O:3型小肠结肠炎耶氏菌外膜蛋白用于布氏菌与O:9型耶氏菌感染的鉴别诊断

0:3型小肠结肠炎耶氏菌质粒编码的外膜蛋白的电泳性质及免疫原性与0:9型耶氏菌相同。利用0:3型耶氏菌外膜蛋白为抗原的免疫斑点试验或免疫印迹试验能够明确区别布氏菌与0:9型耶氏菌感染的血清学交叉反应,较通常用0:9型耶氏菌或布氏菌为抗原,更为明显。     

基于核酸适配体SERS技术快速检测大肠埃希菌O157:H7的研究

目的基于核酸适配体表面增强拉曼技术(SERS),建立一种快速检测大肠埃希菌O157:H7的方法。方法将大肠埃希菌O157:H7与其特异性适配体共孵育,采用原位还原纳米银方法在大肠埃希菌O157:H7-适配体表面原位还原纳米银颗粒,形成纳米银壳,通过SERS技术特异性检测目标细菌。结果在500~1 900cm-1范围内采集拉曼信号,在735cm-1、1 331cm-1、1 578cm-1处发现拉曼特征峰。对检测到的拉曼信号峰进行归属分析,735cm-1来自胞嘧啶与尿嘧啶的代谢产物,1 331cm-1归属于鸟嘌呤代谢产物,1 578cm-1归属于蛋白质中酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ。将大肠埃希菌O157:H7、单增李斯特氏菌、肠炎沙门氏菌、福氏志贺氏菌、大肠埃希菌DH5α混合,通过SERS可快速检出目标细菌大肠埃希菌O157:H7。试验的重复性良好,最低检测限为10cfu/ml。结论基于核酸适配体SERS技术,建立的大肠埃希菌O157:H7快速检测方法的特异性和灵敏性高、操作简单、省时,费用低,可用于临床大肠埃希菌O157:H7感染的快速检测。     

大肠埃希菌O157∶H7脂肪酸组分及DNA特征研究

目的探讨大肠埃希菌O157∶H7脂肪酸组分及DNA指纹图谱特征。方法用气相色谱(Gas chromatography,GC)及随机扩增多态性DNA(Randomly amplified polymorphyic DNA,RAPD)对2株大肠埃希菌O157∶H7和其他6株大肠埃希菌全细胞脂肪酸组分及DNA指纹图谱特征进行分析。结果大肠埃希菌O157∶H7不仅含有15∶0和17∶0脂肪酸组分,不含或仅含微量14∶02OH和19∶0ω8c脂肪酸,而且sum4和sum7脂肪酸峰值也明显高于其他菌株,DNA指纹谱也显示了其独有特征。结论大肠埃希菌O157∶H7脂肪酸组分及相对含量和DNA指纹图谱特征与O26∶H11及其他大肠埃希菌显著不同,与大肠埃希菌O26∶H11等在遗传进化关系上存在一定距离。     

关于布鲁氏菌与耶尔森氏菌0:9型感染的鉴别诊断的实验研究

当前用血清学反应诊断人畜布病,由于存在相当程度的非特异性交叉反应,其特异性越来越令人耽忧。在这些非特异性反应中构成对布氏菌感染诊断有影响是Y.enterocolitica 0:9型菌感染。布氏菌感染血清与Y.entero 0:9菌的反应滴度几乎与布氏菌反应滴度相似,反之亦然。故对鉴别二者感染已成为当前研究的焦点。 鉴别两菌感染的血清学研究,除了恩庶等采用Y.entero 0:3菌的Omp作血清学检查有一定鉴别外,其余报告收效甚微。基于此,相继出现了用     

PCR检测布氏菌DNA的试验研究

目的 探讨编码牛种布氏菌同一蛋白基因序列不同扩增片断（分别为330bp、230bp和223bp）的3对引物检测布氏菌DNA PCR试验的特异性和敏感性。方法 用煮沸法和酚提取法分别从5个种布氏菌和耶尔森氏菌0：3、O：9、大肠菌O：157中提取DNA进行PCR试验。结果 通过此种方法可检测到小到1PG的布氏菌DNA。对布氏菌5个种的典型株进行DNA分析，并获得独有的相应片断。而2种与布氏菌SPP存在血清学交叉反应的革兰氏阴性细菌未检测到特异DNA片段。结论 3对引物均有良好的特异性和敏感性，但P5、P6稳定性稍差。     

布鲁氏菌与耶尔森氏菌感染的鉴别诊断试验研究(Ⅱ)

目的 用PCR和酶联试验鉴别布氏菌与耶尔森氏菌感染。方法 以不同种布氏菌及不同型耶尔森氏菌分别感染动物，不同时间采样进行PCR和DAgS-ELISA及其他血清学方法进行检查。结果 两菌感染血清的SAT都出现了不同程度的交叉，RBPT及DAgS－ELISA几乎无交叉反应。布氏菌与耶尔森氏菌0：9型的B.abortus 36KD蛋白基因引物的PCR有明显交叉反应。结论 用RBPT或DAgS-ELISA对两菌感染的鉴别是有益的。用B.abortus 36KD蛋白基因引物的PCR鉴别两菌感染是困难的，而且有交叉扩增。     

