MG-132对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化与凋亡的影响

目的：探讨蛋白酶体抑制剂MG-132对体外培养的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）转分化和凋亡的影响及其机制。方法：体外培养HK-2细胞,随机分组：对照组,TGF-β1刺激组（5ug／L）,MG-132组（2．5μmol／L）,MG-132＋TGF-融组（MG-132 2.5μmol／L孵育30min后再加TGF-β1 5μg／L）。培养24h后收集细胞,RT-PCR法检测Smurf1、Smurf2和Smad7 mRNA的表达;Western免疫印迹检测Smurf1、Smurf2、Smad7和P-IκB-α和IκB-α蛋白表达;免疫组织化学检测胞浆中Fn和α-SMA的表达;Hoechst 33258染色免疫荧光检测细胞凋亡形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：TGF-β1刺激组HK-2 Smurf1、Smurf2 mRNA及蛋白表达水平较对照组高（P〈0．05）,但Smad7 mRNA及蛋白表达水平较对照组低（P〈0．05）,且胞浆中FN和α-SMA水平较对照组高（P〈0．05）。MG-132＋TGF-β1组与TGF-β1刺激组比较,Smurf1、Smurf2 mRNA表达降低（P〈0．05）,Smad7 mRNA略升高（P〉0．05）,而Srnad7蛋白明显升高（P〈0．05）,胞浆中Fn和α-SMA表达减少。MG-132组、MG-132＋TGF-β1组分别与对照组及TGF-β1组比较,P-IκB-α和IκB-α蛋白浓度升高,细胞凋亡率增加,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：MG-132可抑制TGF-132诱导的HK-2 Smurf1、Smurf2的表达,促进Smad7表达,抑制其降解,减轻FN和α-SMA的表达,从而抑制HK-2转分化;另-方面,MG132可能通过抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞NF-κB活化促进HK-2细胞凋亡。     

红细胞生成素对高糖诱导下肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨红细胞生成素（EPO）对高糖诱导下的肾小管上皮细胞转分化的影响。 方法 体外培养人肾小管上皮细胞株（HK-2细胞）,分为正常对照组、渗透浓度对照组、高糖组、高糖＋EPO（5 U/ml）组和高糖＋EPO（10 U/ml）组。RT-PCR法检测各组细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子β1（TGF-β1）、Smads信号蛋白2（Smad2）及整合素连接激酶（ILK）的mRNA表达。细胞免疫荧光法检测细胞TGF-β1及α-SMA的蛋白表达。 结果 RT-PCR结果显示,相对于对照组,高糖组细胞α-SMA、TGF-β1、Smad2、ILK的mRNA表达均显著上调（P ＜ 0.01）。细胞免疫化学也显示,高糖组TGF-β1和α-SMA的蛋白表达较对照组显著上调（P ＜ 0.01）,而高糖＋EPO（5 U/ml）组和高糖＋EPO（10 U/ml）组上述指标的表达均显著低于高糖组（均P ＜ 0.01）。 结论 EPO能抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化,可能与其抑制TGF-β1、Smad2及ILK表达有关。     

高糖通过ERK1/2通路对人肾小管上皮细胞脂联素表达的影响

目的通过体外培养人肾小管上皮细胞(human proximal tubular epithelial cells,HK-2),观察高糖对HK-2脂联素(adiponectin,ADPN)表达水平的影响并探讨其可能机制。方法将培养的HK-2细胞分为4组:①低糖对照组(5.6 mmol/L葡萄糖);②PD98059(职K1/2信号传导通路的抑制剂)组(5.6 mmol/L葡萄糖+50μmol/L PD98059);③高糖组(30 mmol/L葡萄糖);④高糖+PD98059组(30 mmol/L葡萄糖+50μmol/L PD98059)。各组分别培养48 h后荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测HK-2细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activator receptor,PPAR-γ)及脂联素mRNA的表达,免疫印迹(Western blotting)法检测各组脂联素蛋白的表达水平。结果 HK-2细胞表达脂联素;PD98059组与低糖对照组相比,PPAR-γmRNA及脂联素的mRNA和蛋白表达的差异均无统计学意义(均P0.05);与低糖对照组相比,高糖组PPAR-γmRNA及脂联素mRNA和蛋白表达均显著降低,差异均有统计学意义(均P0.05);与高糖组相比,高糖+PD98059组PPAR-γmRNA及脂联素mRNA和蛋白表达均显著升高,差异均有统计学意义(均P0.05)。结论高糖可以降低HK-2细胞脂联素mRNA和蛋白的表达;高糖作用于HK-2细胞可能是通过激活ERK1/2信号传导通路降低PPAR-γ的表达,从而影响其脂联素的表达。     

