Dkk1对骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化的影响

目的：探讨经典Wnt信号通路胞外拮抗因子Dkk1对骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）成骨分化的影响。方法：以C3H10T1/2为目的细胞,通过重组腺病毒介导BMP9过表达,联用重组腺病毒Dkk1抑制经典Wnt信号通路。检测各处理组碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性变化、钙盐沉积、骨钙素（osteocalcin,OC）、骨桥素（osteopontin,OPN）变化;体内异位成骨实验分析Dkk1对BMP9诱导MSCs成骨分化的影响。结果：BMP9可诱导C3H10T1/2细胞成骨分化;Dkk1显著降低BMP9诱导的C3H10T1/2细胞ALP活性（F=1 467.21,P=0.000）、钙盐沉积、OC（F=32.95,P=0.000）和OPN（F=127.23,P=0.000）蛋白表达;异位成骨模型中Dkk1抑制BMP9诱导的C3H10T1/2成骨分化和骨块成熟。结论：Wnt信号通路胞外拮抗因子Dkk1可降低BMP9诱导的C3H10T1/2成骨分化,BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化可能需要经典的Wnt信号通路参与。     

骨形态发生蛋白2浓度对兔骨髓间充质干细胞生长的影响

目的:探讨骨形态发生蛋白-2(BMP-2)浓度对兔骨髓间充质干细胞(rabbit bone mesenchymal stem cells,rBMSCs)生长作用的影响。方法:分别用浓度为100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml的BMP-2培养初始数量约1×10⁴个的rBMSCs 12d,以单纯10%MEM培养的rBMSCs为对照组。分析4组间每天细胞计数的变化,并分别观察第6及第12天细胞形态的差异。Real-Time PCR检测第6、12天4组Notch通路关键分子Notch1/Jagged1/Hes1的表达。结果:3种浓度的BMP-2实验组与对照组之间细胞繁殖量没有统计学差异(P>0.05)。对照组细胞基本保持长梭形,聚集生长现象不明显。3个浓度实验组的细胞形态呈多样性,聚集生长明显加强,但组间形态无明显差异。第6、12天3个BMP-2组之间细胞的Notch1/Jagged1/Hes1 mRNA的表达量无明显差异(P>0.05),但与对照组比较均明显上升(P<0.05)。结论:BMP-2可能通过Notch通路促进兔BMSCs的生长聚集...     

Notch信号通路在骨形态发生蛋白9诱导的多潜能干细胞成骨分化中的作用

目的 初步探讨Notch信号通路对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导多潜能干细胞成骨分化的作用和机制.方法 腺病毒表达载体(AdBMP9/AdGFP、AdHey1/AdRFP)和BMP9/GFP条件培养基处理C2C12细胞,细胞化学染色和活性定量检测早期成骨标志物碱性磷酸酶(ALP),定量RT-PCR检测Notch信号通路靶基因Hey1,以了解Hey1在AdBMP9介导的成骨分化作用中的表达和作用;采用细胞密度实验和Notch信号通路抑制剂(DAPT)检测Notch信号通路对成骨的影响;在AdBMP9/AdGFP处理下,检测细胞上Notch信号通路配体、受体表达变化.结果 AdBMP9作用下,1、3、5、7 d ALP活性持续增加(P<0.05);Hey1一过性升高,其与AdBMP9呈剂量依赖性;Hey1可协助BMP9成骨(P<0.05),不能单独起效.80%和40%细胞密度组ALP量和Hey1表达均高于20%组(P<0.05);DAPT组中ALP活性明显降低(P<0.05);在AdBMP9作用下,Notch信号通路配受体有不同程度的上调,其中受体Notch4和配体Jag-1上调最为明显(分别为11.3倍和5.1倍).结论 Notch信号通路参与BMP9介导的多潜能干细胞成骨分化,其可能的机制是BMP9通过诱导Notch通路配体、受体表达上调使Hey1升高,后者协同成骨.     

