LAPTM4B-35蛋白作为肝癌血清学诊断新标志物的探讨

目的: LAPTM4B-35是北京大学基础医学院发现和鉴定的一个肿瘤驱动基因LAPTM4B所编码的蛋白质同型分子(isoform)之一,其在多种恶性肿瘤中[如肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌等]均超高表达。实验室和临床资料均证明,LAPTM4B-35蛋白的过表达促进肿瘤生长、转移和多药耐药,LAPTM4B-35的蛋白表达水平与肝癌的复发相关。本文的目的在于鉴定患者体内的肝癌细胞和体外培养的肝癌细胞系是否释放出LAPTM4B-35蛋白到血液和细胞培养液中,以及其可能的存在形式,为建立肝细胞癌等肿瘤的血清学诊断新方法奠定基础。方法: 采用免疫印迹分析(Western blot)、酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)鉴定LAPTM4B-35蛋白,应用超滤和超离心方法从肝癌细胞培养上清液中分离、纯化外排体(exosome)。结果: 特异性抗体的ELISA结果表明,肝细胞癌患者的血液中存在LAPTM4B-35蛋白,体外培养的肝癌细胞以外排体形式释放LAPTM4B-35蛋白到培养基的上清液中。ELISA夹心法检测表明,肝细胞癌患者(n=43)血淸中LAPTM4B-35蛋白的平均水平和中位值均显著高于正常人(n=33)。结论: 肝癌细胞以外排体形式释放到其外环境中的LAPTM4B-35蛋白有望成为肝细胞癌血清学诊断的新标志物。     

肝癌相关成纤维细胞的培养和鉴定及其对肝癌细胞增殖的影响

目的：分离、培养及鉴定原代肝癌相关成纤维细胞(hCAF),阐明其在肝癌发生发展中的作用。方法：采用酶消化法分离、纯化人hCAF, Western blotting法鉴定其相关蛋白标记物的表达,流式细胞术检测肝癌细胞Hep3B经hCAF上清处理后的增殖速度及细胞周期的变化,建立裸鼠移植瘤模型,观察hCAF对肝癌细胞生长的影响。结果：在肝癌组织标本中成功分离出hCAF,Western blotting结果显示hCAF特异性地高表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）。CCK8细胞增殖检测试剂盒检测证实,经hCAF上清处理后的Hep3B细胞增殖量为完全培养基处理48 h细胞增殖量的126.0%、125.0%及120.5%,细胞增殖量差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞术结果显示,经hCAF上清处理后的Hep3B细胞增殖速度及细胞周期中处于S期的细胞数目均高于完全培养基处理的Hep3B细胞（P<0.05）。hCAF与Hep3B共同接种至裸鼠皮下的成瘤体积［（1.34±0.52） cm3］明显大于单独接种Hep3B组［(0.51±0.09)　cm3］,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：hCAF可以明显促进肝癌细胞系Hep3B的生长,其可能在肝癌生长过程中发挥重要作用。     

LAPTM4B基因多态性与肺癌易感性的关系

目的:探讨溶酶体相关4次跨膜蛋白质β(lysosome-associated protein transmembrane4 beta,LAPTM4B)基因多态性与肺癌易感性的关系.方法:以病例-对照研究的方法,用基于特异性引物的PCR对134例正常人和162例肺癌患者进行LAPTM4B基因分型,将卡方检验用于检测肺癌组和对照组基因型频率和其它参数的分布.结果:LAPTM4B的*2等位基因频率在肺癌组中为40.1%,较对照组(28.0%)显著增高(P=0.002).基因型分布在肺癌组和对照组间差异有统计学意义.*1/2和*2/2基因携带者患肺癌的危险性分别是*1/1的1.91倍(95%CI:1.178～3.110)与3.26倍(95%CI:1.338～7.929).LAPTM4B基因型分布与患者年龄,肺癌的病理类型,分化程度,临床分期以及HBV感染等无明显关系.结论:LAPTM4B基因多态性与肺癌易感性相关,* 2等位基因可能是肺癌发生的危险因素.     

