ODC反义寡核苷酸对K562细胞生长抑制作用

鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)是催化多胺生物合成的限速酶.过去的研究表明多胺在维持肿瘤恶性表型中起着重要作用.用ODC不可逆抑制剂抑制多胺生物合成不仅能抑制肿瘤细胞的增殖而且还诱导细胞分化.近年我们采用反义技术,以ODC反义RNA转染肿瘤细胞,通过对ODC表达的封闭,成功地使其恶性表型得到了逆转.提示抑制肿瘤细胞的多胺合成可能是抗癌的有效途径.本文用ODC反义寡核苷酸控制肿瘤细胞的多胺生物合成,观察了其对K562细胞生长特性的影响,以期为ODC反义寡核苷酸在肿瘤临床的应用提供实验依据.     

联合应用bcr-abl融合基因反义寡核苷酸与c-myb基因反义寡核苷酸对K562细胞作用的研究

目的：研究联合应用ｂｃｒ－ａｂｌ融合基因硫代磷酸反义寡核苷酸（Ａｓｐｏ）及ｃ－ｍｙｂ基因Ａｓｐｏ对Ｋ５２细胞作用效果。方法：Ａｓｐｏ与Ｋ５６２细胞共培养后,台盼蓝拒染法计死活细胞数;甲基纤维素半固体培养法培养ＣＦＵ－Ｋ５６２;流式细胞仪测定细胞Ｐ２１０蛋白表达及细胞凋亡率;ＲＴ－ＰＣＲ半定量检测细胞ｂｃｒ－ａｂｌｍＲＮＡ;电镜观察凋亡细胞形态学改变。结果：例置显微镜下观察到联合应用两种Ａｓｐｏ时,浓度各为５ｕｍｏｌ／Ｌ组Ｋ５６２细胞仍呈克隆状态生长,作用２４ｈ细胞Ｐ２１０蛋白表达明显受抑制,表达率〈２％;作用１２０ｈ细胞生长抑制率为６１．７％,Ｐ２１０恢复为２５．７％,凋亡率为２２．５％。两种浓度各为１０ｕｍｏｌ／Ｌ组Ｋ５６２细胞生长疏散,作用１２０ｈ细胞生长抑制率达９２．２％,Ｐ２１０仍未恢复,凋亡率为２２．     

CRKL基因反义寡核苷酸诱导K562细胞的凋亡

背景与目的：近几年研究发现,CRKL（CT10regulator of kinase like)基因编码的蛋白在慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML)发病中起重要作用。本实验研究CRKL基因反义寡核苷酸对慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞凋亡的影响。方法：以脂质体为载体,用CRKL基因反义寡核苷酸转染K562细胞,通过活细胞计数,透射电镜,流式细胞术,DNALadder测定观察K562细胞形态学,细胞周期,基因表达等的变化。结果：在CRKL基因反义寡核苷酸作用下,K562细胞的生长明显出现抑制;流式细胞仪检测见二倍体峰前出现凋亡峰;在电镜下可见处于凋亡各期的K562细胞;提取其基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳,可见明显的细胞凋亡梯状条带,而对照组K562细胞未观察到上述变化。结论：CRKL基因是Ph染色体阳性CML发病的重要因素。     

端粒酶RNA反义寡核苷酸对白血病细胞K562增殖的影响

目的：探讨人类端粒酶RNA的反义寡核苷酸对K562细胞增殖的影响。方法：采用MTT和试验和平板集落形成实验观察反义寡核苷酸作用后K562细胞的生长情况，采用流式细胞仪分析细胞周期的改变，采用电镜观察细胞超微结构的改变，用PCR－ELISA分析细胞端粒酶活性的改变。结果：端粒酶RNA的反义寡核苷酸作用K562细胞后，细胞超微结构和细胞周期发生明显改变。端粒酶活生到明显抑制，细胞增殖受到明显抑制。结论：靶向于端粒酶RNA的反义寡核苷酸抑制白血病细胞K562的增殖。     

