间隙连接蛋白43表达改变对肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 研究肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化（TEMT）过程中间隙连接蛋白43（connexin 43）表达和细胞间通讯功能的变化,以及上调connexin 43水平对TEMT的影响。方法 用转化生长因子（TGF）β1刺激人肾小管上皮细胞系（HKC）,检测connexin 43、上皮细胞标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）和肌成纤维细胞标志物α-SMA、vimentin的表达。用激光共聚焦显微镜荧光漂白恢复（FRAP）技术检测HKC细胞间通讯功能。通过pLNCX2- connexin 43病毒质粒转染HKC上调connexin 43的表达,检测以上各指标的变化,观察对TEMT的影响。结果 HKC经TGF-β1刺激后．其α-SMA和vimentin mRNA和蛋白质表达增强,而E-cadherin和connexin 43表达下降（P＜0．05）,细胞间通讯功能降低（P＜0．05）。connexin 43高表达后,TEMT程度明显减轻。结论 上调肾小管上皮细胞间通讯功能可部分减轻TEMT程度。     

两种不同病理类型肾病患者尿蛋白诱导肾小管上皮细胞上调表达趋化因子及其分子信号机制研究

目的 观察不同病理类型肾病患者尿蛋白对人近端肾小管上皮细胞（HK-2）分泌趋化因子的影响并探讨其分子信号机制。 方法 所有患者均经临床和肾穿刺活检确诊为原发性局灶节段性肾小球硬化（FSGS）或微小病变性肾病（MCD）。以超滤法浓缩提取患者尿中总蛋白，分别刺激体外培养的HK-2细胞。RT-PCR检测调节正常T细胞表达和分泌的细胞因子（RANTES）及巨噬细胞移动抑制因子（MIF）的mRNA水平。免疫荧光、ELISA及流式细胞仪检测蛋白水平的表达。Western 印迹法检测p38 MAPK和胞外信号调节激酶（ERK）水平。特异性抑制剂SB203580抑制p38磷酸化；PD98059则用于抑制ERK磷酸化。 结果 两种尿蛋白成分有差异，FSGS患者尿蛋白中含有更多的大分子量蛋白。两种尿蛋白均刺激HK-2细胞RANTES及MIF表达上调，而FSGS患者尿蛋白刺激作用更强。两种尿蛋白均显著激活HK-2细胞内ERK和p38 MAPK信号通路。特异性抑制剂分别抑制ERK或p38 MAPK的活化后，FSGS患者尿蛋白介导的RANTES和MIF的上调表达作用可被SB203580或PD98059抑制，而MCD患者尿蛋白的刺激作用却仅能被SB203580所阻断。 结论 FSGS肾病患者的尿蛋白比MCD患者的尿蛋白有更强的上调HK-2细胞RANTES及MIF表达的作用。两种尿蛋白介导趋化因子上调表达的分子信号机制存在差异。     

甲状旁腺激素通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路诱导人近曲小管上皮细胞结缔组织生长因子表达

目的 观察甲状旁腺激素（PTH）对人肾小管上皮细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）的影响，并探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号途径在此过程中的作用。 方法 采用实时定量PCR、Western印迹、报告基因等技术，观察PTH诱导人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞CTGF表达的情况。使用信号通路抑制剂PD98059、U0126阻断信号通路以明确PTH发挥作用的信号途径。 结果 正常HK-2细胞有基础水平的CTGF mRNA和蛋白表达，PTH刺激后其表达水平显著增加。10-10 mol/L PTH作用12 h后，荧光素酶活性较对照组明显升高[（1.8884±0.0780）比（0.9891±0.0300） A，P ＜ 0.01]。正常HK-2细胞有少量p-ERK1/2表达，PTH刺激后p-ERK1/2表达明显升高，以10-10 mol/L PTH作用30 min时效应最强；MAPK通路抑制剂PD98059、U0126作用后，CTGF mRNA、蛋白、基因启动子表达均明显下降。 结论 PTH可诱导HK-2细胞CTGF表达，其作用可能是通过MAPK信号通路来实现的。     