B7-H3对人肝癌细胞生物学特性的影响及临床意义

目的 研究下调B7-H3分子的表达对人肝癌(HCC)细胞生物学特性的影响,探讨B7-H3表达对HCC组织发生发展的临床意义。 方法 选择两株B7-H3表达水平较高的HCC细胞,通过RNA干扰技术下调HCC细胞B7-H3的表达,采用CCK-8、流式细胞术、细胞划痕和Transwell小室等技术,观察HCC细胞在增殖、凋亡、迁移及侵袭等方面的改变; 制备不同复发时间(1年内复发和超过1年复发)的HCC组织芯片,采用免疫组织化学法检测B7-H3在80例HCC组织及癌旁肝组织中的表达,进一步分析B7-H3的表达与HCC复发转移及其他临床病理参数的关系。 结果 选择B7-H3表达水平较高的HCC细胞株SK-hep-1和MHCC97L,转染B7-H3 siRNA后构建B7-H3下调的细胞模型,发现下调B7-H3蛋白后,HCC细胞的侵袭和迁移能力显著下降(P<0.05),而增殖和凋亡能力未见明显影响; B7-H3在肝癌组织中的阳性率(73.33%)高于癌旁肝组织(54.67%)(P=0.041); B7-H3阳性表达率与HCC分化程度(P=0.012)、复发时间(P=0.001)、转移情况(P=0.007)呈正相关,而与年龄、性别、肿块大小、甲胎蛋白(AFP)等临床病理特征无明显相关。 结论 B7-H3可作为HCC复发与转移的潜在指标,下调B7-H3表达可为抑制HCC侵袭提供新思路。     

人EIF2B4基因一个新的可变剪接产物及其鉴定

目的对人EIF2B4基因新的可变剪接产物进行鉴定。方法应用长链RT-PCR技术扩增人外周血EIF2B4基因编码区全长序列并进行T克隆及序列测定,用常规RT-PCR对新型可变剪接产物进行验证。结果在EIF2B4基因转录产物中检测出正常变异体2和3(两者只相差3个碱基),同时发现一个外显子7缺失26bp的转录产物。结论利用长链RT-PCR结合T克隆-测序的方法,发现人EIF2B4基因的一个新型可变剪接产物。     

人原发性肝癌相关抗原的蛋白质组学初步研究

目的 检测肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的相关抗原,并予以验证.方法 分别提取15例HCC组织及其癌旁组织总蛋白.Western blot分别检测各总蛋白与其HCC患者自体血清的杂交情况.双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)技术将15例混合总蛋白中的各蛋白进行分离与染色.图像分析法比对染色胶上HCC组织及其癌旁组织蛋白的表达差异,基质辅助激光解吸/电离飞行时间二级质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight with two mass analyzers for tandem mass spectrometry,MALDI-TOF MS/MS)技术及生物信息学网络数据库分别对表达差异蛋白予以分析鉴定与检索匹配,免疫组织化学与Western blot分别检测该差异蛋白在人HCC组织及其癌旁组织中的变化情况.结果 2-DE染色胶图像分析比对结果显示,HCC及其癌旁组织蛋白表达差异斑点共90个,MALDI-TOF MS/MS与数据库对其中19个蛋白斑点分析鉴定与检索匹配发现15个蛋白表达上调,4个蛋白表达下调.免疫组织化学与Western blot检测结果显示,与对照比较,上调蛋白中的DnaJ同源B亚家族成员11 (dnaJ homolog subfamily B member 11,DNAJB11)在HCC组织中的表达明显增强,下调蛋白中的蛋白酶体亚基α3 (proteasome subunit alpha type 3,PSMA3)在HCC组织中的表达则相反.结论 人原发性肝癌相关抗原DNAJB11在HCC组织中的表达上调,PSMA3在HCC组织中的表达下调.     

