重组腺病毒介导的人p27kip1基因高表达对体外培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞迁移的影响

目的　探讨重组腺病毒介导的p2 7kip1基因及其蛋白产物高表达对血管平滑肌细胞 (VSMCs)迁移的抑制作用。方法　将含人p2 7kip1cDNA的重组腺病毒 (Adhp2 7kip1)及含 β 半乳糖苷酶基因的重组腺病毒 (AdLacZ)在体外转染原代大鼠主动脉VSMCs,用Westernblot及Boyden趋化小室检测外源性p2 7kip1蛋白在细胞内的表达及对VSM Cs迁移的影响。结果　转染后 2 4h ,Adhp2 7kip1转染的VSMCs内p2 7kip1蛋白高表达 ,而AdLacZ转染的VSMCs内仅显示极低水平的内源性p2 7kip1蛋白表达 ;Boyden趋化小室检测显示未转染的VSMCs、AdLacZ及Adhp2 7kip1转染的VSMCs血清诱导后的迁移细胞数分别为 139± 2 6、10 6± 16及 6 8± 14。结论　外源性p2 7kip1基因及蛋白产物在VSMCs内高表达可显著抑制VSMCs的迁移     

p27kip1腺病毒重组体对人食管癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用

D27kip1是新近发现的一种抑癌基因，研究表明p27kip1基因转移能显著抑制食管癌和胃癌细胞生长，该基因疗法在体内实验中是否同样有效值得进一步研究。目的：研究p27kip1腺病毒重组体对人食管癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法：将携带人p27kip1基因的重组腺病毒载体导人人食管癌裸鼠移植瘤中．测定肿瘤生长抑制率．免疫组化方法检测移植瘤中p27kip1和生存素(survivin)的表达。结果：经p27kip1基因治疗的裸鼠，肿瘤生长抑制率达64．1％，移植瘤中p27kip1呈高表达．生存素呈低表达。结论：p27kip1腺病毒重组体能显著抑制人食管癌裸鼠移植瘤的生长．上调p27kin1和下调生存素的表达可能是其雷要作用机制。     

腺病毒介导的p27kip1基因对胃癌细胞周期和DNA合成的影响

背景：近年来胃癌基因治疗的研究取得了一定的进展，但总体疗效尚不尽人意，目前正积极寻求组织特异性基因作为胃癌基因治疗的突破点。目的：以腺病毒为载体，研究p27kipl基因对胃癌细胞周期和DNA合成的影响。方法：将成功构建的携带人p27kipl基因的重组腺病毒载体Ad-p27kipl和LacZ重组腺病毒Ad-LacZ转染胃癌细胞系SGC-7901，并观察细胞形态的变化，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，^3H-胸腺嘧啶核苷(TdR)掺入实验测定细胞DNA合成。结果：Ad-p27kip1转染SGC-7901细胞后，细胞变圆、呈葡萄串样聚集以致脱落，G0／G1期细胞比例增加，8期、G2／M期细胞比例降低，并有凋亡发生，^3H-TdR掺入量亦显著降低。结论：腺病毒介导的p27kipl基因能使SGC-7901细胞产生G0／G1期阻滞，并能诱导细胞凋亡，抑制DNA合成，表明该基因疗法能有效抑制体外胃癌细胞的生长。     

腺病毒介导高血压相关基因转移对兔颈动脉球囊损伤后新生内膜形成的抑制作用

目的 探讨腺病毒载体介导的新基因高血压相关基因(Hypertension-related gene,HRG-1)转移对兔颈总动脉球囊损伤后新生内膜形成的影响。方法 兔颈总动脉球囊损伤后,经血管腔内转染含有HRG-1的腺病毒载体(AdHRG-1)或含有绿色荧光蛋白报告基因的空载腺病毒载体(AdGFP),以生理盐水处理为对照。于术后3、7和28 d取材,分别进行外源基因表达检测、PCNA染色和定量组织形态学分析。结果 应用逆转录-聚合酶链反应和免疫组织化学方法分别证实了基因转移后3 d HRG-1在兔颈动脉壁内的表达;PCNA免疫组织化学染色显示,转染AdHRG-1后7 d兔颈动脉内膜和中膜PCNA阳性细胞指数较转染AdGFP组明显降低[(21.4±2.5)％对(45.6±3.8)％,(6.4±1.1)％对(17.8±1.9)％,P<0.05]。基因转移后28 d血管壁定量组织形态学分析显示,转染AdHRG-1组血管新生内膜面积及内膜面积与中膜面积比均显著低于转染AdGFP组[(0.13±0.03)mm2对(0.45±0.14)mm2,0.19±0.02对0.70±0.15,P<0.01],血管腔面积则显著增加[(0.88±0.07)mm2对(0.57±0.27)mm2,P<0.01],而转染AdGFP组与生理盐水处理组间无显著性差异。结论 以腺病毒为载体经血管腔内转染HRG-1可有效抑制球囊损伤后血管平滑肌细胞增殖和新生内膜形成。     