Notch1在BMP9诱导iMEF细胞成骨分化中的作用

目的 研究Notch信号中Notch1受体在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的永生化小鼠胚胎成纤维细胞(immortalized mouse embryonic fibroblasts,iMEF)成骨分化中的作用.方法 利用Notch1受体显性负性突变体(dominant negative mutant,dnNotch1)处理iMEF细胞,首先分别采用细胞化学染色、活性测定和RT-PCR了解Notch1对早期成骨指标碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和晚期成骨指标骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)的影响;其次用Western blot、荧光素酶和RT-PCR检测Notch1对BMP9经典信号通路中Smad1/5/8磷酸化和Smad结合元件(smad-binding element,SBE)活性影响;最后用结晶紫染色和流式细胞仪分析其对细胞增殖、周期及凋亡的影响.结果 与对照组相比,dnNotch1处理iMEF第3、5、7天后,ALP活性均降低(P＜0.05),并呈剂量依赖性,11d时OPN和OCN表达量也下调(P＜0.05);BMP9经典通路中Smad1/5/8蛋白量没有明显变化,而p-Smad1/5/8蛋白及SBE活性受到了抑制(P＜0.05);结晶紫染色及流式细胞仪分析结果显示dnNotch1能够抑制BMP9诱导的iMEF早期细胞增殖,但对细胞凋亡无影响.结论 dnNotch1竞争抑制Notch1信号,使BMP9诱导iMEF的成骨分化能力显著下降,其可能通过抑制BMP信号通路的活化和iMEF早期增殖两方面来实现.     

骨髓间充质干细胞成骨分化调控机制研究进展

骨髓间充质干细胞起源于中胚层,是一种具有多向分化潜能的细胞,其分化成骨的功能对于骨代谢具有重要作用。因此,机体对其有一套严密而精确的信号通路传导来调控其向成骨细胞分化,就目前研究情况来看,主要有Notch信号通路、Wnt信号通路、转化生长因子-β/骨形态发生蛋白(TGF-β/BMPs)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、Hedgehog信号通路等。研究以上通路,对于明确干细胞分化成骨机制有着重要理论指导意义,现就以上信号通路的相关研究进行综述。     

全反式维甲酸增强骨形态蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化作用

目的研究全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)对骨形态蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导间充质干细胞成骨分化的影响及可能机制。方法采用组织化学染色检测各组第5、7天碱性磷酸酶活性变化。Western blot检测各组第9、11天骨桥素蛋白表达水平。茜素红染色检测各组第14、20天钙盐沉积水平。采用Western blot检测各组Smad-1/5/8蛋白磷酸化水平,以及用荧光素酶报告质粒检测BMPR-Smad信号通路的活化程度。结果 ATRA及BMP9均诱导C3H10T1/2细胞碱性磷酸酶活性升高,但ATRA合并BMP9组碱性磷酸酶活性明显强于单用ATRA或BMP9组;BMP9合并ATRA组骨桥素蛋白表达水平高于BMP9组;BMP9合并ATRA较单用BMP9能明显促进钙盐沉积。BMP9合并ATRA组Samd1/5/8磷酸化水平明显强于单用BMP9组,BMPR-Smad报告质粒荧光素酶活性也呈相同变化趋势(P<0.01)。结论 ATRA能增强BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的作用,其机制可能与促进Smads信号转导活性有关。     