IL-17RA表达对肝细胞癌(HCC)患者的预后意义及其对HCC细胞株生物学特性的影响

 目的 探讨IL-17RA在人肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）组织中表达情况及其对肝肿瘤切除患者预后的影响,并评价其对HCC细胞株生物学特性的影响。方法 收集163例HCC组织并制成组织芯片,免疫组化染色法检测肿瘤组织中IL-17RA的表达情况,Kaplan-Meier法和Cox回归模型分析患者总生存期的影响因素。采用siRNA瞬时转染高侵袭性肝癌细胞株MHCC-97H和Huh7以下调IL-17RA的表达,用划痕实验、Transwell侵袭实验检测转染前后MHCC-97H和Huh7细胞株迁移、侵袭能力,用CCK8方法检测转染前后奥沙利铂对MHCC-97H和Huh7细胞株的抑制率。结果 肿瘤直径大于10 cm （HR=1.820,P=0.028）、合并癌栓（HR=2.087,P=0.003）以及IL-17RA高表达（HR=1.579,P=0.042）是影响HCC患者术后总生存期的独立危险因素;siRNA瞬时转染下调HCC细胞株MHCC-97H和Huh7的IL-17RA表达后,肿瘤细胞的迁移、侵袭能力明显下降,奥沙利铂对肿瘤细胞的抑制率显著提高。结论 IL-17RA高表达是影响HCC患者术后生存的独立危险因素,抑制其表达可以降低HCC细胞株的迁移、侵袭能力,提高奥沙利铂对肝癌细胞株的抑制率。     

Dll4基因靶向RNAi重组腺相关病毒载体的构建和高滴度病毒制备

目的：构建一个表达肿瘤血管生成调节基因Delta-like ligand4（Dll4）小干扰RNA的重组腺相关病毒载体,制备靶向性抑制Dll4表达的高滴度重组腺相关病毒。方法：将包含肿瘤血管生成调节基因Dll4特异性小干扰RNA片段的质粒用EcoRI＋SalI双酶切,回收目的片段,将pSNAV2.0质粒用EcoRI＋SalI双酶切后同目的片段连接,脂质体法转染BHK-2l细胞,G418筛选后以辅助病毒感染获取病毒。结果：PCR和测序证实,成功构建包含U6启动子和肿瘤血管生成调节基因Dll4特异性RNA干扰片段的重组腺相关病毒载体,并制备出滴度为2.4×10^11 vectorgenome/L高滴度腺相关病毒。结论：成功构建携带Dll4基因短发夹状干扰RNA的腺相关病毒载体。为下一步探索抗肿瘤血管生成基因治疗的新途径提供实验基础。     

PAQR4在肝细胞癌中的表达及其对HepG2细胞生物学特性的影响

目的 探究PAQR4在肝细胞癌(HCC)中的表达、预后及其对HepG2细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响.方法 利用TCGA数据库中HCC的数据分析PAQR4 mRNA在HCC组织中的表达及对患者的预后意义.构建pcD-NA3.1-PAQR4实验组与pcDNA3.1-vector对照组的HepG2细胞株.采用CCK-8...     

人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株的建立及其生物学特性观察

目的:建立人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株。方法:采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击的诱导方法建立5-FU获得性BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株。MTT法检测耐药细胞株对多种化疗药物的交叉耐药性。观察其细胞形态学、生长曲线、倍增时间、平板克隆形成率、贴壁率、细胞周期分布、染色体核型以及裸鼠致瘤性。流式细胞术检测阿霉素在亲本及耐药细胞株内的积聚量。免疫细胞化学法检测胸苷酸合酶在耐药细胞内的表达。结果:成功建立人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株模型。该耐药细胞对阿霉素、长春新碱、奥沙利铂及甲氨蝶呤均有不同程度的交叉耐药性,但对羟基喜树碱仍较敏感。体外培养见细胞趋向群集性生长。耐药细胞株倍增时间较亲本细胞株长,克隆形成率则较亲本细胞株低,差异有统计学意义。耐药细胞贴壁率在23、h明显低于亲本细胞株,其G0/G1期细胞分布比率较低而S期比率明显增加。阿霉素在耐药细胞株内的积聚量低于亲本细胞株,耐药细胞株胸苷酸合酶的蛋白表达量较亲本细胞株明显增强。结论:人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株可以成为研究5-FU获得性耐药机制及开展多药耐药逆转剂筛选较好的体外模型。     