黏着斑激酶在转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的 观察转化生长因子（TGF）β1诱导的正常人近端肾小管上皮细胞（HK-2）转分化（EMT）过程中黏着斑激酶（FAK）的表达及下调FAK的表达后对TGF-β1诱导的HK-2细胞转分化进程的影响。 方法 应用TGF-β1（10 μg/L）刺激HK-2细胞,采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光方法分别检测E钙黏蛋白（E-cadherin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、FAK mRNA和蛋白的表达及磷酸化（p）-FAK（Tyr397）的蛋白表达。应用Lipofectmine2000将FAK siRNA转染HK-2细胞,采用Western印迹观察下调表达FAK对上述指标的影响。 结果 TGF-β1刺激后,HK-2细胞α-SMA蛋白和mRNA水平上调,E-cadherin蛋白和mRNA表达下调。FAK蛋白和mRNA随时间的延长表达逐渐增多,48 h达到高峰。p-FAK（Tyr397）蛋白表达趋势与FAK相同。脂质体转染siRNA后FAK的mRNA和蛋白分别下调了50%和41%,下调表达FAK后可以显著抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞α-SMA蛋白的上调表达,逆转 E-cadherin蛋白的下调表达。 结论 在TGF-β1诱导的HK-2细胞转分化进程FAK蛋白表达上调,敲低FAK蛋白表达后可以部分减轻EMT的程度,提示FAK在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和肾脏纤维化中发挥一定的作用。     

核因子κB反义寡核苷酸对转化生长因子β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导下，核因子κB（NF-κB）反义寡核苷酸对体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化的影响。 方法 采用脂质体介导的方法将NF-κB反义寡核苷酸（AS-ODN）导入细胞，以TGF-β1（10 μg/L）刺激HK-2细胞24 h后，用RT-PCR方法检测细胞中NF-κB mRNA及α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA表达，用荧光光谱法分析α-SMA蛋白的表达，并以倒置相差显微镜观察细胞转分化过程的形态变化。 结果 TGF-β1诱导24 h后，HK-2细胞中NF-κB mRNA的表达显著上调，为空白对照组的8倍以上（P < 0.01）。NF-κB反义寡核苷酸导入细胞后，可显著抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞的 NF-κB mRNA表达，比TGF-β1组减少75％（P < 0.05），同时，α-SMA mRNA和蛋白表达亦较TGF-β1组均明显下调（P < 0.05）。 结论 NF-κB反义寡核苷酸可抑制TGF-β1诱导肾小管上皮细胞NF-κB的表达，抑制肾小管上皮细胞转分化，可能有利于肾间质纤维化的防治。     

氟伐他汀对晚期糖基化终产物诱导的人近端肾小管上皮细胞转分化的影响

目的：研究氟伐他汀对晚期糖基化终产物（AGE）诱导的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）转分化的影响及核因子（NF）-κB在其中所起的作用。方法：将培养细胞分为5组：（1）BAS组;（2）AGE-BAS组;（3）AGE-BAS＋NF-κB特异性阻断剂（PDTC）组;（4）AGE-BAS＋氟伐他汀组;（5）AGE-BAS＋氟伐他汀＋PDTC组。应用EMSA法测定NF-κB活性变化。Westernblot法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏着糖蛋白（E-cadherin）表达。结果：氟伐他汀在一定浓度范围内,呈剂量依赖性抑制AGE-BSA诱导的HK-2细胞NF-κB活化。AGE-BSA刺激后随浓度增加,时间延长,α-SMA蛋白表达明显升高、E-adherin蛋白表达明显降低。NF-κB特异性阻断剂PDTC及氟伐他汀均能部分阻断AGE-BSA诱导的α-SMA蛋白表达升高及E-adherin蛋白表达降低。氟伐他汀＋PDTC进一步抑制AGE-BSA诱导的α-SMA蛋白表达升高及E-adherin蛋白表达降低。结论：NF-κB参与了AGE-BSA诱导的HK-2细胞转分化。氟伐他汀抑制HK-2细胞转分化除通过抑制NF-κB活化,可能还有其他机制。     