瘦素对人肾小管上皮细胞表型转化及纤维连接蛋白表达的影响

目的:通过观察瘦素(leptin)刺激对人肾小管上皮细胞(HK-2)表型转化和纤维连接蛋白(FN)表达的影响,探讨瘦素对HK-2细胞转分化的作用。方法:将体外培养的HK-2细胞分为对照组和不同浓度瘦素作用组。倒置显微镜下观察HK-2细胞形态学变化;实时荧光定量RT-PCR法检测HK-2细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和FN mRNA的表达水平;免疫细胞化学法检测HK-2细胞表达α-SMA的阳性细胞百分数;酶联免疫吸附法(ELISA)检测HK-2细胞培养液上清中FN的表达。结果:分别用50、100、200 ng/ml瘦素作用HK-2细胞48 h后,(1)HK-2细胞逐渐由椭圆形变成长梭形,类似肌成纤维细胞的形态;(2)RT-PCR结果表明,瘦素作用可以下调E-cadherin mRNA的表达,同时上调α-SMA、FN mRNA的表达。(3)免疫细胞化学结果表明,对照组HK-2细胞几乎不表达α-SMA,随着瘦素作用浓度的增加,α-SMA阳性的HK-2细胞百分数逐渐增多;(4)ELISA结果表明,对照组HK-2细胞有基础水平的FN分泌,各瘦素作用组上清液中FN的表达水平较对照组显著增加,且呈一定的剂量依赖关系。结论:瘦素可诱导肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞,分泌细胞外基质,从而可能参与肾间质纤维化的发生发展。     

Numb基因在大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中的作用

目的 探讨Numb在大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中的作用。 方法 重组人转化生长因子β1（TGF-β1）刺激大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E细胞),不同浓度TGF-β1 （0、1、5、10、15、20 μg/L）作用48 h与TGF-β1 10 μg/L作用不同时间(0、24、48、72 h)后,采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光染色分别检测NRK52E细胞内E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Numb 的表达。采用RNA干扰技术下调Numb表达,Western印迹观察改变Numb水平对E-cadherin、α-SMA蛋白水平的影响。 结果 TGF-β1以剂量及时间依赖的方式诱导NRK52E细胞E-cadherin 蛋白表达下调,α-SMA 蛋白表达增高。Numb蛋白的表达随TGF-β1浓度的增加而增高,在5、10、15和20 μg/L时分别为0 μg/L时的1.33倍（P = 0.024)、1.39倍（P = 0.035）、1.45倍（P = 0.025）和1.51倍（P = 0.000)。而Numb蛋白和mRNA的表达亦随TGF-β1作用时间的延长而增高,作用24 h、48 h、72 h,Numb蛋白分别为0 h的1.48倍（P = 0.046)、1.54倍（P = 0.011）、1.79倍（P = 0.028）,Numb mRNA分别为0 h的1.56倍（P = 0.012)、1.82倍（P = 0.008）、1.82倍（P = 0.002）;同时Numb的分布也发生了改变,大量聚集在胞质中。下调Numb表达可以显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA表达上调（为Numb表达正常时的18.1%,P = 0.004）、E-cadherin表达下调（为Numb表达正常时的2.19倍,P = 0.004）。 结论 Numb可以促进肾小管上皮细胞发生转分化。     

虫草素通过下调TGF-β抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化

目的：探讨虫草素对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响。方法：体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞株（NRK52E细胞株）,分为正常对照组（葡萄糖5.5 mmol/L,NG组）、高糖组（葡萄糖30 mmol/L,HG组）、高糖＋虫草素组（葡萄糖30 mmol/L＋虫草素10μg/ml,HG＋C组）。分别于刺激12 h,24 h,48 h后收集细胞。应用定量RT-PCR测定NRK52E TGF-β,E-cadherin,α-SMA mRNA的表达;Western印迹方法检测TGF-β、E-cadherin、α-SMA蛋白的表达。结果：高糖刺激后NRK52E细胞的TGF-β和α-SMA mRNA及蛋白表达明显高于正常糖组（P〈0.01）,而虫草素组TGF-β和α-SMA mRNA及蛋白表达显著低于高糖组（P〈0.05）;高糖诱导的NRK52E细胞E-cadherin mRNA及蛋白水平明显降低（P〈0.01）;而虫草素组NRK52E细胞E-cadherin mRNA及蛋白水平显著高于高糖组（P〈0.05）。结论：虫草素可以明显抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化,其机制可能是通过下调TGF-β实现。     