LAPTM4B启动子荧光素酶报告基因重组体的构建

目的:LAPTM4B基因是肝癌中高度表达的新基因。为下一步LAPTM4B启动子的活性分性,本文构建了LAPTM4B基因启动子调控的报告基因重组表达质粒。方法:以LAPTM4B基因组cDNA为模板扩增翻译起始位点上游DNA序列。PCR产物定向克隆到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,并经限制性内切酶消化鉴定。结果:通过酶切鉴定和基因测序,证明成功地构建了三种不同长度的pGL3-LAPTM4B-Luc荧光素酶表达质粒,形成了系列的LAPTM4B启动子重组体。结论:充分利用生物信息学资源,利用已知基因的启动子序列,可快速,准确地克隆已知基因启动子序列并构建启动子载体。LAPTM4B启动子荧光素酶报告基因重组体的构建为LAPTM4B启动子的活性分析奠定了基础。     

肝癌中乙型肝炎病毒整合位点的研究

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）在肝细胞染色体上的整合规律及其在肝癌形成中的作用.方法以蛋白酶消化/酚抽提法,自40例乙肝相关性肝癌标本中抽提组织DNA.以肝癌组织DNA为模板,HBV X基因上游序列和人类基因组Alu重复序列为引物,多聚酶链反应法（PCR）扩增出HBV X基因及其侧翼的人基因组DNA片段.PCR产物割胶回收后以ABI公司3700测序仪进行全自动测序,所获结果经NCBI（national center for biotechnology information）BLAST及MapViewer检索确定HBV整合在染色体上的精确位置.结果在40例乙肝表面抗原阳性的肝癌组织中,有34例（85%）存在HBV整合现象.每份标本中的病毒整合拷贝数为1～5个不等,因此共获得了68个病毒整合位点.从病毒基因分析,整合可发生于X基因的任何长度,并不集中于通常认为的HBV DR1和DR2区,但在96%（65/68）的整合中,X基因均以截短形式插入宿主细胞DNA;从宿主基因分析,HBV偏好插入于基因的内含子和上游调控区,未见外显子中的插入.这些基因80%已被报道与肿瘤有关,它们的产物大多与细胞基本生存和死亡密切相关,可在各个细胞调控环节上促进肿瘤生成.十分有意义的是,在总共26个基因中即有3个基因（myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 4,Gprotein alpha transducing activity polypeptide 1和fibronectin 1）发现被HBV重复整合.结论HBV在肝癌细胞染色体上的整合并不呈均衡分布,病毒对宿主细胞的＂插入诱变＂及整合子中持续表达的＂截短型X蛋白＂可能在病毒的致癌过程中起重要作用.     

Proteomic analysis of differently expressed proteins in human hepatocellular carcinoma cell lines HepG2 with transfecting hepatitis B virus X gene