p27kip1基因转染联合化疗对胃癌细胞生长的影响

背景:p27kip1是一种抑癌基因,早期研究显示p27kip1基因转染能明显抑制胃癌、食管癌细胞生长,表明该基因疗法可能是治疗胃癌、食管癌的新途径,深入阐明p27kip1的抑癌机制,可为p27kip1基因治疗胃癌、食管癌提供可靠的理论基础.目的:研究p27kip1基因转染联合化疗对胃癌细胞生长的影响.方法:将p27kip1重组腺病毒(Adp27kip1)转染胃癌细胞SGC-7901,免疫细胞化学法检测p27kip1的表达.加入5-氟尿嘧啶(5-FU)和顺铂(DDP)后,甲基噻唑基四唑(MTT)法测定细胞生长抑制率,3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入试验测定DNA的合成.结果:Adp27kip1转染胃癌细胞后,p27kip1表达明显增强.加入5-FU和DDP后,细胞生长抑制率显著增高,3H-TdR掺入量显著降低(P＜0.01).结论:p27kip1基因转染联合化疗能明显抑制胃癌细胞的生长.     

过表达p27基因抑制血管损伤后新生内膜的形成

目的　探讨p2 7基因转染对血管损伤后新生内膜形成的影响。方法　以腺病毒为载体转染p2 7基因 ,用MTT法观察其对血管平滑肌细胞增殖的影响 ,用流式细胞仪检测细胞周期 ;在兔颈总动脉球囊损伤模型上转染p2 7基因 ,采用免疫组织化学法检测p2 7基因的表达 ,检测其对新生内膜形成的影响。结果　p2 7可明显抑制培养的血管平滑肌细胞增殖 ,细胞停滞于G1期。兔颈总动脉球囊损伤后转染p2 7基因可以减少新生内膜的形成达 2 7 4 3%。结论　以腺病毒为载体转染p2 7基因可以有效地抑制血管平滑肌细胞增殖及血管损伤后新生内膜的形成。     

重组腺病毒介导的人一氧化氮合酶基因转染对大鼠颈总动脉球囊损伤后新生内膜的影响

目的 :研究重组腺病毒介导的人内皮型一氧化氮合酶基因 (eNOS)表达生成的一氧化氮合酶 (NOS)对球囊损伤后大鼠颈总动脉新生内膜的抑制作用。方法 :在 2 93细胞内扩增、纯化Ad LacZ和Ad eNOS ,鉴定其是否携带有LacZ和eNOS基因。建立大鼠颈总动脉球囊损伤模型后 ,将磷酸缓冲液 (PBS)、Ad LacZ和Ad eNOS在体内分别转染到损伤血管段 ,以X gal染色、苏木精 伊红染色 ,免疫组化及计算机图像分析处理等方法观察转染动脉节段外源性eNOS蛋白表达及其对新生内膜的影响。结果 :重组腺病毒携带有eNOS基因 ,并且在损伤血管段得到有效表达。转染后PBS组、Ad LacZ组和Ad eNOS组的新生内膜面积分别为 (0 .187± 0 .0 18)、(0 .134± 0 .0 6 1)和 (0 .0 6 3± 0 .0 2 6 )mm 2 ,新生内膜与中膜面积比值 (I/M)分别为 1.5 76± 0 .2 73、1.342± 0 .35 7和 0 .5 6 0± 0 .16 1。与PBS组、Ad LacZ组相比Ad eNOS组无论新内膜面积 ,还是管腔狭窄程度都明显减小。结论 :腺病毒介导的eNOS基因转染能有效抑制球囊损伤后血管内膜的增生 ,可防治血管成形术后再狭窄     

P27kip1在糖尿病肾病中的作用

细胞周期激酶抑制剂p27kip1是一种细胞周期调节蛋白,对细胞生长具有重要的调控作用.实验证实,糖尿病肾病动物肾小球和体外高糖培养的肾脏固有细胞内,p27kip1水平明显增加.P27kip1通过调控肾脏固有细胞的增殖、肥大、凋亡等,参与糖尿病肾病的发生和发展,因此调控p27kip1的水平将有助于改善早期糖尿病肾病.     

