaccines were more efficient on suppressing growth of mouse breast cancer than other groups. However Bryo-1 only enhanced BMDCs maturation. Conclusion： Because the effect of specific CTL in vitro had no difference, we suggested that migration of dendritic cells to lymph nodes maybe answered for the better anti-tumor immunological response induced by PGE2 or LTC4 in vivo.     

Rapamycin Modulates the Maturation of Rat Bone Marrow-derived Dendritic Cells

The purpose of the study was to observe the effect of rapamycin （RAPA） on the differentiation and maturation of rat bone marrow-derived dendritic cells （BMDCs） in vitro. BMDCs from Wistar rats were cultured with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor plus interleukin-4 in the presence or absence of RAPA （20 ng/mL）, and stimulated with lipopolysaccharide （LPS） for 24 h before cells and supernatants were collected. Surface phenotype of BMDCs was flow-cytometrically detected to determine the expression of maturation markers, MHC class Ⅱ and CD86. Supernatants were analyzed for the production of IL-12 and IFN-γ cytokines by using ELISA. BMDCs were co-cultured with T cells from Lewis rats and mixed lymphocyte reaction was assessed by MTT method. The morphology of BMDCs stimulated with LPS remained immature after RAPA pretreatment. RAPA significantly decreased the CD86 expression, impaired the IL-12 and IFN-γ production of BMDCs stimulated with LPS, and inhibited the proliferation of allogeneic T cells. In conclusion, RAPA can inhibit the maturation of BMDCs stimulated with LPS in terms of the morphology, surface phenotype, cytokine production, and ability of BMDCs to stimulate the proliferation of allogeneic T cells in vitro.     

热应激和适应对NIH-3T3细胞蛋白质谱的影响

目的 初步分析应激与适应处理对NIH-3T3细胞蛋白质合成的影响,筛选应激适应相关蛋白.方法 建立预适应细胞模型,双向电泳分离总蛋白,PDQUEST软件、肽质量指纹图谱分析候选蛋白肽段组成,观察应激与适应对细胞蛋白质合成的影响.并初步鉴定应激适应蛋白质点的类别.结果 预适应后再次热应激组表达增加的蛋白质点在各相对分子质量范围均有分布.而直接热应激组中表达增加的蛋白质点大多局限于低相对分子质量范围.结论 细胞在紧急应激状态,可能会倾向于选择性地合成能够迅速翻译的小分子蛋白质,应对应激损伤.预适应可通过提高细胞内保护性蛋白的贮备量.在再次应激时发挥保护作用.     

创伤小鼠骨髓来源树突状细胞诱导T细胞应答的能力变化

目的：研究失血合并闭合性骨折小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）诱导异源T细胞应答能力的变化.方法：致伤后24h分离小鼠骨髓细胞,体外应用重组小鼠粒细胞/巨噬细胞-集落刺激因子（rmGM-CSF）诱导BMDC,通过混合淋巴细胞反应（MLR）检测未成熟、成熟树突状细胞（DC）诱导异源T细胞的应答能力,流式细胞术检测BMDC表面主要组织相容性复合物Ⅱ类分子（MHCⅡ）及共刺激分子CD40、CD80、CD86表达,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测脂多糖（LPS）刺激的BMDC培养上清中白细胞介素-12（IL-12）p40、IL-12p70以及白细胞介素-10（IL-10）水平的变化.结果：无论是否经过LPS诱导,创伤组小鼠BMDC介导的MLR值均明显低于对照组值（P〈0.05）,创伤组小鼠BMDC在LPS刺激前后的CD40表达均明显低于对照组[（4.0±1.0）%vs（22.0±3.5）%;（56.0±7.5）%vs（91.0±8.0）%,P〈0.01],但MHCⅡ、CD80和CD86表达在2组间差异无显著性.创伤组小鼠BMDC在体外经LPS刺激24h后其IL-12p40、IL-12p70分泌水平均明显低于对照组[（45.0±6.5）vs（78.0±6.8）ng/L;（9.0±1.0）vs（18.0±1.9）ng/L,P〈0.05],但创伤组小鼠BMDC分泌IL-10的能力与对照组相比差异无统计学意义.结论：创伤小鼠BMDC诱导T细胞应答的能力降低,该变化可能与其共刺激分子CD40表达降低及IL-12分泌不足有关.     

丹参多酚酸盐负性调节小鼠骨髓来源树突状细胞成熟及其部分免疫功能

目的:观察丹参多酚酸盐对小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)成熟及其部分免疫学功能的影响。方法:小鼠BMDC体外培养时加入促成熟剂脂多糖(DCLPS)或同时加入脂多糖及丹参多酚酸盐(DCSV),其中丹参多酚酸盐设3个浓度:低浓度50μg/ml(SVL)、中浓度100μg/ml(SVM)、高浓度200μg/ml(SVH)。流式细胞仪分析各组细胞表面MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达;FITC-Dextran内吞实验分析各组DC抗原吞噬功能;酶联免疫吸附实验(enzyme linked i mmunosorbent assay,ELISA)检测各组DC培养液上清白细胞介素(interleukin,IL)-12 p40水平。[3H]-TdR掺入法检测各组DC体外混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reactions,MLR)刺激同种反应性T细胞的增殖能力;ELISA法测定MLR上清IL-10、IL-2、干扰素(interferon,IFN)-γ水平。结果:与DCLPS相比,SVL、SVM、SVH细胞表面M...     

枸杞多糖对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响

目的：研究枸杞多糖对小鼠骨髓树突状细胞（DC）表型及功能成熟的影响。方法：小鼠骨髓细胞用GM-CSF和IL-4培养5d，然后用免疫磁珠法纯化DC细胞，实验组加入枸杞多糖（100μg／ml），空白对照组加等量RPMI1640，阳性对照组加LPS（100ng／ml），3组分别同时作用48h。流式细胞仪检测细胞表型和细胞摄取抗原的能力，ELISA检测产生的细胞因子IL-12，混合淋巴细胞反应检测细胞提呈抗原的能力。结果：用枸杞多糖刺激的小鼠骨髓DC表达I-A／I-E、CD11c和分泌IL-12能力比空白对照组增加，吞噬FITC-dextran的能力下降，并可促进同种异基因T细胞的增殖。结论：枸杞多糖可以促进体外培养的小鼠骨髓DC的成熟，促进DC诱导的免疫应答启动。