Wilms瘤1基因在肾小管上皮细胞转分化中的表达及作用

目的 探讨Wilms 肿瘤1基因(WT1)在肾小管上皮细胞(TEC)向肌成纤维细胞转分化中的可能作用｡方法 将体外原代培养TEC分别置含IL-1α(10 ng/ml)､ IL-1α+抗WT1中和抗体(10 μg/ml)的DMEM/F12培养基中培养, 观察TEC的形态变化及免疫学特征｡采用RT-PCR检测各组TEC中WT1及α-SMA的表达｡结果 经IL-1α掺入培养5 d后,体外培养的TEC形态特征趋于成纤维细胞化,细胞拉长､梭形变,失去原有的呈铺路石样的生长方式｡电镜下细胞极性丧失,表面微绒毛消失｡正常情况下,成年TEC不表达WT1｡经IL-1α掺入培养1 d后,TEC重新表达WT1,同时伴有α-SMA的表达;3 d后WT1表达消失,呈一过性特征,而α-SMA的表达则随时间的延长而逐渐增强｡在培养中掺入抗WT1抗体以中和WTl基因产物后,尽管仍给予IL-1α刺激,TEC大都保持原有特征不变,α-SMA及WT1 mRNA仅呈微弱表达｡结论 高浓度IL-1α可导致TEC向肌成纤维细胞的转分化｡在TEC的转分化过程中,WT1基因的重新､一过性表达可能起着重要作用｡成年TEC重新获得WT1表达,可能是其发生转分化的内在启动机制｡体外中和WT1的基因产物可明显抑制TEC的转分化进程,并可能籍此影响肾脏的纤维化发生｡     

金雀异黄素在甲状旁腺激素诱导的人近曲小管上皮细胞结缔组织生长因子表达中的调控作用

目的 探讨金雀异黄素（Gen）对甲状旁腺激素（PTH）引起的人近曲小管上皮细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）的调控作用。 方法 应用实时定量-聚合酶链反应（real time-PCR）、Western蛋白印迹、报告基因等技术,观察Gen对PTH诱导人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞CTGF表达的影响。使用MAPK通路抑制剂U0126阻断信号通路以明确Gen发挥作用的机制。 结果 HK-2细胞有基础量的CTGF mRNA和蛋白表达,PTH刺激后其表达量显著增加（P ＜ 0.05）。10-10 mol/L PTH作用12 h后,荧光素酶活性较对照组明显升高（1.8884±0.0780比0.9891±0.0300,P ＜ 0.01）。Gen剂量依赖性下调PTH诱导的HK-2细胞CTGF表达。正常HK-2细胞有少量磷酸化（p）ERK1/2表达,PTH刺激后p-ERK1/2表达明显升高,以10-10 mol/L PTH作用30 min时效应最强。U0126作用后,CTGF mRNA、蛋白表达均明显下降（P ＜ 0.05）。Gen抑制PTH所致的HK-2细胞ERK1/2活化。 结论 Gen可通过阻断MAPK信号通路抑制PTH诱导的HK-2细胞CTGF表达。     

法舒地尔对糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 观察法舒地尔对糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响并探讨其机制。 方法 将实验性Wistar大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组、法舒地尔治疗组。3个月后处死动物,PAS染色法观察肾小球病理变化,Masson染色法观察肾间质病理变化;免疫组化观察肾脏皮质ROCKⅠ、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E钙黏蛋白（E-cadherin）的变化和β连环蛋白（β-catenin)的细胞定位改变;Western印迹法观察肾脏皮质p-MYPT1、α-SMA、E-cadherin、胞膜β-catenin蛋白的变化;实时定量PCR法观察ROCKⅠ、E-cadherin和总β-catenin的mRNA变化。 结果 法舒地尔治疗可改善肾间质纤维化状况。与正常对照组相比,糖尿病组大鼠肾皮质内p-MYPT1、α-SMA蛋白表达增强（均P < 0.01）;E-cadherin、胞膜β-catenin的蛋白表达减弱（均P < 0.01）;ROCK1、总β-catenin mRNA表达增强（均P < 0.01）;E-cadherin mRNA表达减弱（P < 0.01）。与糖尿病组相比,治疗组p-MYPT1、α-SMA蛋白表达减弱 （均P < 0.01）;E-cadherin、胞膜β-catenin的蛋白表达增强（均P < 0.05）;ROCK1、β-catenin mRNA表达减弱（均P < 0.01）;E-cadherin mRNA表达增强（P < 0.01）。 结论 法舒地尔可能通过抑制Rho激酶活性减轻糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化和肾间质纤维化,该作用可能与法舒地尔恢复肾小管上皮细胞的黏附特性与紧密连接复合体有关。     