KLF5介导p27kip1表达对胶质瘤U87细胞增殖和侵袭的影响

目的 观察Kruppel样因子5(KLF5)介导p27kip1对胶质瘤U87细胞增殖和侵袭的影响.方法 常规培养胶质瘤细胞U87,将其分为si-NC组和si-KLF5组,si-NC组转染对照siRNA,si-KLF5组转染KLF5 siRNA.采用MTS法检测两组细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,Boyden实验检...     

煤工尘肺并发肺癌p53、p27kip1表达的研究

目的检测p53、p27kip1基因蛋白在煤工尘肺并发肺癌与非接尘肺癌中表达的差异及意义。方法采用免疫组织化学方法分别检测p53、p27kip1在32例煤工尘肺并发肺癌及30例非接尘肺癌中的表达。结果p53在煤工尘肺并发肺癌组阳性表达率为71．88％（23／32），非接尘肺癌组阳性表达率为43．33％（13／30），两者差异有显著性（P〈0．05）；p27kip1在煤工尘肺肺癌组高表达率为28．13％（9／32），在非接尘肺癌组高表达率为40．00％（12／30），两者差异无显著性（P〉0．05）。煤工尘肺并发肺癌组中有、无淋巴结转移者p53阳性表达率差异有显著性（P〈0．05）；非接尘肺癌组，其差异亦有显著性（P〈0．05）。煤工尘肺肺癌组生存期≤18月者，与生存期〉18月者p53阳性表达差异有显著性（P〈O．05）；非接尘肺癌组p53阳性表达率在生存期≤18月者中明显高于生存期〉18月者，差异亦有显著性（P〈0．05）。煤工尘肺并发肺癌组中有、无淋巴结转移者p27kip1高表达率差异有显著性（P〈0．05）。而非接尘肺癌组，其差异无显著性（P〉0．05）。结论p53、p27kip1是煤工尘肺并发肺癌患者的重要的调控基因，并可作为判断预后的重要参考指标。     

Effect of mutant p27kip1 gene on human cholangiocarcinoma cell line, QBC939

AIM:To investigate the effects of exogenously mutated p27kip1 (p27) on proliferation and apoptosis of human cholangiocarcinoma cell line,QBC939 in vivo.METHODS:Adenviral vectors were used to transfect mutated p27 cDNA into human QBC939 cell line.Expression of p27 was detected by RT-PCR.Western blot.Cell growth,morphological change,cell cycle,apoptosis and cloning formation were determined by MTT assay and flow cytometry.RESULTS:The expression of p27 protein and mRNA was increased significantly in QBC939 cell line transfected with Ad-p27mt.The transfer of Adp27mt could significantly inhibit the growth of QBC939cells,decrease the cloning formation rate and induce apoptosis,p27 over expression caused cell cycle arrest at G0/G1 phase 72 h after infection with Adp27mt.CONCLUSION:p27 may cause cell cycle arrest at G0/G1 phase and subsequently lead to apoptosis.Recombinant adenovirus expressing mutant p27 may be potentially useful in gene therapy for cholangiocarcinoma.     

