细菌内同源重组构建含人内皮抑素基因腺病毒及在胃癌细胞中的体外转染实验

目的 :采用细菌内同源重组法构建含人内皮抑素基因的重组腺病毒Ad -CMV -hEn。方法 :将hEn基因自 pCA13-hEn质粒中酶切下来 ,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中 ,形成转移质粒 pAdtrack -CMV -hEn ,并用PmeⅠ线性化后与腺病毒基因组质粒 pAdeasy共转化大肠杆菌BJ5 183,抽提重组体腺病毒基因组质粒DNA ,PacⅠ酶切后在 2 93细胞中包装成腺病毒颗粒。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定 ,同时测定了病毒滴度。并采用RT -PCR检测感染腺病毒的胃癌细胞内有无hEnmRNA的转录。结果 :由 pAdtrack -CMV -hEn和pAdeasy共转化大肠杆菌BJ5 183后 ,可得到阳性重组体细菌克隆 ,包装完成的腺病毒经PCR检测表明已含有hEn基因。纯化所得腺病毒滴度约为 2 .4× 10 11pfu /ml。RT -PCR证实在感染重组体腺病毒Ad .CMV -hEN的细胞中有相应mRNA的转录。结论 :细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法。所构建的Ad -CMV -hEn在体外能有效转录相应的mRNA。     

重组人血管内皮生长因子165腺病毒载体的构建与鉴定

目的 探讨构建携带人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)的重组腺病毒载体,为进一步的基因转染构建组织工程骨的血管化提供实验基础.方法 采用RT-PCR扩增的方法获得人源性的hVEGF165,并克隆入穿梭质粒pAdTraek CMV.构建的质粒pAdTrack CMV-VEGF165经酶切及测序鉴定正确后,通过pAdeasy 1质粒的介导与腺病毒包装质粒pAdTrack CMV.VEGF165共转染至人胚肾细胞HEK293,经同源重组后获得携带人VEGF的重组腺病毒pAdTrack CMV.VEGF165.应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒,测定病毒滴度.结果 PCR鉴定证实重组腺病毒含有人VEGF,病毒滴度为0.5×10"pfu/ml.结论 成功构建的携带人VEGF的重组腺病毒载体能在HEK293细胞内扩增获得足够高的病毒滴度,为基因治疗构建组织工程骨血管化的研究奠定基础.     

VEGF165基因重组腺病毒载体的构建及其促血管形成作用

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）基因的腺病毒表达载体（Ad—VEGF165）,并观察其感染QBI．293A靶细胞后目的基因的表达及促进血管形成的作用。方法以含有VEGF165基因片段的pSV-K3-VEGF165质粒为模板,PCR扩增获得的VEGF165目的片段（XhoI、EcoRV）亚克隆至GFP标记的pAdTrack—CMV载体中构建重组转移质粒pAdTrack．CMV．VEGF165,行PCR、双酶切和DNA测序鉴定。将测序正确的pAdTrack—CMV．VEGFl65质粒经PmeI线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy．1共转化BJ5183细菌,获得同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1．pAdTrack-CMV．VEGF165（pAd．VEGF165）,再经PacI线性化后用脂质体转染QBI．293A包装细胞,通过多轮扩增和氯化铯密度梯度离心纯化获得Ad．VEGFl65重组腺病毒。RT．PCR和ELISA检测腺病毒介导的外源性VEGFl65基因在QB｜．293A细胞中的转录和表达。将孵育8d的生长状态良好的鸡胚随机分成Ad空载体腺病毒组、Ad—VEGFI65重组腺病毒组、NS组。采用鸡胚尿囊膜（CAM）法检测VEGF165重组腺病毒促进尿囊膜血管形成活性。结果PCR、双酶切和测序鉴定结果证实成功构建了pAdTrack．CMV—VEGF165重组转移质粒,并获得了高滴度的Ad．VEGF165重组腺病毒,其病毒效价可达2×10^10pfu／mL。Ad-VEGFl65感染后,QBI．293A细胞中的VEGF165含量较QBI．293A细胞对照组和Ad空病毒感染组均明显升高（P〈0．05）。Ad-VEGF165组与Ad．空载体组和NS组比较,CAM三级分支血管生长更旺盛,毛细血管更丰富（P〈0．05）。结论成功获得了携带人VEGF165基因的腺病毒表达载体,具有明显的促CAM血管形成活性,为进一步开展VEGF165基因修饰干细胞的应用研究奠定了实验基础。     

携带入VEGF165的腺病毒载体的构建及鉴定

目的　构建携带人血管内皮生长因子 (VEGF) 16 5基因的重组腺病毒载体 ,用于治疗重症冠心病。方法　将人VEGF16 5cDNA正向插入到穿梭质粒 pHCMVSP1A的CMV启动子之下 ,构建重组质粒 ,即pAd hVEGF16 5 ,通过脂质体与pJM17共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得携带人VEGF16 5基因的重组腺病毒载体Ad hVEGF16 5。通过PCR扩增法鉴别Ad hVEGF16 5 ,根据A2 60nm计算病毒滴度。结果　人VEGF16 5cDNA成功地正向插入到 pHCMVSP1A载体中 ,以重组病毒基因组DNA为模板 ,同时扩增出了 5 76bp的VEGF16 5cDNA基因片段和 86 0bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了Ad hVEGF16 5的正确性。测病毒滴度为 1.94× 10 12 pfu/ml。结论　携带人VEGF16 5的腺病毒载体的成功构建为用VEGF16 5基因治疗冠心病奠定了基础。     