WT1反义寡核苷酸对K562白血病细胞生长抑制作用研究

 目的 探讨WT1反义寡核苷酸（WT1-ASO）对白血病细胞生长抑制作用。方法 合成一段与WT1基因转录本翻译起始序列互补的、含18个碱基的WT1反义寡聚核苷酸序列,以200 μg／ml与白血病细胞系K562和U937共培养,同时设立WT1-SO组及单纯培养基对照组,锥虫蓝拒染实验确定活细胞数,测定细胞生长曲线,观察WT1-ASO对白血病细胞生长抑制作用,实时定量RT-PCR技术检测相应细胞系中WT1基因表达水平变化。结果 WT1-ASO能够特异性抑制WT1表达的K562细胞的生长,与WT1-SO组及对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）,而WT1-ASO对WT1低表达的U937细胞生长无明显抑制作用,WT1-ASO能够特异性下调K562细胞中WT1基因表达水平。结论 WT1-ASO能够特异性抑制表达WT1基因的白血病细胞生长,下调其WT1基因表达,可以应用于白血病治疗。     

脂质体转染survivin反义寡核苷酸对K562细胞增殖及凋亡的作用

目的:观察脂质体转染survivin反义寡核苷酸(ASODN)对白血病细胞K562的增殖及凋亡的影响。方法:人工合成survivin硫代ASODN,通过脂质体转染K562细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学变化;用MTT法观察转染前后对细胞增生的影响;用细胞凋亡检测法(POD)观察细胞凋亡;RT-PCR检测survivin mRNA的表达。结果:(1)survivin ASODN抑制K562细胞增殖呈时间和剂量依赖性;(2)survivin ASODN可诱导K562细胞的凋亡,凋亡指数呈浓度依赖性;(3)survivinASODN处理组K562细胞survivin mRNA的表达水平显著下降。结论:脂质体转染survivin ASODN能够明显抑制K562细胞增殖,且能诱导细胞凋亡。survivin可能成为肿瘤基因治疗的一个新靶点。     

Bcl-2反义寡核苷酸联合富勒醇对K562细胞凋亡的影响

目的:观察不同浓度的Bcl-2反义寡核苷酸和富勒醇作用后K562细胞的凋亡情况.方法:用0.1、0.2 mg/mL的富勒醇和10μmol/L的Bcl-2反义寡核苷酸以及联合10μmol/L、0.1 mg/mL的Bcl-2反义寡核苷酸和富勒醇分别作用于K562细胞,于作用后12、18和24 h观察K562细胞的凋亡情况.结果:反义寡核苷酸+富勒醇组于作用后12 h细胞增殖受抑最显著.OD值降为0.705±0.003,与空白组OD值1.057±0.007比较,两者差异有统计学意义,P<0.01,且随着时间延长,这种抑制作用有逐渐降低的趋势.反义寡核苷酸+富勒醇组OD值0.705±0.003与反义寡核苷酸组OD值0.704±0.003比较,差异无统计学意义.结论:富勒醇联合Bcl-2反义寡核苷酸在诱导肿瘤细胞凋亡方面无协同作用,富勒醇在自然光照条件下也不能干扰Bcl-2反义寡核苷酸对细胞凋亡的诱导作用.     

Livin反义寡核苷酸对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨Livin反义寡核苷酸（ASODN）对白血病细胞K562增殖及凋亡的影响。方法设计合成特异性的Livin硫代磷酸ASODN及其对照错义寡核苷酸（MSODN）,脂质体介导转染K562细胞后,采用四甲基偶氮唑盐光吸收法（MTT）检测细胞增殖,AnnexinV—FITC法检测细胞的凋亡,反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法检测LivinmRNA的表达。结果LivinASODN在终浓度为600nmol／L作用K562细胞48h时,能明显抑制其增殖细胞增殖咖制率（IR）为（52．99±2．67）％],降低LivinmRNA的表达[ODR为（59．75±3．24）％],K562细胞凋亡率显著增加f（36．89±1．08）％]（P〈0．01）,而Lip—MSODN组、Lip对照组与细胞对照组之间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论LivinASODN可下调Livin基因表达,有效抑制K562细胞的增殖,并促进K562细胞凋亡。     