Background Hepatitis B virus encoded X protein （HBx） is a trans-activating protein that may be involved in hepatocarcinogenesis, although few natural effectors of HBx that participate in this process have been identified. We screened, by comparative proteomics method, effectors of HBx associated with hepatocarcinogenesis.
Methods HBx positive and negative HepG2 cells were constructed and expression patterns of cellular proteins were obtained by high resolution, two dimensional electrophoresis. Comprehensive analyses of proteins associated with hepatocellular carcinoma （HCC） were focused on the differently expressed proteins （more than two-fold increase or decrease, P 〈0.05） from HBx positive and negative HepG2 cells. For peptide mass fingerprinting, protein spots with different intensity between HBx positive and negative HepG2 cells were directly cut out of gels and processed for matrix assisted, laser desorption/ionization, time of flight mass spectrometry and liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-ESI-MS/MS） analysis.
Results The mean number of protein spots for HBx negative and HBx positive HepG2 cells were 2095±137 and 2188±105, respectively. The analysis of paired cells showed 75 spots with significant differences in expression between HBx negative and HBx positive cells： 37 spots corresponding to 32 different proteins; 25 proteins were upregulated, 7 downregulated. We found 7 proteins not previously reported differentially expressed in HBx positive HepG2 cells. Variations in protein accumulation were confirmed for four （HSP90AB1, BCL2 associated athanogene 2. nucleophosmin and chloride intracellular channel 1） by Western blotting in HBx positive HepG2 cells.
Conclusions Numerous effectors of HBx that may promote the development of HCC are identified, of which 7 are newly noted in HepG2 cells. Several of these effectors of HBx may help in elucidating the roles of HBx in hepatocarcinogenesis and diagnostics or targets for therapeutic intervention.     

慢性乙型病毒性肝炎、肝癌组织HLA Ⅰ类抗原的表达及意义

目的：探讨慢性乙型肝炎、肝癌组织中人类白细胞抗原I（HLA I）的表达和临床意义。方法:应用流式细胞仪对51例慢性乙型肝炎患者肝组织和43例原发性肝癌癌组织中的HLA I抗原进行检测。结果:肝癌组织中HLA I抗原表达为36.47±19.38，明显低于慢性乙肝的79.54±41.55和正常肝组织的81.86±46.53（P均＜0.01），而慢性乙型肝炎肝组织和正常肝组织HLA I类抗原表达无明显差异（P＞0.05），伴有肝内和(或)淋巴结转移的肝癌组织中HLA I抗原表达较无转移组明显降低（22.83±11.59 vs 46.28±23.16，P＜0.05);HLA I类抗原表达与血清AFP水平呈明显负相关（r=-0.741?1, P＜0.01）,但与肝癌组织分化程度呈明显正相关(r=0.805?1, P ?.05)。结论:HLA I抗原表达异常与肝癌的发生和转移密切相关。 ［关键词］HLA I类抗原;肝炎，乙型;癌，肝细胞     

Biological function of a novel gene overexpressed in human hepatocellular carcinoma

Objective To clone the full-length of a differentially expressed cDNA fragment, LC27, and study its biological function tentatively. Methods Northern blot was used to analyze the expression pattern of LC27 in hepatocellular carcinoma, matched nontumor liver tissues, fetal liver and normal adult liver tissues, as well as BEL-7402 hepatocellular carcinoma cell line ESTs splicing and 5’ rapid amplification of cDNA ends (5’ RACE) were used to clone the full-length of LC27 cDNA.An antisense oligodeoxynucleotide approach was used to investigate the biological role of the gene in the proliferation of BEL-7402 cells. Results A 2186 bp novel cDNA with an open reading frame encoding a 283 amino acid protein was cloned.Analysis of the deduced amino acid sequence indicated that it is 38% (88/229) identical to human Golgi 4-transmembrane spanning transporter MTP.The gene and the encoded protein was termed hepatocellular carcinoma overexpressed transmembrane protein (hotp) and HOTP, respectively.Hotp mRNA was almost undetectable in normal adult liver and fetal liver tissues.However, it was significantly up-regulated in hepatocellular carcinoma and some matched nontumor liver tissues, as well as BEL-7402 cells.The proliferation of BEL-7402 cells was suppressed by an antisense oligodeoxynucleotide against hotp mRNA at a concentration of 50 μg/ml. Conclusion HOTP may be an integral membrane transporter protein.The overexpression of the gene in hepatocellular carcinoma may play an important role in hepatocarcinogenesis and disease progression.     

