PCR-RFLP技术快速鉴定八种致病丝状病原真菌的实验研究

目的 建立能快速鉴定深部丝状真菌感染病原菌的PCR-RFLP方法。方法 用真菌通用引物扩增烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、尖端赛多孢和串珠镰刀菌的ITS区,分别用HhaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ、TaqⅠ和MspⅠ 5种限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切,建立以PCR为基础的RFLP方法,然后对22株临床株和2株环境分离株进行PCR-RFLP图谱分析。结果 对PCR产物进行RFLP分析可以准确鉴定8种深部致病丝状真菌,从DNA提取到酶切分析可以在1个工作日完成。22株临床株和2株环境分离株PCR-RFLP鉴定结果与传统的形态学鉴定结果一致。结论 PCR-RFLP技术是一种能够快速鉴定丝状真菌的有效方法。     

PCR-RFLP检测皮肤分枝杆菌

目的建立检测8种常见皮肤分枝杆菌的PCR-RFLP方法。方法①用通用引物对分枝杆菌的热休克蛋白hsp65基因序列进行PCR扩增：②用限制性内切酶BstEⅡ和HaeⅢ对扩增产物进行消化,根据所得片段确定各分枝杆菌特征性的酶切图谱,从而对分枝杆菌进行鉴别。结果 8种常见皮肤分枝杆菌感染标准株(鸟、胞内、堪萨斯、结核、瘰疬、海、偶发、龟分枝杆菌)的酶切图谱与文献报道一致。结论 PCR-RFLP方法可用以检测鉴定皮肤分枝杆菌。     

拓扑异构酶II基因区PCR-RFLP法鉴别常见皮肤癣菌

目的:探讨拓扑异构酶II基因区PCR-RFLP法鉴别常见皮肤癣菌的可行性。方法:用真菌拓扑异构酶II基因区通用引物dPsD1、dPsD2,先后对6种34株临床常见皮肤癣菌和2株白念珠菌以及4株曲霉的DNA进行巢式PCR(nested PCR)扩增,扩增后的阳性产物分别用限制性内切酶Hinc II和Hinf I酶切,进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析,根据结果来鉴定皮肤癣菌并在种的水平上区分这6种常见皮肤癣菌。结果:通用引物dPsD1对6种皮肤癣菌均能扩增出3 390 bp、dPsD2能扩增出2 380 bp的片段,而白念珠菌和曲霉则未见阳性扩增条带。扩增出的产物分别经Hinc II和Hinf I酶切后表现为58~1 670 bp长短不等的片段组合,根据这些特异性条带谱可以区分这6种临床常见皮肤癣菌。结论:拓扑异构酶II基因区的巢式PCR-RFLP方法,是鉴定和区分常见皮肤癣菌的有效方法。     

菌落PCR技术快速鉴别丝状真菌的实验研究

目的 探讨菌落PCR在检测病原性丝状真菌方面的应用价值。方法 初步建立用于丝状真菌的菌落PCR检测技术,用19种丝状真菌标准株进行验证,所有菌落PCR扩增产物进行测序,并选取8种菌株的菌落PCR产物和酶切结果与常规PCR进行比较,检测其准确性和可靠性。结果 19株菌中有16株（84.2%）菌落PCR成功扩增内转录间隔（ITS）区,ITS区基因序列分析鉴定菌种正确,与NCBI数据库中相同菌种的相似度为96% ~ 100%;与常规PCR进行比较的8株菌中,除构巢曲霉菌落PCR扩增结果为阴性外,其他菌种菌落PCR产物及酶切条带与常规PCR基本一致。结论 与常规PCR相比,菌落PCR检测丝状真菌操作简单,省时省力,鉴定菌种具有较高的准确性和可靠性,可以用于丝状真菌的快速鉴定。     

半巢式PCR-RFLP法快速鉴定临床标本中的皮肤癣菌

目的探索快速鉴定皮肤癣菌病临床标本中致病菌的分子生物学方法。方法以皮肤癣菌的基因组DNA为模板,采用一对半真菌通用引物(NS5、ITS1、ITS4)行半巢式PCR扩增rDNA上的ITS段,用限制性内切酶BciT130Ⅰ及DdeⅠ酶切目的片段,凝胶电泳。结果7种65株常见皮肤癣菌培养菌株和17例临床标本的半巢式PCR-RFLP图谱特异;且临床标本与相应的培养菌株酶切图谱一致。结论半巢式PCR-RFLP方法适合培养菌株和临床标本病原菌的快速准确鉴定。     