转化生长因子-?茁1促进骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化

目的：探讨转化生长因子?茁1（transforming growth factor-?茁1,TGF-?茁1）在骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）成骨分化过程中的作用。方法：应用鼠MSC C3H10T1/2,以重组腺病毒法将BMP9导入,施加TGF-?茁1处理,建立BMP9联合TGF-β1诱导MSC成骨分化模型。改良SEAP化学发光法检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性;茜素红S染色进行钙盐沉积检测;实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Ⅰa2型胶原（collagenⅠa2,COLⅠa2）、骨桥素（osteopotin,OPN）、骨钙素（osteocalcin,OCN）的mRNA转录表达水平,免疫细胞化学法检测细胞内OPN、OCN表达变化。荧光素酶报告基因法检测信号通路的Smad水平。结果：TGF-?茁1与BMP9联合处理较BMP9单独处理能更早更多地提高ALP活性和引起钙盐沉积（F处理=18 782.10,P=0.000）,持续处理达17 d后不再显示明显差异,TGF-?茁1单独处理与对照组间无明显差异（F=1.03,P=0.318）。TGF-?茁1与BMP9联合处理较BMP9单独处理可使COLⅠa2、OPN、OCN mRNA转录水平明显增高（COLⅠa2的F处理=250.30,P=0.000;OPN 的F处理=795.64,P=0.000;OCN的F处理=206.55,P=0.000）,COLⅠa2增高发生较早和显著（F=250.30,P=0.000）;细胞内OPN、OCN蛋白阳性表达显著增强。TGF-β1联合BMP9处理能刺激信号通路相应的Smad荧光素报告活性（?字2=32.84,P=0.000）。结论：在BMP9诱导MSC成骨分化中,联合应用TGF-?茁1具有促进成骨作用,BMP9与TGF-?茁1在成骨分化中可能存在互补效应。     

内参基因GAPDH和β-actin在BMP9诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达情况

目的:观察常用内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和β肌动蛋白(β-actin)在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化过程中表达情况,以确定相关研究的内参基因。方法:检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)确定BMP9诱导的MSCs(包括C3H10、C2C12和MEF)向成骨分化;以real-time PCR分别检测0、1、3、5、7 d GAPDH和β-actin的m RNA表达水平;以Western blot检测GAPDH和β-actin蛋白。结果:(1)β-actin在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中m RNA表达水平逐渐升高,0 d与5 dβ-actin的m RNA表达量存在统计学差异(C3H10、C2C12和MEF的P值均为0.000,GAPDH的m RNA表达水平未见明显改变(P>0.05);β-actin蛋白表达量随成骨分化逐渐增加,而GAPDH蛋白表达未见明显变化。结论:在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中,GAPDH比β-actin更适合做内参。     

骨形态发生蛋白2基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：评价携带骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒（Ad-BMP-2）转染人骨髓间充质干细胞（MSC）对其成骨分化的影响。方法：由健康青年男性髂骨抽取骨髓培养MSC，BMP-2基因转染后，用RT-PCR及免疫组化染色证实转基因MSC的BMP-2基因表达，原位杂交及免疫组化染色检测转染后细胞成骨活性，并进行透射电镜观察。结果：转染后细胞稳定表达BMP-2基因，核心结合因子a1、骨钙素、骨桥素、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶呈阳性表达，透射电镜显示细胞外有胶原分泌和钙盐沉积。结论：Ad—BMP-2基因转染可以提高MSC的体外成骨能力。     

R-spondin1在促进人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

目的:研究Wnt信号通路激活剂R-spondin1在人骨髓间充质干细胞(hBMSC)成骨分化中的作用.方法:用0、5、10、20 μg/L R-spondin1处理hBMSC,利用荧光素酶实验检测R-spondin1对hBMSC中Wnt信号通路的作用,Western blot检测R-spondin1对Wnt信号通路下游靶基因β-catenin蛋白表达的影响;在成骨分化培养基中添加20 μg/L R-spondin1诱导hBMSC成骨分化,检测R-spondin1对早期成骨分化指标ALP活性及成骨分化晚期钙沉积、成骨分化标志物OSX、OCN和成骨分化关键转录因子RUNX2表达的影响.结果:R-spondin1增强hBMSC中Wnt信号通路,R-spondin1增强ALP活性和钙沉积,促进OSX、OCN及RUNX2的表达.结论:R-spondin1增强hBMSC中Wnt信号通路的作用,促进hBMSC成骨分化.     