高糖通过转化生长因子β1-Smad信号传递途径诱导肾小管上皮细胞转分化

目的 通过观察高糖对肾小管上皮细胞转分化(EMT)的作用，探讨其与转化生长因子β1 (TGF-β1)的关系及糖尿病肾病肾小管间质纤维化的发病机制。 方法 以人肾小管上皮细胞株HKC细胞和高表达Smad7蛋白的HKC转染细胞株为研究对象。蛋白印迹法检测高糖(葡萄糖浓度分别为25和50 mmol/L)对α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E钙黏蛋白 (E-cadherin)和纤连蛋白(FN)表达的影响。酶联免疫吸附(ELISA)法检测TGF-β1的水平。Boyden小室检测HKC细胞的迁移能力。抗TGF-β1抗体中和实验分析高糖对肾小管EMT作用及与TGF-β1的关系。 结果 持续的高糖作用(96 h)能够导致HKC表达α-SMA蛋白，其中25和50 mmol/L的葡萄糖分别增加表达α-SMA 2.8倍和8.2倍；降低E-cadherin的表达；刺激合成FN。25和50 mmol/L的葡萄糖刺激HKC 12 h后，细胞培养上清液中TGF-β1浓度分别为(408.5±198.6)和(939.3±311.8) ng/L，呈剂量依赖性。抗TGF-β1抗体能够显著抑制高糖导致的HKC高表达α-SMA蛋白和FN及降低E-cadherin表达的作用。高表达Smad7蛋白的HKC转染细胞株在高糖的持续作用下，不能表达α-SMA和FN蛋白，E-cadherin也未见降低。细胞迁移实验表明，25和50 mmol/L高糖能够增加HKC迁移至Boyden小室膜下侧面的细胞数[(12.4±3.7)和（18.6±4.4)细胞/HP）]，与正常对照组[(3.0±0.8)细胞/HP]差异有统计学意义(P < 0.01)。抗TGF-β1多克隆抗体能够部分抑制高糖(50 mmol/L)造成的HKC细胞向Boyden小室膜下侧面的迁移[(11.9±5.2)细胞/HP]。高表达Smad7蛋白的HKC转染细胞株在高糖培养条件下迁移至Boyden小室膜下侧面的细胞数[（4.3±1.2）细胞/HP]与正常对照组差异无统计学意义。 结论 高糖能够诱导肾小管EMT，此作用与高糖刺激该细胞合成TGF-β1有关，阻止Smad信号途径能够拮抗TGF-β1介导的肾小管EMT的作用。     

狼疮肾炎患者尿蛋白通过p38丝裂素活化蛋白激酶信号途径刺激近端肾小管上皮细胞上调表达骨调素

目的探讨p38丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在狼疮肾炎(LN)尿蛋白介导近端肾小管上皮细胞(HK-2)表达骨调素(DPN)中的作用。方法收集狼疮肾炎患者24h的尿液提纯总蛋白，体外刺激HK-2细胞，分别用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western印迹法观察应用p38MAPK特异性阻断剂SB203580对。HK-2细胞表达OPN mRNA及蛋白的影响：免疫荧光法检测OPN及其受体CD44在细胞中的表达。结果狼疮肾炎患者尿蛋白可刺激HK-2细胞OPN mRNA及蛋白上调表达，并呈时间和浓度依赖性，而SB203580可明显抑制这一作用。结论狼疮肾炎尿蛋白可通过p38MAPK途径刺激HK-2细胞OPN mRNA和蛋白上调表达。     

大鼠肾小管上皮细胞的原代培养及传代

建立大鼠肾小管上皮细胞原代培养、传代及鉴定方法。方法采用研磨、消化培养法,并以０．２５％胰蛋白酶（Ａ组）、０．２５％胰蛋白酶－０．０２％ＥＤＴＡ（Ｂ组）分别消化、传代、对比,以免疫细胞化学方法鉴定细胞种类。结果成功培养、传代（１３～１８代）并鉴定（抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１８抗体）了肾小管上皮细胞,发现Ａ组消化传代效果明显优于Ｂ组。结论０．２５％胰蛋白酶消化传代方法是大鼠肾小管上皮细胞原代培养、传代及鉴定的有效手段。     

c-Jun氨基末端激酶信号通路对缺氧上调血管内皮细胞钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶表达的影响

