人类Vimentin基因第1,2,6,7内含子序列的测定

[目的]人vimentin(VIM)基因位于10号染色体短臂1区3带,属于第Ⅲ型中间丝纤维蛋白基因.目前已知全部外显子序列及部分内含子序列,本文测定了部分未知的VIM基因内含子序列.[方法]通过已知VIM基因的外显子序列设计引物,用PCR扩增其未知的内含子片段,将PCR产物进行克隆测序.[结果]共测得未知的4个内含子序列,内含子1长692bp,测得其全部序列;内含子2长2kb,测得其两端与外显子相接的序列,共1kb;内含子6长456bp,测得其全部序列;内含子7长404 bp,测得其全部序列.[结论]本研究PCR检测多例人VIM基因的内含子7大小为404 bp,与文献报道人类vi-mentin基因的内含子7大小为800bp相差很大,但引物两端外显子序列相同.另外,文献报道的人类vimentin基因与外显子3相邻的第2内含子末端41nt的核苷酸序列与本研究所测的第2内含子末端序列完全不同.     

Dystrophin基因3～5号外显子缺失连接片段的克隆和测序

目的 通过对抗肌萎缩蛋白（dystrophin）因3～5号外显子缺失后连接片段的克隆和测序分析,探讨dystrophin基因缺失的发生机制。方法 先以外显子PCR反应检测证实1例杜氏肌营养不良症患者3～5号外显子缺失,然后在2、5号内含子上用PCR步移方法寻找断裂位点,最后用靠近断裂位点处设计的引物,以PCR法直接扩增dystrophin基因的缺失连接片段并测序,测序结果和正常内含子序列作对比分析。结果 获得2113bp PCR产物,本例基因缺失片段长约49000bp。5’端断裂点位于2号内含子短散在元件Alu序列内,3’端断裂点在单一序列,附近有TTTAAA序列。断裂点附近有较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点。连接片段插入了26bp序列并在断裂点周围形成3个13bp的短序列重复（GGCTTATATTTAA）连接断裂点两端。结论 推测重复序列、断裂点附近较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点关联易引起基因的断裂重组,加上非同源末端连接修复机制等综合因素可能是导致基因缺失的重要原因。     

几个单核苷酸多态在布依族、苗族和汉族个体preproEGF基因中的分布分析

目的比较分析单核苷酸多态在布依族、苗族和汉族个体preproEGF基因第20、21外显子及其内含子中的分布状况。方法 设计合成11条引物分别以布依族、苗族和汉族各个体的基因组DNA为模板进行大片段PCR扩增;DNA测序各PCR扩增产物;以GenBank资料库相应的核酸序列为参照分析比较布依族、苗族、汉族个体和外国人种的单核苷酸多态分布。结果布依、苗和汉族个体基因组样本的PCR扩增均得到一条长约4.5kb的DNA片段,其长度复盖preproEGF基因的第20、21外显子及第20内含子;与汉族个体相比较,布依族个体DNA测序结果显示有两个单核苷酸多态位点存在,一个位于preproEGF基因序列的第84329bp(T/C),另一个位于第83634bp(T/-);而苗族个体则仅存在一段长约20bp的套峰区,其中可见两个明确的套峰,分别位于第84583bp(N)和84597bp(N);与GenBank的DNA序列对比分析发现布依族个体的(T/C)多态位点在资料库中虽已报道见于其它民族群体,但在布依民族则未见报道。结论本研究首次证实了在布依族个体第20内含子区段存在一个单核苷酸多态位点84329bp(T/C);另一个多...     