Wnt信号通路调控间充质干细胞成骨分化的研究进展

Wnt通路作为调控细胞生长、发育和分化的重要信号途径一直是医学研究的热点。近年来的研究表明,Wnt信号通路在调控间充质干细胞（MSCs）成骨分化过程中发挥重要作用,其机制已成为骨组织工程研究的热点,也为骨质疏松症等疾病的治疗提供了新思路。该文对Wnt信号通路调控MSCs成骨分化的研究进展进行综述。     

重组hCDMP1腺病毒转染骨髓间充质干细胞对其向软骨分化的影响

目的 探讨人软骨源性形态发生蛋白1(CDMP1)基因转染对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及分化的影响.方法 采用腺病毒转染方法将重组人CDMP1(hCDMP1)基因转入体外培养的兔BMSCs,用免疫印迹法(Western blot)检测hCDMP1蛋白质的表达,并通过检测细胞增殖能力(MTT法)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)以及蛋白多糖的表达,分析转染hCDMP1对BMsCs增殖、分化的影响.结果 hCDMP1蛋白在基因转染细胞内得到正确表达;hCDMP1基因转染组和对照组相比,ColⅡ、蛋白多糖表达水平显著增高(P<0.05),而细胞增殖能力无明显变化(P>0.05).结论 外源基因转染可以使B     

骨形态发生蛋白-7在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用

目的探讨骨形态发生蛋白-7(BMP-7)在雷奈酸锶(Strontium ranelate,Sr)促进大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化中的作用。方法体外分离培养4周龄大鼠BMSCs,取第3~4代,用细胞碱性磷酸酶标法检测不同浓度Sr作用下碱性磷酸酶(ALP)活性的表达;用茜素红染色法检测钙结节的表达;用Western blot测定BMP-7的表达水平。结果在0.1~3.0 mmol/L的浓度范围内,Sr呈浓度依赖性地增加ALP活性,其浓度为3 mmol/L时,ALP活性表达最高,并明显促进钙结节的表达;Sr(0.1~3.0 mmol/L)呈浓度依赖性地上调BMP-7表达,其中浓度为3 mmol/L时,BMP-7表达最高;BMP-7阻断剂(noggin)(100 ng/ml)不仅抑制Sr诱导的BMP-7表达,而且使ALP活性及钙结节的表达明显下降。结论 Sr可通过上调BMP-7表达促进BMSCs向成骨细胞分化。     

抑制Notch1/Jagged1通路可促进大鼠骨髓间充质干细胞"归巢"并改善哮喘

目的 观察间充质干细胞（BMSCs）归巢调节哮喘Th1/Th“2 漂移”与Notch1/Jagged1通路的关系。方法 20只SD大鼠用随机数字表法均分为4组：正常对照组（NC）、模型对照组（MC）、BMSCs移植组（BMSCs）、BMSC+Notch抑制剂组。采用卵清蛋白致敏和激发建立哮喘模型,尾静脉注射BMSCs。HE染色观察肺组织病理形态学,酶联免疫吸附法检测肺组织白介素（IL）-5、IL-13、IFN-γ,RT-PCR法检测肺组织Notch1、Jagged1基因表达,免疫荧光染色检测支气管上皮细胞中CXCR4蛋白表达,免疫印迹法检测肺组织T-bet、GATA-3、Notch1、Jagged1蛋白表达。结果 与NC组比较,MC组IFN-γ、T-bet蛋白表达降低,IL-5、IL-13、GATA-3蛋白表达升高,Notch1、Jagged1mRNA和蛋白表达升高（P<0.05或P<0.01）。与MC组比较,BMSCs组、BMSCs+Notch抑制剂组CXCR4、IFN-γ、T-bet蛋白表达量显著升高,BMSCs组Notch1、Jagged1 蛋白表达降低,BMSCs+Notch抑制剂组IL-5、IL-13、Notch1、Jagged1mRNA和蛋白降低（P<0.05或P<0.01）。与BMSCs组比较,BMSCs+Notch抑制剂组CXCR4、IFN-γ表达升高,IL-13、Notch1mRNA表达降低（P<0.05）。结论 BMSCs向哮喘肺组织归巢对Th1/Th2“漂移”产生调节作用,Notch1/Jagged1通路可能参与其过程。     