反义寡核苷酸对K562细胞增殖和端粒酶活性的影响

 目的　研究靶向封闭端粒酶反转录酶（hTERT）mRNA的反义硫代寡核苷酸（ASPSODN）对K562细胞目的基因的抑制及其对端粒酶活性及细胞增殖周期和凋亡的影响 。方法　ASPSODN转染到人类红白血病细胞株K562,采用MTT法、酶联免疫吸附（ELISA）法和流式细胞术（FCM）检测K562细胞的增殖、端粒酶活性、细胞凋亡和细胞周期的改变,RT-PCR检测hTERT mRNA的表达。结果　0.6 μmol／L的ASPSODN（0.42±0.16）能明显下调hTERT表达（P＜0.05）,端粒酶相对活性降至52 %;MTT法检测显示明显抑制K562细胞增殖活性;FCM显示细胞凋亡率为10.31 %,PI染色显示细胞被阻止在G1／G0期,S期及G2／M期的细胞减少,但无特征性的凋亡峰。结论　ASPSODN靶向 hTERT 能特异性抑制K562细胞hTERT mRNA的表达,明显下调端粒酶活性,抑制K562细胞增殖,并通过降低细胞的端粒酶活性而诱发细胞凋亡。     

Apolloon反义寡核苷酸对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨Apollon反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASODN）对白血病细胞K562增殖及凋亡的影响。方法设计合成特异性的Apollon硫代磷酸ASODN及其对照错义寡核苷酸（missense oligonucleotide,MSODN）,脂质体介导转染K562细胞后,采用MTT法检测K562细胞增殖,Annexin V-FITC法检测细胞的凋亡。结果Apollon反义寡核苷酸对K562细胞的生长抑制呈浓度-时间依赖性。Apollon ASODN在终浓度为600 nmol/L作用K562细胞时,能明显抑制其增殖,K562细胞凋亡率显著增加（P<0.01）。结论Apollon 反义寡核苷酸可下调Apollon基因表达,有效抑制K562细胞的增殖,并促进K562细胞凋亡。     

Survivin反义寡核苷酸逆转K562/A02细胞的耐药研究

目的:探讨Survivin反义寡核苷酸(an-tisenseoligodeoxynucleotide,ASODN)对K562/A02细胞耐药的作用和机制。方法:以脂质体转染SurvivinASODN,以MTT法检测多柔比星(adriamycin,ADM)和SurvivinASODN ADM对K562/A02细胞的IC50,以RT-PCR、蛋白印迹、荧光分光光度计和流式细胞术分别检测SurvivinmRNA、蛋白表达及半胱氨蛋白水解酶-3(Caspase-3)的活性和细胞凋亡的变化。结果:ADM和ASODN ADM对K562/A02细胞的IC50分别为45·56和19·01mg/L,SurvivinmRNA和蛋白水平表达分别降低36·2%和71·5%,Caspase-3活性增加67·5%,凋亡率较对照组增加[(14·5±5·6)%vs(2·4±1·0%),P<0·05]。结论:SurvivinASODN通过抑制Survivin表达激活Caspase-3,诱导凋亡,逆转耐药。     

MicroRNA-17-5p反义寡核苷酸阻滞白血病K562细胞的细胞周期

目的： 以反义寡核苷酸技术研究microRNA-17-5p（miR-17-5p）对人慢性髓系白血病K562细胞增殖的影响及其可能的机制。 方法： 脂质体法将miR-17-5p反义寡核苷酸（miR-17-5p antisense oligonucleotide,miR-17-5p-ASO）和对照无义寡核苷酸（control nonsense oligonucleotide,Ctrl-NSO）转染入K562细胞,同时设未转染对照组（Ctrl）。 MTT法检测K562细胞的增殖,TUNEL法检测K562细胞的凋亡,流式细胞术检测K562细胞周期的改变。 结果： MTT检测结果显示,miR-17-5p-ASO组K562细胞增殖活性为Ctrl-NSO组的(61.7±4.7)%,miR-17-5p-ASO转染显著抑制K562细胞的增殖（P<0.05）。TUNEL检测显示,miR-17-5p-ASO转染不影响K562细胞凋亡（P>0.05）;miR-17-5p-ASO组K562细胞G2期细胞比例为(10.8±08)％,显著低于Ctrl-NSO组和Ctrl组的(34.6±0.4)％和(33.9±1.3)％(P<0.05)。 结论： MiR-17-5p反义寡核苷酸可以通过调控细胞周期抑制K562细胞的增殖,有望成为白血病治疗的新手段。     