代谢型谷氨酸受体7基因的拷贝数变异与精神分裂症的相关性

目的 探讨代谢型谷氨酸受体7( GRM7)基因的拷贝数变异(CNVs)与精神分裂症的相关性.方法 收集180例中国山西汉族精神分裂症患者和33名正常对照的DNA样本及资料.应用实时定量PCR方法检测位于 GRM7基因外显子2上游200 bp处和外显子8附近的CNVs.同时对实时定量PCR扩增区的基因序列进行测序.结果 相对拷贝数分析显示,在 GRM7基因外显子2上游200 bp处,1例精神分裂症患者具有双等位基因缺失,13例患者和1名正常对照具有单个等位基因缺失.测序显示 GRM7基因外显子2上游200 bp处实时定量PCR反向引物(GRM7-SV-1R)的3'末端上游第5个碱基发生了C>G变异,实时定量PCR扩增中发现的等位基因缺失均由碱基变异导致.结论 实时定量PCR结合测序可以避免PCR引物序列变异导致的假阳性缺失,是检测CNVs的有效方法.本研究 GRM7基因的CNVs与精神分裂症无相关性,提示 GRM7基因的CNVs可能不是中国汉族精神分裂症发病的主要原因,然而其潜在的罕见CNVs可能和部分精神分裂症有关,有待于进一步研究.     

用LA-PCR方法克隆东方田鼠部分Y染色体序列

目的 克隆东方田鼠长江亚种(Microtus fortis calamorum)和宁夏指名亚种(Microtus fortis fortis)Y染色体的部分序列,并挖掘这两个亚种间的单核苷酸多态性位点(SNPs).方法 本研究利用依据Y染色体保守性靶标位点(YCATS)设计的引物,测得Y染色体上的8个内含子短片段序列,进而设计长片段PCR(LA-PCR)引物来获得相距几kb的两个内含子之间的长片段序列.结果 获得东方田鼠长江亚种和宁夏指名亚种Y染色体上的7300 bp序列,比对这两个亚种的序列后发现4个SNPs位点.结论 获得了田鼠Y染色体上的7 300 bp序列和4个SNPs位点.     

应用SEFA-PCR扩增刺五加内生青霉鲨烯合酶基因的旁邻序列

①目的 克隆刺五加内生青霉Penicillium minioluteum P116-1a鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因的旁邻序列.②方法 根据已经获得的P.minioluteum P116-1a SS DNA序列设计特异性性引物,采用SEFA-PCR(self-formed adaptor PCR)扩增其3'和5'末端未知序列.③结果 3'末端扩增获得长约5 000 bp的片段,5'末端扩增获得长约3 000bp的片段.④结论 首次应用SEFA-PCR技术扩增获得P.minioluteum P116-1a SS基因的末端序列,为进一步研究该基因对刺五加皂苷含量的作用机制奠定了基础.     

迟发性脊柱骨骺发育不良家系基因诊断及遗传学发病机制分析

目的 迟发性脊柱骨骺发育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDT)是一种X-连锁隐性遗传的骨软骨发育不良疾病,主要特征包括非匀称性短躯干型身材矮小及特征性的X线片表现.目前,导致该病的已知致病基因为SEDL基因.该文的主要目的是对一个来自湖南的SEDT家系进行基因诊断和遗传学发病机制分析.方法 对一例迟发性非匀称性短躯干型身材矮小的患者进行家系分析和临床诊断;采集患者及其母亲外周血,进行DNA抽提后,对SEDL基因4个外显子的编码区进行PCR扩增;琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物是否存在及其大小;对未成功扩增的外显子进行长PCR扩增,并对长PCR扩增得到的截短PCR产物进行测序分析.结果 患者存在一个大小为1327bp的缺失,该缺失包括部分第5内含子和第6外显子编码区;患者母亲为该缺失的携带者.对缺失序列及其侧翼序列进行分析,发现第5内含子存在一个Alu序列,与第6外显子非编码区4个Alu序列序列高度相似;提示这些Alu序列的存在可能是SEDL基因发生类似缺失突变的遗传性发病机制的分子结构基础.结论 该文在一个湖南家系中发现的SEDL基因缺失突变,即包括第6外显子编码区在内的1 327 bp缺失,是一个新发现的国际上尚未报道的突变.对SEDL基因的突变检测有助于患者迟发性脊柱骨骺发育不良的确诊,也为女性携带者的诊断,产前诊断和遗传咨询奠定重要的前提基础.     

