应用AdMax载体系统构建SCL基因重组腺病毒表达载体

目的 用AdMax载体系统构建人SCL基因重组腺病毒载体,为研究SCL基因对ICC样细胞功能恢复奠定基础.方法 采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1、3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度.结果 PCR结果和Western blotting检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010 PFU/mL.结论 AdMax载体系统可成功构建pDC315-SCL重组腺病毒载体.     

E型沙眼衣原体MOMP基因重组质粒的构建与表达

目的：构建E型沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）基因重组真核表达质粒pVAX1-MOMP,为探索安全的E型CtDNA疫苗奠定基础。方法：根据Genebank中E型Ct MOMP基因序列设计引物,用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到约1.1kb的MOMP片段,克隆至pcDNAⅡ载体,测序后亚克隆至表达载体pVAX1,构建卡那霉素抗性真核重组表达质粒pVAX1-MOMP,并以重组质粒转染COS-1细胞进行表达,用Western blotting方法鉴定表达产物。结果：从E型Ct基因组DNA中扩增出特异的MOMP基因片段,酶切鉴定及DNA序列测定证实pVAX1-MOMP重组质粒构建正确,能在COS-1细胞内表达,表达产物能与抗MOMP单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建E型沙眼衣原体MOMP真核表达质粒pVAX1-MOMP,并在真核细胞内获得表达。     

以AdMax载体系统构建和制备肾癌相关抗原G250基因重组腺病毒表达载体

目的 构建肾癌相关抗原G250重组腺病毒载体,以期用于基因转染树突状细胞(DC)治疗肾癌的实验研究.方法 利用AdMax包装系统,首先构建穿梭质粒pDC316-G250,然后将所得的穿梭质粒和辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre以CaCL2法质粒共转染293细胞得到重组腺病毒Ad/G250,CsCl梯度离心纯化病毒,TCID50法测定病毒滴度.Ad/G250转染DC细胞,RT-PCR及流式细胞仪检测G250的表达.结果 采用双质粒共转染293细胞,Cre/loxP位点同源重组方法构建了E1和E3缺失的含外源基因的Ad/G250载体.经过PCR、RT-PCR和流式细胞仪证实腺病毒载体构建成功.病毒经过CsCl梯度离心纯化后,Ad/G250滴度达到5.6×109 U/ml.RT-PCR及流式细胞仪显示Ad/G250在DC中特异性表达.结论 成功构建了G250重组腺病毒载体.     

构建MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1表达的腺病毒载体

目的：构建串联的MYC反应元件修饰人端粒酶逆转录酶（hTERT)核心启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶基因Fcy1表达的复制缺陷型腺病毒载体。方法：将串联的MYC反应元件修饰的hTERT核心启动子及下游酵母胞嘧啶脱氨酶基因Fcy1克隆到穿梭质粒pDC316上，上辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞获得重组复制缺陷型腺病毒并在HEK293细胞中扩增重组病毒。PCR法及斑形成实验鉴定重组腺病毒和病毒滴度。结果：成功获得由6倍和18倍MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1基因表达的复制缺陷型腺病毒载体。结论：MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1基因表达的腺病毒载体为进一步研究骨肉瘤转录靶向基因治疗奠定了基础。     