目的 了解缺氧对钙／钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶（CASK）表达的影响及c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路在其中的作用。方法 将人血管内皮细胞株EA．hy926进行缺氧处理3h后继续常规培养0、12、24、48、72h，同时设常氧培养对照。采用蛋白质印迹法检测CASK的表达。构建CASK启动子区荧光素酶报告基因质粒。用其转染细胞后，于常氧及缺氧培养1、3、6、12h裂解细胞提取总蛋白，检测报告基因萤火虫荧光素酶及内参照海肾素荧光素酶活性，并用蛋白质印迹法检测JNK磷酸化情况。在培养的细胞中分别加入不同剂量（0、10、100nmo/L，1、10μmol／L）的JNK抑制剂SP600125预处理1h后再缺氧培养3h，观察其对CASK表达的影响。结果缺氧处理后常规培养0～72h，细胞CASK持续保持高表达，并明显高于常氧组。随着缺氧时间延长荧光素酶相对活性普遍增加，均高于常氧组（0．010±0．003，P〈0．01），且缺氧12h达峰值（0．192±0．023）。JNK的磷酸化随缺氧时间延长逐渐增强。加入SP600125后，CASK的表达显著降低，并呈剂量一效应依赖性，其浓度为10μmol／L时，抑制效率达高峰。结论 缺氧上调血管内皮细胞CASK的表达部分依赖于JNK信号通路活化。     

骨成形蛋白7对人肾小管上皮细胞增殖和转分化的影响

目的观察骨成形蛋白7(BMP-7)对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化的影响,以探讨其延缓小管间质纤维化病变的作用及其可能机制。方法将体外培养的人肾小管上皮细胞分为空白对照组、TGF-β1组、TGF-β1 50ng/mlBMP-7组、TGF-β1 100ng/mlBMP-7组。应用MTT比色法测定BMP-7对人肾小管上皮细胞增殖的作用;间接免疫荧光法测定人肾小管上皮细胞α-SMA、角蛋白、波形蛋白的表达;流式细胞仪检测表达α-SMA阳性的HK-2细胞百分率;RT-PCR检测细胞中α-SMAmRNA的表达。结果与空白对照组相比,不同浓度的BMP-7处理HK-2细胞24、48h后,HK-2细胞均明显增殖(P<0.05)。免疫荧光检测结果显示,经TGF-β1刺激后,角蛋白表达减弱,α-SMA和波形蛋白表达增强;加入50ng/mlBMP-7处理24、48h后,细胞中α-SMA和波形蛋白表达减弱。流式细胞仪检测发现,加入50ng/mlBMP-7处理24、48h后,表达α-SMA的HK-2细胞阳性率逐渐下降,与TGF-β1处理组相比差异有显著性意义(P<0.05)。RT-PCR结果显示,空白对照组无α-SMAmRNA表达,5ng/mlTGF-β1组与空白对照组相比,α-SMAmRNA表达明显上调(P<0.05),而TGF-β1 50ng/mlBMP-7组、TGF-β1 100ng/mlBMP-7组与TGF-β1组相比,α-SMAmRNA表达有下降趋势,但无显著性差异(P>0.05)。结论TGF-β1促进肾小管上皮细     

心肌缝隙连接蛋白43侧膜化机制的研究进展

背景 缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)是心肌缝隙连接的主要结构,多种心脏病理过程(如缺血/再灌注等)均可使Cx43重分布至侧膜而发生侧膜化.这种侧膜化使缝隙连接脱耦连,导致折返性心律失常,严重影响心脏的功能.目的 旨在从Cx43转运及定位过程来阐述心肌Cx43侧膜化的分子机制.内容 Cx43侧膜化与闰盘处N钙黏蛋白、桥粒、紧密连接蛋白-1(zonulaoccludens-1,ZO-1)等连接蛋白(connexins,Cxs)的解耦连,以及细胞骨架蛋白介导的Cx43重定向转运密切相关;此外,Cx43的磷酸化、乙酰化也参与了侧膜化的过程.从Cxs、细胞骨架蛋白、磷酸化、乙酰化4个方面就Cx43侧膜化的分子机制展开具体讨论.趋向 为进一步研究Cx43侧膜化机制及临床治疗折返性心律失常提供相关思路及分子基础.     