人结肠癌组织环加氧酶-2 mRNA剪接异构体片段分离与克隆

目的 探讨人结肠癌组织中是否存在环加氧酶-2(COX-2)选择性剪接异构体的表达及其可能意义。方法 针对人COX—2 DNA第7、8外显子序列，设计一对全新引物，并采用RT—PCR技术，从结肠癌组织中分离COX—2 mRNA，然后对电泳条带进行克隆、测序和分析。结果 正常结肠组织和结肠癌组织均发现COX—2目的条带(252bp)，但结肠癌组织则出现了一条新的电泳带(534bp)，经克隆和测序证实，该条带除目的条带的COX—2 DNA的第7、8外显子序列外，还包含第7、8外显子间的内含子序列，即保留的内含子(282bp)。根据阅读框推测，在保留的内含子第48～50碱基出现终止密码。结论 首次发现结肠癌组织中存在COX—2基因的选择性剪接异构体(Genbank accession number：BU493602，AY1512980)，其所编码蛋白可能较已报道的COX—2酶蛋白小，且蛋白质的C末端缺少阿斯匹林作用位点。     

PCR-SSP RHD基因定型方法的初步应用

目的采用序列特异性引物PCR技术(PCR-SSP)进行RHD基因定型.方法采用新近报道的PCR-SSP RHD定型方法检测10例RhD阳性个体,包括2例哈萨克族人、2例蒙古族人、2例藏族人和4例维吾尔族人,以及11例RhD阴性个体(汉族10例、维吾尔族人1例),并通过测序和内含子检测分析1例汉族个体的RHD基因型.结果全部样品的PCR-SSP检测结果与血清学表型相符,1例汉族RhD阴性个体鉴定为D放散型,携带RHD1227A等位基因,1例个体的检测结果提示携带融合RHD基因.测序分析显示该融合基因的第1、2和第10外显子序列与正常RHD基因相应外显子相同,而缺失其余外显子,由于RHD基因和RHCE(e)基因的第2外显子序列相同,笔者采用PCR方法检测RHD基因第2内含子,结果为阴性,说明该个体携带的融合基因为RHD-CE(2-9)-D2等位基因.结论 PCR-SSP可用于中国人Rh血型D抗原基因定型.     

杜氏盐藻2种碳酸酐酶基因跨内含子DNA序列的克隆和鉴定

目的：克隆杜氏盐藻双拷贝碳酸酐酶(DCA1)和碳酸酐酶(CA1)基因跨内含子基因组DNA序列。方法：利用跨内含子PCR方法,从杜氏盐藻基因组中克隆DCA1和CA1基因跨内含子基因组DNA序列。结果：DCA1基因跨内含子长度为4407bp,含7个外显子,由此推定的氨基酸序列长度为555个氨基酸残基;而CA1基因跨内含子长度为4473bp,含8个外显子,其推定的氨基酸序列长度为498个氨基酸残基。这2种基因的所有外显子一内含子交接点处序列都遵守GT—AG规律。结论：首次克隆得到了杜氏盐藻DCA1和CA1基因跨内含子DNA序列。     

人血小板生成素基因cDNA和基因组DNA的克隆和序列测定

目的 研究内含子和5′非翻译区对血小板生成素（TPO）基因表达的影响。方法 以中国人胎肝mRNA为模板,应用RT－PCR和长距离PCR（LD－PCR）技术扩增了约1.1kb的全长人TPO cDNA,6.2kb的TPO基因组DNA和TPO基因组中的内含子I,内含子Ⅱ-Ⅳ和内含子Ⅴ。结果 全序列分析表明,全部的编码序列、所有的内含子／外显子剪切部位序列同已知一致,个别差异发生在内含子中。结论 通过PCR扩增技术,成功地从中国人胎肝组织中克隆了全长人TPO cDNA、TPO基因组DNA及其全部的内含子。     