松弛素对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化及分泌细胞外基质的影响

目的:观察人松弛素(Relaxin)对高糖培养人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化、分泌细胞外基质的影响。方法:实验分组:正常糖组:含5.5 mmol/L葡萄糖;高糖组:含30 mmol/L葡萄糖;高渗组(甘露醇组);高糖+松弛素干预组;ELISA法检测细胞上清中TGF-β1、细胞胶原(ColⅠ)、纤连蛋白(FN)的表达。免疫印迹技术(Western blot)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达,确定肾小管上皮细胞表型转化情况。结果:与正常糖组相比,高糖组肾小管上皮细胞分泌ColⅠ、FN、TGF-β1显著增加,在高糖培养基中加入人松弛素干预后可显著抑制由高糖诱导的ColⅠ、FN、TGF-β1的高表达,降低α-SMA表达,抑制肾小管上皮细胞转分化。结论:松弛素能抑制高糖诱导HK-2细胞分泌细胞外基质,抑制HK-2细胞转分化,具有抗纤维化作用。     

虫草素通过下调TGF-β抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化

目的：探讨虫草素对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响。方法：体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞株（NRK52E细胞株）,分为正常对照组（葡萄糖5.5 mmol/L,NG组）、高糖组（葡萄糖30 mmol/L,HG组）、高糖＋虫草素组（葡萄糖30 mmol/L＋虫草素10μg/ml,HG＋C组）。分别于刺激12 h,24 h,48 h后收集细胞。应用定量RT-PCR测定NRK52E TGF-β,E-cadherin,α-SMA mRNA的表达;Western印迹方法检测TGF-β、E-cadherin、α-SMA蛋白的表达。结果：高糖刺激后NRK52E细胞的TGF-β和α-SMA mRNA及蛋白表达明显高于正常糖组（P〈0.01）,而虫草素组TGF-β和α-SMA mRNA及蛋白表达显著低于高糖组（P〈0.05）;高糖诱导的NRK52E细胞E-cadherin mRNA及蛋白水平明显降低（P〈0.01）;而虫草素组NRK52E细胞E-cadherin mRNA及蛋白水平显著高于高糖组（P〈0.05）。结论：虫草素可以明显抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化,其机制可能是通过下调TGF-β实现。     

高糖刺激对体外培养小鼠足细胞snail表达和转分化的影响

目的：研究高糖刺激对体外培养的小鼠足细胞snail表达及上皮细胞-间充质细胞转分化的影响.方法：以体外培养的小鼠永生化足细胞为研究对象,将其分为正常糖组、高糖刺激组、甘露醇对照组,培养时间为48 h.倒置显微镜下观察各组足细胞形态,采用荧光定量PCR法检测各组足细胞snail、synaptopodin、α-平滑肌肌动蛋（α-SMA）mRNA的表达,采用免疫细胞化学和western blot检测各组足细胞snail、synaptopodin、α-SMA蛋白的表达量.结果：正常状态下足细胞呈树枝分叉状,几乎不表达snail,高糖刺激48 h后足细胞形态发生明显改变,并且snail、α-SMA mRNA和蛋白表达量较对照组明显上调,synaptopodin表达较对照组减少（P＜0.05）.结论：高糖刺激可诱导足细胞snail的表达和转分化的过程,这可能参与了糖尿病肾病的发生、发展过程.     