拓扑异构酶Ⅱ基因区PCR-RFLP法鉴别常见皮肤癣菌

目的：探讨拓扑异构酶Ⅱ基因区PCR～RFLP法鉴别常见皮肤癣菌的可行性。方法：用真菌拓扑异构酶Ⅱ基因区通用引物dPsD1、dPsD2，先后对6种34株临床常见皮肤癣菌和2株白念珠菌以及4株曲霉的DNA进行巢式PCR（nested PER）扩增，扩增后的阳性产物分别用限制性内切酶HincⅡ和HinfⅠ酶切，进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析，根据结果来鉴定皮肤癣菌并在种的水平上区分这6种常见皮肤癣菌。结果：通用引物dPsD1对6种皮肤癣菌均能扩增出3390bp、dPsD2能扩增出2380bp的片段，而白念珠菌和曲霉则未见阳性扩增条带。扩增出的产物分别经HincⅡ和HinfⅠ酶切后表现为58—1670bp长短不等的片段组合，根据这些特异性条带谱可以区分这6种临床常见皮肤癣菌。结论：拓扑异构酶Ⅱ基因区的巢式PCR—RFLP方法，是鉴定和区分常见皮肤癣菌的有效方法。     

应用种特异性DNA探针原位杂交技术检测系统性曲霉感染

目的 探讨应用原位杂交技术（ISH）特异性检测系统性曲霉感染临床标本的可行性。方法 以对烟曲霉高度特异的碱性蛋白酶基因片段作为种特异性探针，聚合酶链反应（PCR）扩增制备，并以地高辛标记，与16例福尔马林固定、石蜡包埋疑为系统性曲霉感染的临床组织标本中的靶DNA杂交。结果 16例可疑曲霉感染标本13例阳性，其他真菌感染组织均为阴性。结论 该技术可以敏感、特异地检测出组织中曲霉的感染。由于此探针是烟曲霉特异的，并与黄曲霉有一定的同源性，推论应用该DNA探针可以筛选出临床常见的这种曲霉的感染，适用于临床曲霉感染的检测。     

PCR-RFLP法三种凝胶电泳快速鉴定分枝杆菌的比较研究

目的:比较2%一般琼脂糖凝胶、2%Metaphor琼脂糖凝胶和10%非变性聚丙烯酰胺凝胶分析分枝杆菌标准株酶切片段的准确性.方法:采用通用引物对分枝杆菌hsp65基因序列进行PCR扩增,限制性内切酶BstE II和Hae III对扩增产物进行消化,分别采用2%一般琼脂糖凝胶、2%Metaphor琼脂糖凝胶和10%非变性聚丙烯酰胺凝胶比较分枝杆菌标准株酶切片段的准确性.结果:与标准酶切图谱相比,所有10%非变性聚丙烯酰胺凝胶酶切片段差异均在15 bp以内,而2%Metaphor琼脂糖凝胶和2%一般琼脂糖凝胶则超过15 bp,甚至少数条带不能显示.结论:三种方法中以PCR-RFLP非变性聚丙烯酰胺凝胶法的准确性较高.     

基于omp1基因VS1-VS2序列的沙眼衣原体RFLP基因分型

目的:建立和评价基于omp1基因VS1-VS2序列的沙眼衣原体RFLP基因分型技术。方法:采用巢式聚合酶链反应(PCR)扩增omp1基因的VS1-VS2序列,以限制性酶切片段多态性分析(RFLP)进行检测分型,与VS1-VS2测序分型结果比较。结果:扩增12株沙眼衣原体标准株omp1基因VS1-VS2序列,长度为453-463 bp,用AluⅠ及DdeⅠ酶切此得出标准血清型的特征性图谱。37例沙眼衣原体ELISA检测阳性标本的VS1-VS2-PCR扩增均阳性,RFLP检到B-K型和2例混合型感染,分型率为94.59%。与DNA直接基因测序分型进行对比,符合率为94.59%。结论:基于omp1基因VS1-VS2序列的沙眼衣原体RFLP基因分型技术,较以前的方法更为敏感和特异,可作为对沙眼衣原体分型研究的工具。     

曲霉生物膜研究进展

真菌生物膜的形成是与临床死亡率密切相关的一个重要问题。近年来,曲霉生物膜日益受到研究人员的关注,研究发现,在侵袭性曲霉病感染中大多数存在着生物膜的感染源。曲霉形成生物膜以后可以逃逸宿主的免疫作用,在感染部位难以清除,是临床上难治性感染的重要原因。概述曲霉生物膜形成过程及结构、曲霉生物膜形成的影响因素以及生物膜形成导致抗真菌药耐药的机制等几个方面的研究进展。