Channel catfish重组激活基因克隆与鉴定

目的尝试用简并引物扩增序列未知的channel catfish基因组DNA中ragl基因的片段并测序,为ragl基因的早期进化模式和遗传学变异情况的研究提供直接的证据.方法基于ragl基因的高度保守设计简并引物,PCR扩增channel catfish基因组DNA中ragl基因的片段,TA克隆并双向测序.将所得序列资料拼接,用多种生物信息学方法分析其ORF、内含子、与其它物种ragI基因及Ragl蛋白的相似性,并做多序列比较和系统进化树分析.结果扩增出3条chan-nel catfish ragl基因的DNA片段.从拼接后的序列中找到一2 235bp的ORF和一293bp的内含子,所得序列与其它物种ragl基因的相似程度高(多大于70%),去除内含子后的channel catfish ragl基因序列与zebrafish、rainbow trout、bull shark的ragl基因cDNA全序列碱基一致的位点占43.9%,自第1 352位碱基至2 925位碱基为53.1%,而自第1位碱基至1 351位碱基为33.2%,有非常显著的差异(P＜0.01).结论用简并引物成功扩增出channel catfish ragl基因的DNA片段.序列在GenBank中的登记号是:AY423858(去除内含子序列),AY423859.ragl基因进化缓慢,高度保守,不同物种ragI基因的变异相对集中在氨基末端的区域.系统进化树分析显示了13种硬骨鱼在进化上关系的亲疏.     

常染色体显性遗传帕金森病家系1例基因缺失序列分析

目的:分析常染色体显性遗传帕金森病家系的基因缺失.方法:根据Parkin基因外显子和内含子DNA序列合成14对引物,以人基因组DNA为模板,巢式PCR扩增,扩增产物纯化后直接测序.通过与正常人相应的DNA序列比较,检测1例常染色体显性遗传帕金森病家系基因缺失位点.结果:该家系检测到染色体6q25.2-q27Parkin基因外显子3中110 bp的缺失,第4和第5外显子检测到部分碱基的变异.结论:Parkin基因外显子3缺失的检出对常染色体显性遗传帕金森病的早期诊断和基因治疗具有指导意义.     

肝癌相关基因的分子克隆和可变剪切分析

目的: 获取肝癌相关基因(hepatoma associated gene,HTA)的mRNA分子全长序列并对其可变剪接进行分析,检测其转录本在各肝癌细胞系中的表达,为进一步研究该基因在肝癌发生、发展中的作用奠定基础。方法: 用3'RACE 和5'RACE方法扩增HTA基因的全长序列并对其序列信息和可变剪接进行扩增和测序分析,用Northern印迹检测该基因转录本在不同肝癌和正常肝细胞系中的表达。结果: HTA基因全长序列为1414 bp,经分析该序列包含3个外显子,2个内含子,其中2号内含子在可变剪接中被作为外显子表达。Northern印迹显示HTA基因1.7 kb转录本和1.4 kb转录本均表达于恶性肝癌细胞系,而不表达于正常细胞系。结论: 成功获得了HTA基因的全长序列并对其可变剪接进行了分析,2个大小不同的转录本均在肝癌细胞系中特异性表达,作为一个肝癌相关基因值得进一步深入研究。     

人血小板生成素基因cDNA和基因组DNA的克隆和序列测定

目的研究内含子和5'非翻译区对血小板生成素(TPO)基因表达的影响。方法以中国人胎肝mRNA为模板,应用RT-PCR和长距离PCR(LD-PCR)技术扩增了约1.1kb的全长人TPOcDNA,6.2kb的TPO基因组DNA和TPO基因组中的内含子Ⅰ,内含子Ⅱ~Ⅳ和内含子Ⅴ。结果全序列分析表明,全部的编码序列、所有的内含子/外显子剪切部位序列同已知一致,个别差异发生在内含子中。结论通过PCR扩增技术,成功地从中国人胎肝组织中克隆了全长人TPOcDNA、TPO基因组DNA及其全部的内含子。     

汉族联合垂体激素缺乏儿童PROP1及PIT-1的基因突变分析

目的分析汉族联合垂体激素缺乏（CPHD）儿童PROP1及PIT-1基因突变及其特点。方法研究对象为7例汉族CPHD儿童和50例身高正常的汉族成年人。分别取其外周血5ml,提取基因组DNA,应用聚合酶链式反应（PCR）扩增PROP1基因全部3个外显子及PIT-1基因的全部6个外显子及其周围部分内含子。应用正反向引物对PCR产物进行直接DNA序列测。结果在7例汉族CPHD儿童中未发现PROP1及PIT-1基因致病突变;但检测出4个PROP1基因多态性,即27T〉C、59A〉G、109＋3C〉A和424G〉A。结论 PROP1及PIT-1基因突变不是本研究7例汉族CPHD儿童的主要致病原因。     