糖肾平通过TGF-β1-Smad2/3-ILK信号通路干预高糖＋LPS诱导足细胞上皮间质转分化的分子机制研究

也页目的：探讨糖肾平对高糖环境下脂多糖（ lipopolysaccharide,LPS）刺激足细胞上皮间质转分化的影响,并探讨其作用机制。方法：以体外培养大鼠肾小球足细胞为研究对象,以高糖（25 mmol/L）、LPS（1μg/mL）刺激足细胞建立模型,分为正常组、高糖组、高糖＋LPS组、厄贝沙坦组、抑制剂组、糖肾平小、中、大剂量组。采用Western blotting及RT-PCR方法检测足细胞中转化生长因子-β1（ transforming growth factor-β1,TGF-β1）、Smad2/3、整合素连接激酶（ integrin-linked kinase, ILK）、CD2相关蛋白（CD2AP）、α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）的表达水平。结果：与正常组比较,高糖组和高糖＋LPS组足细胞TGF-β1、ILK、α-SMA蛋白及其mRNA表达明显增加（P〈0.01）,P-Smad2/3蛋白及Smad2/3 mRNA表达明显增加（P〈0.01）,CD2AP蛋白及其mRNA表达明显减少（P〈0.01）;与高糖＋LPS组比较,厄贝沙坦组足细胞P-Smad2/3、α-SMA蛋白表达明显减少（P〈0.01）,TGF-β1蛋白表达减少（P〈0.05）,TGF-β1,Smad2/3,α-SMAmRNA表达明显减少（P〈0.01）,ILK mRNA表达减少（P〈0.05）,CD2AP蛋白及其mRNA表达明显增加（P〈0.01）;糖肾平大、中、小各剂量组足细胞TGF-β1蛋白表达明显减少（P〈0.01）,糖肾平大剂量组足细胞TGF-β1 mRNA表达减少（P〈0.05）,小、中剂量组表达明显减少（P〈0.01）;糖肾平小、中、大各剂量组足细胞P-Smad2/3蛋白及Smad2/3mRNA表达均明显减少（P〈0.01）;糖肾平小、大剂量组足细胞ILK mRNA表达减少（P〈0.05）,中剂量组表达明显减少（P〈0.01）;糖肾平大剂量组足细胞α-SMA蛋白及其mRNA表达减少（P〈0.05）;糖肾平小、中、大各剂量组足细胞CD2AP蛋白及其mRNA表达均明显增加（P〈0.01）。结论：糖肾平能够降低足细胞TGF-β1、ILK蛋白及mRNA表达,降低P-Smad2/3蛋白及Smad2/3 mRNA表达,升高足细胞标志物CD2AP蛋白及mRNA表达,降低间充质细胞标志物α-SMA蛋白及mRNA表达,通过抑制TGF-β1-Smad2/3-ILK信号通路的激活减少足细胞转分化,保护足细胞,可能是其防治糖尿病肾病的作用机制之一。     

血管紧张素1-7对糖尿病大鼠肾小管间质纤维化的影响

目的 研究血管紧张素1-7(Ang1-7)对糖尿病大鼠肾小管间质纤维化的影响及其可能机制.方法 32只雄性Wistar大鼠被随机分为4组:健康对照组(NC组)、模型组(DM组)、替米沙坦组(TM组)、治疗组(T组).建模成功后第9周末检测各组大鼠24 h尿蛋白量、尿NAG/Cr、血糖、血胰岛素、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、BUN、Scr、血K+及血Na+ ;PAS染色观察肾脏病理改变 ;实时定量PCR法检测各组大鼠肾脏组织中转化生长因子β1(TGF-β1)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA水平 ;Western印迹法检测PPARγ、α-SMA、TGF-β1蛋白表达.结果 (1)第9周末,DM组大鼠血压、尿蛋白量、肾质量/体质量较NC组显著升高(P＜0.05),TM组及T组较DM组显著降低(P＜0.05),且T组变化更明显.(2)DM组第9周末肾间质损伤指数显著高于NC组(P＜0.05),TM组及T组则低于DM组(P＜0.05).(3)实时定量PCR结果显示,DM组TGF-β1、α-SMAmRNA水平显著升高(P＜0.05),PPARγ mRNA水平显著下降(P＜0.05),TM组及T组较DM组TGF-β1、α-SMA mRNA水平均显著下降(P＜0.05),PPARγ mRNA水平显著上升(P＜0.05),且T组变化更明显.(4)Western印迹结果显示,DM组TGF-β1、α-SMA蛋白水平显著升高(P＜0.05),PPARγ蛋白水平显著下降(P＜0.05),TM组及T组较DM组TGF-β1、α-SMA蛋白水平均显著下降(P＜0.05),PPARγ蛋白水平显著上升(P＜0.05),且T组变化更明显.结论 Ang1-7在体内可通过上调PPARγ表达,抑制α-SMA表达,对糖尿病大鼠肾小管间质纤维化可能具有抑制作用.     