DPC4重组腺病毒载体的构建

目的：构建DPC4基因重组腺病毒载体以研究DPC4对胰腺癌的影响。方法：构建PRL-DPC4重组质粒，然后将具CMV启动子的DPC4CDNA片段自PRL-DPC4上切下，亚克隆至腺病毒穿梭质粒中，形成转移质粒PAd△E1-DPC4将这写腺病毒基因组质粒PBHG10共转染293细胞获得重组腺病毒，采用PCR方法对其进行鉴定。结果：在挑选的空斑中有含DPC4CDNA的重组腺病毒，DPC4重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞中进行有效的复制。结论：成功构建了DPC4基因重组腺病毒载体，为进一步研究DPC4的功能提供了条件。     

三元复合因子Net嵌合型重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:克隆人三元复合因子Net全长基因,构建其重组腺病毒载体。方法 :抽提正常人胰腺组织中总RNA,经RT-PCR扩增出全长Net基因,利用同源重组的方法将腺病毒骨架质粒pBHG35和穿梭质粒pDC316-Net共转染293细胞,获得腺病毒重组质粒Ad5/F35-Net,在293细胞中包装和扩增后,获得高滴度的腺病毒重组质粒Ad5/F35-Net。采用PCR和蛋白印迹法检测Net基因的表达。结果 :用RT-PCR方法 ,从人胰腺癌组织中扩增出1224 bp的cDNA片段,经测序证实为人Net基因。最终构建及包装出高滴度的重组腺病毒载体Ad5/F35-Net。结论:成功克隆了人Net全长基因,并构建其重组腺病毒表达载体,为进一步研究人Net基因在相关肿瘤疾病中的生物学作用奠定了基础。     

EEF1A2嵌合型重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:克隆人类真核翻译延长因子1A2(EEF1A2)基因全长,构建其重组腺病毒载体。方法:应用RT-PCR方法从人胰腺癌组织中扩增人EEF1A2基因全长,经T-A克隆后,亚克隆到腺病毒穿梭质粒pDC316,构建穿梭质粒pDC316-EEF1A2。利用同源重组的方法将腺病毒骨架质粒pBHG35和穿梭质粒pDC316-EEF1A2共转染293细胞,获得腺病毒重组质粒Ad5/F35-EEF1A2,经过在293细胞中包装和扩增之后,获得高滴度的腺病毒重组质粒Ad5/F35-EEF1A2。PCR、WesternBlot检测EEF1A2基因的表达。结果:用RT-PCR方法,从人胰腺癌组织中扩增出1400bp的cDNA片段,经测序证实为人EEF1A2基因。构建及包装出高滴度的重组腺病毒载体Ad5/F35-EEF1A2。结论:成功地克隆了人EEF1A2基因全长,并构建其表达的重组腺病毒载体,为进一步研究人EEF1A2基因在相关疾病中的作用奠定了基础。     

大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体及在乳鼠心肌细胞中的表达☆

背景:过氧化物酶体增生因子活化受体α是调节心脏脂肪酸氧化的重要核转录因子,利用基因工程技术构建其重组腺病毒载体对研究心脏能量代谢障碍机制具有重要意义. 目的:构建大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体,评价其在原代培养的乳鼠心肌细胞中的表达效率. 方法:采用RT-PCR法自SD大鼠肝脏扩增过氧化物酶体增生因子活化受体α基因,将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒载体pAd-Track-CMV.线性化重组穿梭质粒载体并转化入含有腺病毒骨架质粒pAd-Easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒.用脂质体将线性化的重组腺病毒载体质粒转染于人胚肾293细胞以包装、扩增,纯化病毒后计算滴度.用纯化的重组腺病毒转染心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率;荧光定量PCR、免疫印迹法检测细胞过氧化物酶体增生因子活化受体α mRNA、蛋白表达. 结果与结论:成功构建携带大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为3.5×1011 pfu/L.重组腺病毒转染心肌细胞的效率达90%以上,被转染细胞目的基因mRNA、蛋白表达显著增高.该载体的成功构建为研究过氧化物酶体增生因子活化受体α基因在心肌能量代谢障碍中的作用奠定基础.     

携带人血管内皮生长因子165基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建和鉴定

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)165基因的重组腺病毒载体。方法:应用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切质粒PDC-VEGF和PDC315,连接DNA目的片段后转化大肠杆菌DH5α构建重组质粒PDC315-VEGF,对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体将质粒PDC315-VEGF与质粒pBHGE3共转染293细胞获取重组腺病毒,以重组腺病毒DNA为模板,PCR鉴定构建的重组腺病毒。扩增、浓缩纯化重组腺病毒,微量滴定法测定腺病毒滴度。结果:通过连接反应构建重组质粒PDC315-VEGF,酶切分析和测序证明构建正确。经细胞内同源重组构建携带人VEGF165基因的重组腺病毒,PCR扩增421bpVEGF165片段,证实VEGF165基因成功克隆到复制缺陷型腺病毒载体,腺病毒滴度为5.0×109pfu/mL。结论:通过双质粒细胞同源重组,生产携带人VEGF165基因的重组腺病毒,为动物试验奠定基础。     

携带人肝癌细胞CDK2基因的rAAV载体的构建与鉴定

目的构建携带人肝癌细胞CDK2基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体;方法设计能表达CDK2特异性的小干扰RNA(siRNA),构建pAKD-shRNA-CDK2重组质粒,采用磷酸钙共转染法将重组质粒pAKD-shRNACDK2、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper共转染AAV-293细胞,采用定量PCR方法对病毒进行滴度测定;结果三质粒共转染AAV-293细胞48h后,荧光显微镜下检测到GFP绿色荧光,表明共转染成功,测定病毒平均滴度为3.56×1012v.g/ml。结论成功构建携带人肝癌细胞CDK2基因的重组腺相关病毒rAAV-shRNA-CDK2。