基质金属蛋白酶组织抑制剂1基因重组腺病毒载体的构建

目的 为探讨基因治疗逆转或延缓椎间盘退变的可行性,构建及制备人基质金属蛋白酶组织抑制剂1 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1) cDNA重组腺病毒载体.方法 以含TIMP1 cDNA序列的质粒为模板,通过PCR方法扩增TIMP1cDNA片段,将TIMP1 cDNA全长定向克隆到Ad5MaxTM腺病毒系统的穿梭质粒pDC316上,构建pDC316-TIMP1穿梭质粒;使用Ad5MaxTM腺病毒包装系统,脂质体介导的穿梭质粒及骨架质粒pBHGlox-E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组构建含TIMP1 cDNA的重组腺病毒Ad5-TIMP1,通过PCR方法鉴定重组腺病毒Ad5-TIM P1的正确性.通过阴离子柱层析方法纯化重组腺病毒Ad5-TIMP1并测定重组腺病毒感染滴度.结果 经PCR及酶切方法证实pDC316-TIMP1穿梭质粒中存在630 bp大小左右的插入片段,与目的基因TIMP1的cDNA大小一致;经PCR鉴定证实TIMP1 cDNA重组腺病毒载体Ad5-TIMP1构建成功,病毒感染性滴度为1×1010 IU/mL.结论 成功构建TIMP1 cDNA重组腺病毒载体,为应用基因治疗方法逆转或延缓椎间盘退变的研究奠定实验基础.     

人心肌营养素-1重组腺病毒载体的构建、纯化及表达

目的　构建人心肌营养素 1重组腺病毒载体 ,以期用于神经系统退行性疾病及损伤的在体研究。方法　构建穿梭质粒pDC3 16 huCT1和pDC3 16 eGFP ,CsCl梯度离心制备高纯度的病毒基因组质粒pBHloxdeltaE1,3Cre、pHG14 0。培养2 93细胞 ,CaCl2 法质粒共转染 2 93细胞构建并筛选腺病毒AdCMV huCT1和AdCMV eGFP。病毒原液转染 2 93细胞及NIH3T3细胞 ,PCR、RT PCR及免疫组化鉴定。CsCl梯度离心纯化病毒 ,空斑试验检测病毒滴度。纯化病毒注入大鼠颈脊髓 ,RT PCR及免疫组化检验AdCMA huCT的在体表达。结果　采用双质粒共转染 2 93细胞Cre loxP位点同源重组方法构建了E1和E3缺失的含MCMV启动子、外源基因和SV40PloyA的AdCMV huCT1和AdCMV eGFP载体。经过PCR、RT PCR和免疫组化证实腺病毒载体构建成功。病毒经过CsCl梯度离心纯化后 ,AdCMV huCT1滴度达到 3 .0× 10 1 0 pfu。RT PCR及免疫组化显示AdCMV huCT1在大鼠脊髓中特异性表达。结论　构建并纯化了体外及体内高效表达的AdCMV huCT1。     

以AdMax载体系统构建携带HCV NS5B基因的重组腺病毒表达载体

目的构建表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS5B的重组腺病毒表达载体,并对其相关指标进行鉴定,为进一步研究防止丙型肝炎感染的基因免疫和基因治疗奠定实验基础。方法应用基因工程技术将HCVNS5B基因定向克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGloxΔE1、3Cre和穿梭质粒pDC316-NS5B共转染293细胞,进行同源重组,产生重组腺病毒pAd-NS5B并进行鉴定、反复感染293细胞进行扩增,扩增后测定重组病毒滴度。结果重组病毒颗粒pAd-NS5B经双引物PCR、凝胶电泳证明插入片段与HCV非结构基因NS5B片段大小相符;经测序证明其插入序列与设计HCV NS5B基因序列完全一致,扩增后重组病毒滴度达到2.3×1013IU/L。结论成功构建了表达HCV NS5B基因的重组腺病毒载体。     

受人E2F1启动子调控的条件复制型腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定受人E2F1基因启动子调控的条件复制型腺病毒载体。方法以人胚肾293细胞的基因组DNA为模板,PCR扩增E2F1基因启动子调控序列,构建表达质粒pE2F1 p-EGFP;PCR扩增腺病毒早期基因E1A,构建表达质粒pTERT p-E1A;将重组质粒pTERT p-E1A酶切得到的E1A基因,插入线性化的pE2F1 p-EGFP,构建pE2F1 p-E1A;酶切重组质粒pE2F1 p-E1A产生受E2F1基因启动子调控E1A的完整表达框,插入质粒pDC311中,构建腺病毒包装穿梭质粒pDC311-E2F1 p-E1A,与腺病毒骨架质粒pBHGlox△1,3Cre共转染人胚肾293细胞,得到条件复制型腺病毒Ad-E2F1 p-E1A;扩增病毒并分别感染E2F1活性增强的系列肿瘤细胞株,利用病毒空斑形成实验检测重组条件复制型病毒的条件复制能力。结果限制性内切酶鉴定显示重组质粒构建成功,受人E2F1基因启动子调控的溶瘤腺病毒载体仅在E2F1活性增强的肿瘤细胞株中实现条件性复制。结论构建的新型条件复制型腺病毒载体具有良好的选择性复制能力,在E2F1活性增强的肿瘤治疗方面有良好的应用前景。     