Activation of CXCL16 pathway by inflammation accelerates the progression of diabetic nephropathy

Objective To investigate the potential role of CXC chemokine ligand 16 (CXCL16)/CXC chemokine receptor 6 (CXCR6) pathway in the progression of diabetic nephropathy (DN). Methods 8 - week old male db/db mice were randomly divided into DN group and DN inflamed group. 10% casein was subcutaneously injected to induce the DN mouse model with inflammation. In vitro, HK-2 cells were treated with high glucose (HG), and IL-1β + HG to investigate the effect of inflammatory stress on HK-2 cells. Further knockdown CXCL16 was mediated by RNA interference to determine the effects of CXCl16, then cells were divided into HG + IL-1β group, HG + IL-1β + siCXCL16 group and HG + IL-1β + vehicle group. Changes of renal function in mice were assessed by 24 h proteinuria and N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG) during 8 weeks. The ultra- microstructure was checked by electron microscopy at 8th week. Lipid accumulation in kidneys and HK - 2 were observed by Filipin staining and quantitative assay of intracellular free cholesterol. The protein expressions of CXCl16, CXCR6, a disintegrin and metalloproteinase-10 (ADAM10), fibronectin and α smooth muscle actin (α - SMA) in renal tissue were detected by immunohistochemistry and Western blotting. The mRNA and protein expressions of CXCl16, CXCR6, ADAM10, fibronectin and α-SMA in HK-2 cells were detected by real-time PCR and Western blotting, and protein expressions of CXCl16, CXCR6 and ADAM10 in HK - 2 cells were also tested by cell immunofluorescence. Results Mice in DN inflamed group had higher 24 h proteinuria and NAG than those in DN group, and the differences between two groups shown statistical significance at 8th week (all P＜0.05). Compared with DN mice, DN inflamed mice had more vacuoles within renal tubular cells, with mitochondrial swelling, deformation and decrease. Lipid accumulation and protein expressions of fibronectin and α-SMA were increased in DN inflamed group when compared with DN group (all P＜ 0.05). Further, the expressions of CXCL16, CXCR6, ADAM10 were significantly increased in DN inflamed group (all P＜0.05). In vitro, the mRNA and protein expressions of CXCL16, CXCR6, ADAM10, fibronectin and α-SMA, and lipid accumulation were increased in high glucose plus IL-1β group when compared with high glucose group (all P＜0.05). However, after siRNA of CXCL16 transfection, the mRNA and protein expressions of CXCL16, CXCR6, ADAM10, fibronectin and α-SMA were down-regulated in HG+IL-1β+siCXCL16 group as compared with high glucose+IL-1β group (all P＜0.05). Furthermore, lipid accumulation was decreased (P＜0.05). Conclusion Inflammation accelerates tubulointerstitial injury in DN partly through the activation of CXCL16 pathway, which may facilitate the lipid accumulation in tubular epithelial cells.     

内质网应激在高糖诱导人肾脏系膜细胞表型转化中的作用

目的 探讨内质网应激在高糖诱导人肾脏系膜细胞表型转化的作用。 方法 将体外培养的人肾脏系膜细胞分为对照组、高糖组（HG组）、高糖+4-苯基丁酸（4-PBA）干预组（4-PBA组）。MTT法测定细胞增殖率,流式细胞术观察细胞周期变化,免疫组织化学染色激光共聚焦显微镜观察细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA)表达情况,实时荧光定量PCR和Western印迹分别检测mRNA和蛋白表达。 结果（1）高糖组系膜细胞增殖率和进入S期比例显著高于对照组（P < 0.05）,同时,高糖能刺激α-SMA表达增加（P < 0.05）;4-PBA干预可明显抑制高糖刺激的系膜细胞增殖和进入S期及α-SMA表达。（2）相对于对照组,高糖能刺激系膜细胞葡萄糖调节蛋白78（Grp78） mRNA和蛋白表达增加（P < 0.05）;4-PBA干预可显著下调这种效应（P < 0.05）。（3）高糖可诱导系膜细胞转化生长因子（TGF-β1）、纤连蛋白（FN） mRNA和蛋白表达（P < 0.05）;4-PBA干预则明显下调其表达（P < 0.05）。 结论 内质网应激在高糖诱导人肾脏系膜细胞表型转化效应中发挥了重要作用。     