Survivin反义寡核苷酸诱导K562/A02细胞凋亡的实验研究

背景与目的:Survivin是最近发现的凋亡抑制基因,与白血病的发生和耐药有关,反义寡核苷酸可抑制survivin表达,诱导凋亡,增加药物的敏感性。本研究探讨survivin反义寡核苷酸对白血病耐药细胞K562/A02生长、凋亡和半胱氨蛋白水解酶3的活性的作用。方法:以脂质体转染survivin反义寡核苷酸,以MTT、RT-PCR、流式细胞术、荧光分光光度计分别检测survivin反义寡核苷酸对K562/A02细胞的生长抑制、survivin mRNA表达、凋亡和半胱氨蛋白水解酶3的活性。结果:survivin反义寡核苷酸对K562/A02细胞的生长抑制呈浓度-时间依赖性,与对照组相比,survivin mRNA表达降低36.2%(P<0.05),半胱氨蛋白水解酶3的活性增加67.6%(P<0.05);K562/A02细胞的凋亡率明显增加(14.48±2.65%vs 2.39±0.47%,P<0.005)。结论:survivin反义寡核苷酸通过抑制survivin表达,上调半胱氨蛋白水解酶3活性而诱导凋亡。     

人慢性粒细胞白血病bcr-abl基因反义寡核苷酸对K562细胞株的凋亡诱导作用研究

背景与目的：随着人类基因组计划的完成,人们的研究重点已转向基因功能的研究,反义核酸技术无疑为这项宏伟工程提供了一个新的发展方向。目前,国内关于反义寡核苷酸诱导K562细胞凋亡的实验研究很少。本实验在体外构建针对人慢性粒细胞白血病(chronic myelogenou leukemia,CML)bcr-abl融合基因mRNA的反义寡核苷酸,探讨bcr-abl反义寡核苷酸对K562细胞凋亡的诱导作用。方法：以bcr-abl融合基因mRNA翻译起始点融合前区19个寡核苷酸为作用靶点,设计反义寡核苷酸,以其反义寡核苷酸序列转染人慢性粒细胞K562细胞,采用Hoechst染色法观察不同浓度寡核苷酸对K562细胞株的凋亡情况,采用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测自噬凋亡蛋白LC3-Ⅱ的表达情况,采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞周期变化,采用JEM-4000EX电镜术检测细胞凋亡形态变化,通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测K562细胞凋亡情况。结果：Hoechst染色结果显示,bcr-abl反义寡核苷酸能显著促进K562细胞的凋亡,且呈现一定的浓度依赖性。Westernblot检测结果显示,bcr-abl反义寡核苷酸各浓度组凋亡自噬蛋白LC3-Ⅱ表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。FCM检测结果显示,bcr-abl反义寡核苷酸作用于K562细胞后,细胞周期阻滞于G₀/G₁期。各组G₀/G₁期、S期细胞数量与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。在JEM-4000EX电镜下可见明显的新月型凋亡小体。DNA琼脂糖凝胶电泳显示,10、30 μmol/mL bcr-abl反义寡核苷酸组可以明显观察到以180~200 bp碱基对整倍数出现明暗间隔的DNA梯状条带。结论：Bcr-abl反义寡核苷酸可显著诱导K562细胞凋亡,为临床上基因治疗人CML提供一定的参考。     

反义ras基因增强足叶乙甙对白血病K562细胞的诱导凋亡作用

目的 研究ras p21蛋白在bcr-abl p210蛋白抗凋亡信号传导通路中的作用。方法 应用逆转录病毒载体pLXSN将反义N－ras1 cDNA转导到K562细胞系中后，通过足叶乙甙对细胞进行诱导凋亡。结果 转导反义N－ras1 cDNA的K562细胞内N－ras p21表达下降。反义N－ras转民细胞较对照细胞K562易发生凋亡，对药物的敏感性显著增高。结论 ras p21蛋白是bcr-abl p210蛋白介导抗凋亡信号的重要的下游蛋白，阻断该蛋白的功能有可能成为治疗人类慢性髓性白血病的1个选择点。     