雷帕霉素支架对小型猪冠状动脉p27kip表达及内膜增殖的影响

目的　观察小型猪冠状动脉置入支架后p2 7kip表达变化及含 10 0 μg雷帕霉素可降解涂层支架释放的雷帕霉素对p2 7kip表达的影响。方法　球囊 血管以 1 3∶1比例置入过大的裸支架 (n =14 )、单高分子可降解多聚羟基丙酸乙酸 (PLGA)涂层支架 (n =16 )或雷帕霉素支架 (n =16 )并形成冠状动脉损伤模型 ,术后第 1、2、4和 12周时间段处死部分猪。测定 12周时 3组支架血管段的内膜厚度和面积。免疫组化法测定支架置入后 4个时段冠状动脉的p2 7kip表达水平及动态变化。结果　在 12周的随访组 ,裸支架、PLGA支架和雷帕霉素支架的新生内膜平均厚度分别为 (0 38± 0 2 0 )mm、(0 96± 0 5 8)mm和 (0 14± 0 12 )mm(P =0 0 0 4 ) ,3组的新生内膜面积分别为 (3 38± 0 31)mm2 、(6 4 6±2 0 1)mm2 和 (2 0 7± 0 82 )mm2 (P =0 0 0 0 )。置入裸支架 1周后 ,冠状动脉p2 7kip表达处于低水平状态 ,但在第 4周达到最高水平 ,在第 12周时 ,其表达水平恢复至第 1周时水平 ;雷帕霉素支架使整个随访期的p2 7kip表达水平无明显变化 ,均处于高水平表达状态。结论　含 10 0 μg雷帕霉素支架在 12周内有抑制小型猪冠状动脉内膜增殖的明显疗效。裸支架置入后 12周内 ,p2 7kip表达水平在第 4周最高 ;涂层支架释放的     

Skp2-RNAi suppresses proliferation and migration of gallbladder carcinoma cells by enhancing p27 expression

AIM:To explore the role of S-phase kinase-associated protein-2(Skp2)in gallbladder carcinoma and to identify whether depletion of Skp2 by Skp2-RNAi could attenuate proliferation and migration of gallbladder carcinoma.METHODS:Skp2-RNAi was transduced into cells of the gallbladder carcinoma cell line GBC-SD,using a lentiviral vector.The effect of Skp2-RNAi on the proliferation,migration,invasion and cell cycle of GBC-SD cells was studied using in vitro assays for cell proliferation,colony formation,wound healing and cell cycle.The expression of Skp2 and p27 was detected by real-time polymerase chain reaction and Western immunoblotting.The effect of Skp2-RNAi on the proliferation of GBC-SD cells in vivo was investigated by tumorigenicity experiments in nude mice.RESULTS:Lentivirus-mediated RNAi reduced the expression of Skp2 in cultured cells.The expression of the p27 protein increased along with the down-regulation of Skp2,although no significant difference was found in p27 mRNA expression.Flow cytometry revealed that Skp2-RNAi transfection significantly increased the proportion of cells in the S phase and significantly decreased the proportion of cells in the G 2 /M phase.No significant difference in the frequency of cells in the G0/G1 phase was observed.The results from the cell proliferation,colony formation and wound healing assays revealed that Skp2-RNAi transfection markedly inhibited the proliferation and migration of GBC-SD cells in vitro.Additionally,tumorigenicity experiments showed that suppression of Skp2 significantly decreased the weights of the tumors(0.56 ± 0.11 and 0.55 ± 0.07 g in the control and Scr-RNAi groups vs 0.37 ± 0.09 and 0.35 ± 0.08 g in the Skp2-RNAi-L and Skp2-RNAi-H groups).CONCLUSION:The expression of Skp2 in GBC-SD cells was inhibited following Skp2-RNAi transfection.Silencing of the Skp2 gene inhibited proliferation,migration and invasiveness of GBC-SD cells by mechanisms dependent on enhanced expression of the p27 protein.     

p27kip1基因转移对食管癌细胞生存素表达和端粒酶活性的影响

背景：p27kip1是新近发现的一种抑癌基因，早期研究表明p27kip1基因转移能显著抑制食管癌细胞和人食管癌裸鼠移植瘤的生长，表明该基因疗法可能是食管癌治疗的新途径，但其抑癌机制尚未完全阐明。目的：研究p27kip1基因转移对食管癌细胞生存素（survivin）表达和端粒酶活性的影响。从而阐明p27kip1的抑癌机制，为p27kip1基因治疗食管癌提供理论依据。方法：将携带p27kip1基因的重组腺病毒（Ad—p27kip1）和LacZ重组腺病毒（Ad—LacZ）分别转染食管癌细胞系Eca9706，观察细胞形态变化。以免疫细胞化学染色和蛋白质印迹法检测p27kip1和生存素的表达．以端粒重复序列扩增程序（TRAP）聚合酶链反应（PCR）-酶联免疫吸附测定（ELISA）检测端粒酶活性。结果：经Ad—p27kip1转染后，Eta9706细胞变圆，呈葡萄串样聚集以致脱落。细胞p27kip1表达明显增强，生存素表达降低，端粒酶活性显著受抑制。结论：p27kip1基因抑制食管癌细胞生长的作用机制可能与下调生存素表达和抑制端粒酶活性有关。     