HBV-TR重组腺病毒载体的构建

目的: 构建乙肝病毒靶向核糖核酸酶(HBV targeted ribonuclease, TR)基因的重组腺病毒载体. 方法: 将HBV-TR基因及其对照组基因分别克隆入质粒载体pDC316得到pDC316/TR等穿梭质粒,然后将所得的穿梭质粒和辅助质粒pBHGlox(delta)E1, 3Cre以磷酸钙法共转染HEK293细胞得到重组腺病毒Ad/TR及对照组重组病毒,并以空斑形成实验(Plaque Assay)测定病毒滴度. 结果: 成功构建了HBV-TR重组腺病毒载体Ad/TR及其对照组病毒并获得了高滴度的病毒颗粒. 结论: HBV-TR重组腺病毒载体成功构建.     

靶向大鼠AT1-R基因的短发夹RNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的利用AdMax腺病毒载体系统构建大鼠AT1-shRNA腺病毒载体并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法自先期构建的pGenesil-1-AT1-shRNA真核表达载体中用RT-PCR法扩增出AT1-shRNA片段，将其克隆人PUC18质粒中。酶切构建好的pUC18-AT1-shRNA载体并克隆进入穿梭质粒pDC316中，将构建好的穿梭质粒pDC316AT1-shRNA载体和骨架病毒pBHGlox△1，3Cre共转染293细胞，包装成重组的病毒颗粒，荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶、PCR检测和GFP表达证实成功地构建了携带AT1-shRNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带AT1-shRNA片段的重组腺病毒载体，为进一步抗血压研究奠定了基础。     

携带凋亡素、内皮抑素双基因腺病毒载体的构建

目的构建携带有凋亡素(Apoptin、VP3)、内皮抑素(Endostatin)双基因的重组腺病毒载体,为其在肿瘤治疗的应用研究打下基础。方法将VP3基因和Endostatin基因克隆入腺病毒穿梭质粒pDC316中,将该穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒颗粒Ad-vp3-IRES-sEndo-his。其后挑选病毒空斑获取克隆进行小剂量扩增并提取病毒DNA进行PCR、RT-PCR检查以筛选和鉴定毒种,之后大剂量扩增所选得的病毒克隆并进行纯化、测定病毒的滴度。结果所得腺病毒经PCR、RT-PCR检测表明重组腺病毒Ad-vp3-IRES-sEndo-his包装成功。测定病毒50%组织培养感染剂量(TCID50)为5.7×109/ml,病毒颗粒滴度(VP)为1.9×1011/ml。结论成功构建携带凋亡素、内皮抑素双基因腺病毒载体并对其进行了大剂量扩增及提纯,达到了细胞及动物实验使用的标准。     

沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究Ct致病机制及DNA疫苗的研究提供理论依据.     

融合基因EBNA1-LMP1重组腺病毒的构建及其免疫学研究

目的 构建EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)EBNA1和LMP1融合基因的重组腺病毒,探究重组腺病毒的免疫学作用.方法 以质粒pCXWB-EBNA1和pMV261-LMP1为模板,通过PCR扩增EBNA1和LMP1基因,并通过linker以重叠延伸PCR的方式构建融合基因EBNA1-LMP1,将其...     