甲状旁腺激素对人近曲小管上皮细胞转分化及分泌结缔组织生长因子的影响

目的 探讨甲状旁腺激素（PTH）对人近曲小管上皮细胞系HK-2细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）及细胞转分化的影响。 方法 应用实时定量PCR和Western印迹观察PTH诱导HK-2细胞CTGF mRNA和蛋白表达情况，从转录水平探讨PTH对CTGF基因启动子活性的调控作用。应用免疫荧光技术检测PTH作用下HK-2细胞中α平滑肌肌动蛋白 （α-SMA）的表达。 结果 HK-2细胞有基础水平的CTGF mRNA和蛋白表达，PTH刺激后其表达量显著增加。PTH最佳刺激浓度是10－10 mol/L，最佳刺激时间是72 h。10－10 mol/L PTH干预HK-2细胞12 h后，荧光素酶活性较对照组显著升高（1.888±0.078比0.989±0.030，P ＜ 0.01）；光镜下可见细胞由立方形铺路石样转变为梭形，随作用时间延长转分化现象更显著。PTH刺激HK-2细胞12 h后，免疫荧光检测可见细胞质中有α-SMA表达；PTH刺激24 h后，α-SMA表达明显增多，与CTGF mRNA和蛋白表达的时间效应一致。 结论 PTH可上调HK-2细胞CTGF表达，并具有促进HK-2细胞转分化的作用。     

Role of JLP on the epithelial to mesenchymal transition in renal tubular epithelial cells

Objective To observe the effect of JLP on transdifferentiation of human renal proximal tubular epithelial cells (HK-2), and to investigate the role of p38 MAPK signaling pathway in this process. Methods The knock-down plasmids of JLP were constructed. HK-2 cells were randomly divided into four groups: negative control cells (Ctrl-shRNA group), knock-down jlp cells (jlp-shRNA group), negative control cells with FGF-2 treatment (FGF-2 group) and knock-down jlp cells with FGF-2 treatment(jlp-shRNA+FGF-2 group). The expressions of JLP, E-cadherin, TGF-β1, α-SMA, p-p38 MAPK protein were detected by Western blotting．After the induction of FGF-2 for 24 hours, the expressions of α-SMA, COL-I, FN were detected by immunocytochemistry. Results Compared with Ctrl-shRNA group, the expression of JLP protein was significantly down-regulated in FGF-2 group. Compared with FGF-2 group, the expressions of TGF-β1, α-SMA, p-p38 MAPK protein were significantly up-regulated, while E-cadherin protein was significantly down-regulated (P＜0.05). Compared with FGF-2 group, the expressions of α-SMA, COL-I, FN immunostaining increased markedly in jlp-shRNA+FGF-2 group. Conclusion Scaffolding protein JLP is critical in preventing EMT in the course of fibrosis through the inhibition of p-p38 activation in HK-2 cells.     

曲尼司特对环孢素A诱导的人肾小管上皮细胞向间充质转变的抑制作用

目的 研究曲尼司特(Tran)对环孢素A(CsA)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)向间充质转变的影响,并探讨该药抗纤维化的机制.方法 所有用于实验的HK-2细胞株均为8～12代细胞,分为4组:(1)空白对照组,收获细胞,不做任何处理;(2)CsA组,加入4.2μmol/LCsA;(3)CsA+Tran组,预先加入100μmol/L Tran,作用2 h后再加入4.2 μmol/L CsA;(4)Tran组,仅加入100μmol/L Tran.72 h后于共聚焦显微镜下观察各组细胞形态学变化;用免疫荧光法以及免疫印迹法检测各组钙黏蛋白(E-cadherin)、平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)和骨桥蛋白(OPN)的表达.结果 HK-2细胞在正常情况下表现为典型的"鹅卵石"样形态,细胞圆钝,且与邻近的细胞连接较为紧密;空白对照组和Tran组细胞表现为典型的HK-2细胞形态;CsA组细胞变狭长,甚至向周边伸出"伪足"样改变,细胞间连接较为稀疏;CsA+Tran组的细胞形态学改变有明显改善.CsA组细胞E-cadherin荧光表达强度明显弱于对照组,α-SMA、OPN荧光表达强于对照组;CsA+Tran组细胞E-cadherin荧光表达强于CsA组,α-SMA、OPN荧光表达弱于CsA组.免疫印迹检查中,CsA组细胞E-cadherin 的表达明显低于对照组,而α-SMA、OPN的表达明显高于对照组,CsA+Tran组细胞E-cadherin的表达高于CsA组,而α-SMA、OPN的表达低于CsA组.结论 曲尼司特能抑制CsA诱导的HK-2细胞由肾小管上皮向间充质细胞转化的过程,其机制可能与抑制OPN的表达有关.