反义hTERT对K562细胞端粒酶活性及细胞增生的影响

目的：观察反义hTERT表达质粒转染K562细胞后是否能够抑制端粒酶活性及K562细胞的增生。方法：质粒的构建与转染；将200bphTERTcDNA片段，反向连接于pLNCX-neo质粒上得到反义hTERT基因表达质粒，在体外转染中通过脂质体法将质粒导入K562细胞中，以G418进行筛选得到阳性克隆；以MTT法和形态学法检测反义hTERT表达质粒对K562细胞增生的抑制作用；以TRAP-PCRELISA法来研究反义hTERT基因对K562细胞的端粒酶活性的抑制作用。结果：转染反义hTERT表达质粒细胞与对照组（空白对照及空质粒组）相比较。生长速率明显变慢。部分细胞出现凋亡等形态学改变。反义hTERT对K562细胞的端粒酶活性具有明显的抑制作用。结论：研究构建的端粒酶反义hTERT基因表达质粒转染到K562细胞中后，能够封闭K562细胞hTERT-mRNA的表达，在抑制端粒酶活性的同时，减慢了K562细胞的生长速度。     

以microRNA-17为靶点的反义核酸对白血病细胞K562的作用

目的 研究以microRNA-17(miR-17)为靶点的反义核酸对人类白血病K562细胞的生长抑制作用.方法 人工合成miR-17的反义核酸,硫代修饰,用Lipofectamine 2000转入K562细胞.四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测转染反义核酸后K562细胞的增殖活性,流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡水平,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测反义核酸作用后K562细胞内miR-17的相对表达水平.结果 MTT结果显示,转染反义核酸后的24、48、72 h,K562细胞的增殖活性分别为0.872±0.001、0.710±0.002、0.551±0.001,与随机核酸序列组(随机对照组)(增殖活性分别为1.001±0.002、1.009±0.003、1.211±0.003;t值分别为182.58、269.77、660.40)、空白对照组(增殖活性分别为1.113±0.001、1.114±0.001、1.101±0.001;t值分别为537.98、571.20、1230.51)相比较差异有统计学意义(均P＜0.05);FCM检测结果表明,在转染反义核酸48 h后细胞的凋亡率为(20.14±0.01)％,与随机对照组的(3.54±0.02)％及空白对照组的(1.98±0.01)％比较差异有统计学意义(t分别为2347.6、2568.2,均P＜ 0.01);实时荧光定量PCR结果证实,在反义核酸作用后,K562细胞内miR-17的相对表达水平(0.07)明显下降,与随机组(1.00)、空白组(1.01)相比较差异有统计学意义(t值分别为148.63、147.04,均P＜0.05).结论 以miR-17为靶点的反义核酸可抑制K562细胞的增殖活性,并显著促进细胞的凋亡.     

hTERT基因反义核酸对K562细胞端粒酶活性的影响

探讨人类端粒酶逆转录酶（ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ,ｈＴＥＲＴ）基因的反义寡核苷酸（ａｎｔｉｓｅｎｓ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ,ＡＳＯＮＤ）对Ｋ５６２细胞端粒酶活性的影响。方法：采用多聚酶链反应－酶联免疫测定（ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ）方法检测人工合成的反义脱氧寡核苷酸处理Ｋ５６２细胞前后端粒酶活性的改变,以逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）分     

反义 HSP70对人乳腺癌细胞的抑瘤效应

目的：观察反义热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70)RNA对人乳腺癌细胞学特性的影响,探讨其抗肿瘤作用。方法：将逆转录病毒真核表达载体介导的反义HSP70重组质粒pX-AHSP70和空载体pLXSN-neo转染至MCF7／Adr人乳腺癌细胞,通过细胞生长曲线和软琼脂集落实验以及裸鼠移植瘤实验观察转染反义HSP70重组质粒细胞的体内外抑瘤作用。结果：建立了稳定表达反义HSP70 RNA的MAp70细胞,与空载体细胞相比,HSP70蛋白的表达下降了48％。细胞群体生长速度明显减慢,软琼脂集落形成率和抑制率分别为6．08％和62．14％,裸鼠皮下接种的平均出瘤时间为15天,最终平均瘤重为108mg,以上参数与空载体细胞相比,均有显著差异。结论：反义HSP70RNA能够有效地抑制HSP70表达,进而抑制乳腺癌细胞的体外增殖和体内移植瘤的形成与发展。