血管紧张素Ⅱ通过抑制AKT/蛋白激酶B磷酸化诱导肾小管上皮细胞凋亡

目的观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在诱导肾小管上皮细胞凋亡的信号传导是否有磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-AKT信号系统的参与,及该系统在诱导细胞凋亡中的作用。方法大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52E分别与终浓度为0(对照组)、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-5mol/LAngⅡ共培养24h。用流式细胞仪检测细胞凋亡指数,用免疫组化方法检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。Western印迹检测PI3K及磷酸化AKT和总AKT蛋白表达,AKT的磷酸化水平用473位丝氨酸磷酸化AKT(AKT-ser473)水平与总AKT水平的比值表示。结果随着AngⅡ浓度的增加,10-6mol/LAngⅡ组与对照组相比,凋亡指数显著增加[(22.7±1.41)%比(3.0±0.75)%,P<0.01]。而10-9mol/LAngⅡ组与对照组相比,PCNA指数显著增强[(47.54±2.6)%比(22.63±2.5)%,P<0.01]。与对照组相比,PI3K-p85蛋白的表达随AngⅡ浓度增加表现为先激活后抑制。AKT的磷酸化具有明显的AngⅡ浓度依赖性,随AngⅡ浓度的增加而逐渐受到抑制,并与细胞凋亡指数呈显著负相关(r=-0.90,P<0.01)。结论AngⅡ可以诱导肾小管上皮细胞凋亡并抑制细胞的增殖,可能部分是通过抑制PI3K-AKT信号传导途径实现的。     

棉酚对睾丸支持细胞间隙连接蛋白表达的影响

目的:探讨药物棉酚对睾丸Sertoli细胞间隙连接蛋白Cx43表达的影响。方法:培养TM4睾丸Sertoli细胞,用1.25、2.5、5、10μmol/L的棉酚分别染毒细胞6、12、24、48 h。CCk-8试剂盒检测细胞毒性,应用细胞免疫荧光化学、RT-PCR检测Cx43在正常TM4细胞和在不同浓度及不同染毒时间的TM4细胞中的表达情况。结果:半定量RT-PCR及免疫荧光结果显示,正常TM4细胞中有较多的Cx43表达;棉酚染毒24 h后,Cx43 mRNA水平开始随时间增加而逐渐下降(P<0.05),且随剂量增加Cx43蛋白表达强度逐渐减弱(P<0.05)。结论:棉酚可抑制TM4细胞表达Cx43,可能是其抗生育的机制之一。     

自噬在脂质诱导的肾小管上皮细胞损伤中脂质聚集中的作用

目的初步探讨自噬在脂质诱导的肾小管上皮细胞损伤中脂质聚集中的作用。方法将HK-2细胞培养后,分为4组:0μg/ml组(A组)、20μg/ml组(B组)、50μg/ml组(C组)、100μg/ml组(D组)。分别用0μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)刺激肾小管上皮细胞24 h,用油红O法检测细胞内中性脂质,通过透射电子显微镜下观察自噬体形成,荧光显微镜下观察LC3-GFP融合蛋白示踪自噬形成,Wester blotting检测LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白。结果①油红O显示在0~100μg/ml浓度范围内LDL随浓度增高刺激细胞内脂质增多;②电镜显示正常HK-2细胞内可见少许自噬泡,在0~50μg/ml浓度范围内随LDL刺激浓度增加,细胞内自噬泡逐渐增多,但达到一定浓度(即100μg/ml)后自噬泡急剧减少;③正常HK-2细胞内可见少许LC3-GFP染色阳性,在0~50μg/ml浓度范围内随LDL刺激浓度增加,细胞内LC3-GFP染色阳性逐渐增多,但达到一定浓度即100μg/ml后LC3-GFP染色阳性急剧减少;④正常HK-2细胞内存在少量的LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ,但以LC3-Ⅰ为主,在0~50μg/ml浓度范围内随LDL刺激浓度增加,LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ均增加,但LC3-Ⅱ增加更明显,50μg/ml LDL组LC3-Ⅰ是0μg/ml LDL组的2倍,LC3-Ⅱ表达是0μg/ml的3倍,差异有统计学意义(均P0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐渐增高,分别为0.41,0.82,1.23,差异有统计学意义(均P0.05),但LDL达到100μg/ml后LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ均急剧减少,100μg/ml LDL组LC3-Ⅰ降至与0μg/ml组LDL相同(P0.05),LC3-Ⅱ表达降至为0μg/ml LDL组的1.5倍,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也急剧下降至0.52,差异有统计学意义(均P0.05)。结论肾小管上皮细胞内自噬与脂质有一定关系,自噬可能参与脂质诱导的肾小管上皮细胞内脂质聚集。