A critical role for p27kip1 gene dosage in a mouse model of prostate carcinogenesis

In human prostate cancer, the frequent down-regulation of p27(kip1) protein expression is correlated with poor clinical outcome, yet p27(kip1) rarely undergoes mutational inactivation. Here, we investigate the consequences of reducing or eliminating p27(kip1) function for prostate carcinogenesis in the context of a mouse modeling lacking the Nkx3.1 homeobox gene and the Pten tumor suppressor. Unexpectedly, we find that triple mutant mice heterozygous for a p27(kip1) null allele (Nkx3.1(+/- or -/-); Pten(+/-); p27(+/-)) display enhanced prostate carcinogenesis, whereas mice that are homozygous null for p27(kip1) (Nkx3.1(+/- or -/-); Pten(+/-); p27(-/-)) show inhibition of cancer progression. Expression profiling reveals that Cyclin D1 is highly up-regulated in compound p27(kip1) heterozygotes, but is down-regulated in the compound p27(kip1) homozygous mutants. Using RNA interference in prostate cancer cell lines with distinct p27(kip1) gene doses, we show that prostate tumorigenicity depends on levels of p27(kip1) and that the consequences of p27(kip1) gene dosage can be attributed, in part, to altered levels of Cyclin D1. Our findings suggest that p27(kip1) possesses dosage-sensitive positive as well as negative modulatory roles in prostate cancer progression.     

慢病毒载体在大鼠颈动脉球囊损伤模型中的应用及观察

目的:研究携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的慢病毒转染球囊损伤大鼠颈动脉的效率和可行性,为利用慢病毒载体介导的基因治疗预防血管再狭窄奠定基础。方法:将携带GFP的慢病毒载体(pGC-LV-GFP载体)和慢病毒包装质粒供转染293T细胞,完成慢病毒颗粒包装及滴度测定。包装产生的慢病毒Lenti-GFP转染至球囊损伤的大鼠颈动脉。术后28d,损伤及病毒转染血管段标本分别行荧光显微镜、光镜检查,评估慢病毒的转染效率及内膜增生情况,并与假手术组(Sham组)、PBS对照组进行比较。结果:经包装产生的Lenti-GFP滴度为2×109TU/mL;术后28d,Sham组与PBS组血管中膜弹力层仅见微弱的自发性绿色荧光,而Lenti-GFP组动脉壁全层可见较强的绿色荧光分布;PBS组与Lenti-GFP转染组大鼠损伤的颈动脉均可见明显内膜增生,内膜和中膜面积之比差异无统计学意义。结论:Lenti-GFP成功转染至球囊损伤的大鼠颈动脉,并能维持目的基因稳定长期的表达,是血管再狭窄基因治疗的理想载体。     

CyclinD1和p27kipl在胰腺癌中的表达与意义

目的　探讨CyclinD1和p2 7kipl在胰腺癌组织中的异常表达及其与临床和病理特征的关系。方法　应用免疫组化技术(SABC法 )检测 42例胰腺癌、2 0例正常胰腺及 15例急慢性胰腺炎组织CyclinD1和p2 7kipl的表达。结果　CyclinD1阳性表达率在胰腺癌组织中为 71 43 % ,显著高于正常胰腺 (0 )和胰腺炎组织 (40 % ) (P <0 0 5)。CyclinD1过表达与病人年龄、性别、肿瘤发生部位、组织分化程度、临床分期及淋巴结转移无关 (P >0 0 5)。p2 7kipl蛋白阳性表达在胰腺癌组织为 45 2 4% ,显著低于胰腺炎组织 (86 67% )(P <0 0 5) ,并与胰腺癌组织分化程度、临床分期及淋巴结转移相关 (P <0 0 5) ,与年龄、性别和肿瘤发生部位无关。两种蛋白之间无明显相关 (P >0 0 5)。结论　胰腺癌组织中CyclinD1过表达 ,p2 7kipl表达下降。CyclinD1和p2 7kipl与胰腺癌发生、发展密切相关