hsa-miR-654-5p通过抑制骨形态发生蛋白2调控人骨髓基质干细胞成骨分化

目的明确萎缩性骨不连组织水平表达上调的hsa-miR-654-5p在人骨髓基质干细胞(hBMSCs)中对其预测靶基因骨形态发生蛋白2(BMP2)mRNA和蛋白的抑制作用,探索其在成骨分化过程中的生物学调控功能。方法分离培养hBMSCs,将第4代hBMSCs培养16 h后分别按相应体系转染细胞,再培养48 h后取六孔板内细胞提取总RNA和总蛋白,进行实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting,取24孔板内细胞进行双荧光素酶报告基因检测。结果当hBMSCs中hsa-miR-654-5p过表达时,BMP2的mRNA和蛋白表达水平均发生明显下调;双荧光素酶报告基因检测提示,BMP2的预测靶位点直接受hsa-miR-654-5p的抑制调控,该靶位点被突变后hsa-miR-654-5p对BMP2的抑制作用消失。结论 hsa-miR-654-5p可通过作用于BMP2的特定靶位点而直接抑制BMP2的mRNA和蛋白表达。hsa-miR-654-5p的变化在成骨分化调控过程中具有重要作用。     

脉冲微交流电刺激促进体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌分化

目的 探讨脉冲微交流电刺激对体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的作用.方法 常规方法 分离培养鼠骨髓间充质干细胞,取P3细胞进行5-氮胞苷诱导,诱导后以是否给予脉冲微交流电刺激分为两组,观察各组细胞生长情况、细胞形态学及超微结构改变,免疫细胞化学方法 检测、cTnT、Cx43的表达.结果 脉冲微交流电刺激组细胞较非刺激组生长良好,更早出现心肌样细胞改变,诱导后1周可观察到胞内肌丝形成及、cTnT、Cx43的表达,且在随后的相同时相点(诱导后2、3、4周),、cTnT、Cx43表达水平明显高于非刺激组,胞内肌丝也由杂乱分布逐渐成束,部分细胞可观察到肌节.结论 模拟心脏跳动的脉冲微交流电刺激有助于经5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞在体外分化为功能完备的心肌样细胞.     

骨形态发生蛋白-2、梗死心肌裂解液对骨髓间充质干细胞体外诱导分化作用的研究

目的 探讨骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、梗死心肌裂解液模拟的生物微环境诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化及在模拟的微环境中BMP-2对诱导的影响.方法 BMSCs分离与体外培养,构建大鼠心肌梗死模型制成梗死心肌裂解液;分4组:单纯DMEM培养组(A组)、梗死心肌裂解液组(B组)、梗死心肌裂解液加BMP-2阻断剂noggin组(C组)、BMP-2组(D组),通过倒置相差显微镜形态学观察、应用免疫细胞化学技术检测心肌特异性肌钙蛋白(cTnT)、心肌特异性肌球蛋白重链(MHC)的表达,并对诱导的心肌样细胞进行统计学分析.结果 诱导3周后免疫细胞化学染色分析cTnT、MHC,A、C     

microRNA调控间充质干细胞成骨分化的研究进展

间充质干细胞是一类体内广泛存在的多能干细胞,具有多向分化潜能,为多种组织器官提供保护及损伤修复。近年来,间充质干细胞向成骨细胞诱导分化用于治疗骨代谢等相关性疾病已成为热点。microRNA（miRNA）作为生物体内重要的小分子非编码RNA,通过转录后调控影响基因表达,参与各种生命过程。研究显示,多种不同的miRNA在间充质干细胞向成骨分化过程中起着核心调节作用。本文结合相关文献,对miRNA调控间充质干细胞成骨分化的作用及机制归纳总结,以帮助全面了解靶向miRNA治疗骨代谢性相关疾病的潜能。