DMD基因内含子的重复序列与内含子不稳定性和基因缺失的关联

[目的]为了研究DMD基因内含子的重复序列与内含子不稳定性和基因缺失的关联,我们分析了缺失型DMD病人的连接片段的断裂点并研究了DMD基因内含子结构与内含子不稳定性之间是否存在相关.[方法]多重引物PCR法鉴定缺失型DMD患者,分别克隆46和51号外显子缺失后形成的连接片段,测定连接片段的序列;并用计算机分析DMD基因可以获得的全部内含子的结构特点.[结果]对46号和51号外显子缺失后形成的连接片段的序列分析表明,5'和3'端的断裂点均位于重复顺序,断裂点附近无小插入、小缺失或点突变.对连接片段的二级结构分析表明,所有的断裂点均位于单链发夹结构的非匹配区.对DMD基因可以获得的全部内含子的结构分析表明,在DMD基因全长内含子中重复序列占大约34.8%.大量重复序列的存在是许多内含子的重要结构特征.[结论]重复序列是DMD基因多数内含子的关键结构,与内含子的不稳定性相关.在原有DNA序列的基础上,单链发夹结构的形成增加了DMD基因的不稳定性,形成了基因断裂的基础,单链发夹结构的形成导致两个断裂点的靠近,最终导致了基因缺失.     

KAIl基因与肿瘤转移

转移是恶性肿瘤的主要特征 ,又是恶性肿瘤治疗失败和患者死亡的主要原因。随着分子生物学的深入研究 ,人们对肿瘤的发生基础有了明确的认识。目前已知 ,肿瘤转移与肿瘤发生一样 ,不仅有促进基因的激活 ,还有抑制基因的失活。肿瘤转移抑制基因的存在是在细胞融合实验中证实的。 1995年 ,Dong等自转移到AT6 .1细胞系中的人第 11号染色体中分离到特异性抑制肿瘤转移的基因命名为KAI1[1] 。1　KAI1基因的结构KAI1基因位于人染色体 11p11.2上 ,该基因全长约80kb,含 8kb的 5′区、10个外显子、9个内含子和 8kb的 3′区。外显子的大小由 73bp(…     

运用PCR直接测定基因组DNA序列法检出一种中国人中罕见的β-地中海贫血基因突变(简报)

借助PCR(聚合酶链反应)技术可直接测定人基因组DNA中特定基因片段的序列.用双脱氧末端终止法测定单链DNA(ss-DNA)序列比测定双链DNA(ds-DNA)序列效果好,故本实验建立用PCR产生ss-DNA,进而测定其序列以便检测β地中海贫血基因突变的方法.扩增的β珠蛋白基因片段从启动子5’端到第二内含子长615bp.所用引物序列:Ⅰ.5’GCCAAGGACAGGTACGGCT GT CATC 3’;Ⅱ.5’TGC AGC TTG TCA CAG TGC AGC TCA CT 3’.利用PCR产生ss-DNA的策略有两个.一是用引物Ⅰ和Ⅱ扩增出ds-DNA,经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离.回收特异的ds-DNA;再以后者     

两种蚊虫钠通道基因kdr突变点附近序列的研究

目的 分析白纹伊蚊和致倦库蚊钠离子通道基因kdr突变位点附近的核苷酸序列，为进行抗药性监测奠定基础。方法 根据献报道的两种蚊虫钠离子通道基因序列设计引物，分别以白纹伊蚊和致倦库蚊基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得包含击倒抗性突变位点和一个内含子的钠通道基因片段，将其核苷酸序列与蚊虫钠通道基因cDNA序列进行比较，确定内含子的位置及序列。结果 两种蚊虫的内含子序列变异较大，它们在kdr突变位点附近的序列很保守。结论 该内含子序列的变异并不影响用PCR方法检测这两种蚊虫的拟除虫菊酯抗性。