膜联蛋白A4在原发性肝细胞癌中的表达及其意义

目的观察膜联蛋白A4（Annexin A4）在不同肝细胞性肝癌（HCC）组织中的表达情况,探讨其临床病理意义。方法先应用RT-PCR验证ANX A4在不同类型肝组织中mRNA的表达,再应用免疫组织化学方法检测在15例正常肝组织、15例乙肝后肝硬化组织和63例不同表型肝癌组织标本中的表达,探讨其差异表达与临床病理资料之间的联系及其意义。结果（1）ANX A4mRNA表达水平在肝硬化及肝癌组织中均比正常肝组织上调（P〈0．05）,但肝硬化组与肝癌组差异无统计学意义（P〉0．05）;（2）ANXA4蛋白阳性表达率正常肝组织为20％,乙肝后肝硬化组织为26．67％;在63例HCC中阳性率为49．21％,癌旁组织为61．90％,其中小肝癌阳性率为50．00％,大肝癌为64．29％,多发癌为28．57％,相应癌旁组织阳性率分别为50．00％、64．29％、66．67％。随着肝细胞的恶性转化并进展,ANXA4蛋白呈逐渐上调趋势,但当肿瘤出现侵袭转移时反而下调。与临床病理指标的相关性研究表明Annexin A4与HCC进展及侵袭相关。结论（1）从正常肝一肝硬化一肝癌组织,Annexin A4的mRNA表达水平逐渐上调;（2）ANxA4蛋白在HCC组织中的表达明显失调,其变化可能与HCC进展及侵袭相关。     

人B淋巴细胞活化相关新基因的克隆

目的：分离新的与B细胞活化相关基因。方法：采用差异显示反转录PCR（DDRT－PCR）技术对人扁桃体活化和静止B细胞mRNA的差异表达进行分析。差异显示的片段经过Northern杂交验证后,作为探针进行人活化B细胞cDNA文库的筛选。结果：差异显示分析共获得明显的差异表达的标签序列(expressed sequence tag,EST)62条,其中主要在静止B细胞表达的有32条,在活化B细胞表达的有30条,经Northern 杂交验证,共获得阳性的片段25条,以在活化B细胞中高表达的EST30为探针,经3轮筛选人活化B细胞文库后获得1个新的全长为2048bp的cDNA克隆,该克隆含有1个630bp的开放读码框,其推断的氨基酸序列N端与酵母的动力蛋白KAR3部分同源,结论：克隆了1条可能与B细胞活化相关的新基因。     

Growth inhibition and gene induction in human hepatocellular carcinoma cell exposed to sodium 4-phenylbutanoate

Background Sodium 4-phenylbutanoate （NaPB） can induce cellular differentiation and cell cycle arrest. However, its potential anticancer properties in hepatocellular carcinoma and influence on normal liver cell are still unclear. We observed the effects of NaPB on growth inhibition, including differentiation and phase growth arrest in normal liver cell line L-02 and hepatocellular carcinoma cell line Bel-7402. Furthermore, we investigated its mechanism in Bel-7402. Methods Hepatocellular carcinoma cells Bel-7402 and normal liver cell line L-02 were treated with NaPB at different concentrations. Light microscopy was used to find morphological change in cells. Cell cycle was detected by flow cytometry. Expression of acetylating histone H4 and of histones deacetylase 4 （HDAC4） were determined by Western blot. The expression of P21WAF1/CIP1 and E-cadherin were observed through immunocytochemistry. Results NaPB treatment led to time dependent growth inhibition in hepatocellular carcinoma cells Bel-7402. NaPB treatment caused a significant decline in the fraction of S phase cells and a significant increase in Go/G1 cells. NaPB increased the expression of P21wAFVCIP1 and E-cadherin in Bel-7402 and significantly decreased the level of HDAC4 in Bel-7402. NaPB significantly improved the level of acetylating histone H4. The normal liver cell line L-02 showed no distinct changes under treatment with NaPB. Conclusions NaPB inhibited the growth of hepatocellular carcinoma cells Bel-7402 and induced partial differentiation through enhancing the acetylating histones. In Bel-7402, the expressions of P21WAF1/CIP1 and E-cadherin may be related to level of acetylating histones and inhibition of cellular growth. NaPB showed no significant effect on normal liver cells.