Construction and identification of recombinant adenovirus-mediated gene transfer system for rat vascular endothelial growth factor

Objective To construct the recombinant adenovirus vector carrying rat vascular endothelial growth factor(VEGF), as preparation for genetic transfection that follows. Methods Rat VEGF was obtained by using RT-PCR amplification and then cloned into the shutter plasmid pDC316. Subsequently, this newly constructed plasmid pDC316-VEGF, after identification by nuclease digestion analysis and sequencing analysis, was transfected into human embryonic kidney cells HEK293 by Lipofectamine 2000 mediation, together with adenovirus-packaging plasmid pBHGE3. Based on the homologous recombination of the two plasmids within HEK293 cells, the recombinant adenovirus vector carrying VEGF and VDC316-VEGF was created. VDC316-VEGF was subsequently identified using PCR, purified using repeated plaque passages, proliferated using freezing and melting within HEK293 cells, and titrated using 50% Tissue Culture Infective Dose(TCID50) assay. ResultsThe newly constructed recombinant adenovirus was confirmed to carry rat VEGF based on PCR results, and its titration value determined based on TCID50 assay was 3×109 pfu/ml. ConclusionThe recombinant adenovirus carrying rat VEGF was successfully constructed. The newly constructed adenovirus can produce a sufficiently high titration value within HEK293 cells, providing a reliable tool for genetic transfection in further gene therapy researches.     

Betatrophin重组腺病毒过表达载体的构建

［摘要］目的: 应用基因同源重组技术,构建及鉴定携带小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)的复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步研究betatrophin的功能奠定基础。方法: 根据基因库中登录的小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)序列,经化学合成得到含BamHⅠ/ AgeⅠ酶切位点的小鼠betatrophin基因全长cDNA质粒,将其酶切后插入到带有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的GV314载体CMV MCS 3FLAG SV40 EGFP中,得到重组病毒穿梭质粒pGV314 betatrophin;经BamHⅠ/ AgeⅠ双酶切后,与线性化的pDC315病毒基因组质粒体外同源重组,构建含有目的基因的腺病毒载体Ad betatrophin,酶切线性化重组腺病毒质粒后转染HEK293T细胞包装成重组病毒颗粒,经在HEK293T细胞反复扩增数代后,利用聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质印迹法及测序鉴定重组的腺病毒。结果： 阳性克隆质粒Ad betatrophin在HEK293T细胞中成功包装出重组病毒,经PCR、蛋白质印迹及测序检测表明重组腺病毒包装成功。结论： 成功构建了携带小鼠betatrophin基因的复制缺陷型重组腺病毒过表达载体。     

携带人白细胞介素10和肝细胞生长因子双基因的重组腺病毒载体构建与鉴定

目的：构建携带人白细胞介素10（hIL-10）和人肝细胞生长因子（hHGF）双基因的重组腺病毒载体。方法：分别以pDC316-hIL10-EGFP和pCDNA3-hHGF重组质粒为模板,PCR扩增获得hIL-10和hHGF基因片段,与pIRES连接成为hIL10-IRES—hHGF,测序正确后酶切,与pDC315连接,获得穿梭质粒pDC315-hIL10-IRES—hHGF,与腺病毒包装系统转染293细胞,包装产生重组腺病毒hIL10—hHGF,PCR鉴定后,扩增病毒,并测定病毒滴度。用重组腺病毒转染BEL-7402和WRL-68细胞,ELISA法检测上清液中hIL—10和hHGF的含量。结果：成功构建了重组腺病毒hIL10—hHGF,扩增纯化后测得重组腺病毒滴度为1×10^9pfu／ml,转染BEL-7402和WRL-68细胞72h后,表达hIL-10的量分别为（6271．7±5．2）pg/ml和（350．6±12．4）pg／ml,表达hHGF的量分别为（20827．1±345．5）pg／ml和（201．6±10．1）pg／ml。结论：本实验为进一步研究Ad—hIL10—hHGF在动物体内抗肝炎、肝纤维化作用奠定了基础。