Abstract：

Objective To study the effect of tranilast on cyclosporine A (CsA)-induced epithelial-to-mesenchymal transition in human renal tubular epithelial cells, and investigate the mechanism of its antifibrotic effect. Methods Cultured HK-2 cells were divided into four groups: (1)In the control group, cells were treated without any medicine; (2) The cell were treated with CsA (4. 2μmol/L) for 72 h; (3) The cells were treated with a combination of CsA (4. 2 μmol/L) and tranilast (100μmol/L); (4) The cells were treated with tranilast (100 μmol/L) alone for 72 h.Morphological changes of the cells were assessed by phase-contrast microscopy. The immunofluorescence and Western blotting were adopted to detect the expression of E-cadherin, α-SMA and OPN mRNA and proteins respectively. Results Tranilast could markedly ameliorate the morphological changes of HK-2 cells stimulated by CsA. The irmmunofluorescence staining revealed the expression of E-cadherin was markedly decreased in HK-2 cells stimulated with CsA for 72 as compared with the control group, while the expression of α-SMA and OPN was significantly higher in CsA group than the control group. The expression of E-cadherin in the CsA + Tranilast group was higher than the CsA group, while the expression of α-SMA and OPN in the CsA + Tranilast group was lower than the CsA group. Western blotting showed that protein expression level of E-cadherin in CsA group was dramatically lower than that in the control group (P＜0. 05), while that of α-SMA and OPN in CsA group was significantly higher than in the control group (P＜0.05). The protein expression level of E-cadherin in HK-2 cells in the CsA + Tranilast group was markedly higher than in the CsA group (P＜0.05), and that of α-SMA and OPN in CsA + Tranilast group was significantly lower than in the CsA group (P＜0. 05). Conclusion Tranilast can block the CsA-induced epithelialto-mesenchymal transition in HK-2 cells probably by suppressing the expression of OPN.     

瘦素对人肾小管上皮细胞表型转化及纤维连接蛋白表达的影响

目的:通过观察瘦素(leptin)刺激对人肾小管上皮细胞(HK-2)表型转化和纤维连接蛋白(FN)表达的影响,探讨瘦素对HK-2细胞转分化的作用。方法:将体外培养的HK-2细胞分为对照组和不同浓度瘦素作用组。倒置显微镜下观察HK-2细胞形态学变化;实时荧光定量RT-PCR法检测HK-2细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和FN mRNA的表达水平;免疫细胞化学法检测HK-2细胞表达α-SMA的阳性细胞百分数;酶联免疫吸附法(ELISA)检测HK-2细胞培养液上清中FN的表达。结果:分别用50、100、200 ng/ml瘦素作用HK-2细胞48 h后,(1)HK-2细胞逐渐由椭圆形变成长梭形,类似肌成纤维细胞的形态;(2)RT-PCR结果表明,瘦素作用可以下调E-cadherin mRNA的表达,同时上调α-SMA、FN mRNA的表达。(3)免疫细胞化学结果表明,对照组HK-2细胞几乎不表达α-SMA,随着瘦素作用浓度的增加,α-SMA阳性的HK-2细胞百分数逐渐增多;(4)ELISA结果表明,对照组HK-2细胞有基础水平的FN分泌,各瘦素作用组上清液中FN的表达水平较对照组显著增加,且呈一定的剂量依赖关系。结论:瘦素可诱导肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞,分泌细胞外基质,从而可能参与肾间质纤维化的发生发展。