淄防9010菌和Ye 0:9及布氏菌之间的血清学交叉反应初步试验报告

本站1990年在羊的血培养中检出1株与布氏菌有交叉反应的迟缓爱德华氏菌(代号9010)为了解9010,Ye0:9布氏菌之间的交叉反应情况,用以上三种菌免疫家兔,制备抗血清,进行了交叉凝集和互相吸收试验,结果报告如下1 材料和方法1.1 供试菌株 9010本细菌保存,S_2免疫用菌苗,Ye0:9购自北京生物制品鉴定所菌种库1.2 实验动物 由淄博市制药厂质检科提供。供试家兔、免疫前耳静脉采血,以上3株菌的抗体均在1:8以下1.3 抗原及抗血清制备     

大肠埃希菌O157:H7环介导等温扩增可视化检测方法的建立

目的建立肠出血性大肠埃希菌O157︰H7环介导等温扩增(LAMP)可视化快速检测方法。方法针对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157︰H7编码脂多糖rfbE基因保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据HNB的颜色变化进行结果判定,评价LAMP方法的特异性和灵敏性。结果建立的LAMP法对O157︰H7rfbE基因的最低检出限约为100copy/反应管,检测肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)、宋内志贺菌、福氏志贺菌均为阴性。体系的扩增效率较高,可在40min内出结果。结论建立的基于颜色判定的EHEC O157︰H7LAMP检测方法具有特异、灵敏,设备要求简单等特点,适用于EHEC O157︰H7的快速检测。     

布鲁氏菌与小肠结肠炎耶氏菌血清学鉴别诊断

1969年,芬兰学者Ahvonen等首次报道了布鲁氏菌(简称布氏菌)与0:9型小肠结肠炎耶尔森氏菌(简称耶氏菌)之间存在严重的血清学交叉反应。从而引起了国内外学者极大关注。现已表明,布氏菌与几十种微生物有血清交叉反应,其中以耶氏菌最为严重。目前,我国开展人畜间布氏菌病(简称布病)调查,尤其在布病非流行地区仍采用常规血清学诊断方法,而这些常规方法无法排除布氏菌与其它微生物之间的血清交叉反应。本文自1991年以来,收集我省部分历史布病流行地区家猪、牛、羊和可疑布氏菌感染人群血清,进行布氏菌与耶氏菌血清学鉴别诊断研究,现将结果报道如下。     

衢州市带毒力因子肠出血性大肠埃希菌O157：H7的检测

目的了解衢州市家禽、家畜肠出血性大肠埃希菌O157:H7带菌情况和菌型分布特征,以制定相应的防治对策。方法6月份肠道传染病高发季节,采集动物粪便标本,对O157:H7菌株进行分离培养,并用PCR方法检测其毒力基因。结果共采集动物粪便标本300份,检出O157:H7菌16株,总带菌率为5.33%,其中牛、羊、猪带菌率较高,分别为20.83%、12.70%和3.61%。经PCR检测,检出的所有菌株均携带SLT2毒力因子,而SLT1与hly阴性。结论衢州市分离到带有毒力基因的肠出血性大肠埃希菌O157:H7,对人群健康构成了威胁,应加强O157:H7的综合监测。     

布氏菌和0∶9型小肠结肠炎耶氏菌两种抗体鉴别的研究

本文报告一种布病检测的简便方法,以硝酸纤维素膜为固相栽体的免疫斑点试验,使用两种抗原(牛种布氏菌和O:3型耶氏菌)进行测定,其敏感性和特异性均高于常规的布病试管凝集试验,而且方法简便,快速,适于基层推广使用,可以代替试管凝集试验,作为布病监测的首选方法。     

对常规制备的鼠疫F1抗原、抗体组分及免疫交叉反应的观察

目的对常规方法制备的鼠疫菌F1抗原、抗体的组分进行分析,并观察其免疫交叉反应。方法采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术分析抗原、抗体的组分;应用蛋白印迹观察其与相关细菌的免疫交叉反应。结果常规方法制备的鼠疫F1抗原、抗体组分复杂,混杂有其他多种蛋白;假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌的全膜蛋白与F1抗体存在交叉反应。结论常规方法制备的鼠疫F1抗原、抗体不纯,影响鼠疫免疫学诊断的特异性。     

快速检测牛羊猪种布鲁杆菌多重PCR的建立

目的 建立一种能同时快速检测并能鉴别牛、羊、猪种布鲁杆菌的多重PCR方法.方法 根据IS711插入序列设计1条公共引物和3条牛、羊、猪种布鲁杆菌(544A、16M、1330S)特有序列引物,进行多重PCR反应;选择耶尔森菌O:9、大肠埃希菌O157:H7、鼠伤寒沙门菌47729进行多重PCR反应的特异性检测;倍比稀释定量法观察牛种布鲁杆菌多重PCR反应的敏感性.结果 牛、羊、猪种布鲁杆菌多重PCR反应扩增片段产物长度分别为485、731、248 bp;耶尔森菌O:9、大肠埃希菌O157:H7、鼠伤寒沙门菌47729加入布鲁杆菌中进行多重PCR反应.扩增结果呈阴性;牛种布鲁杆菌多重PCR反应敏感性为0.0967 Pg.结论 成功建立快速检测牛、羊、猪种布鲁杆菌多重PCR扩增反应方法,且其特异性、敏感性较好.     

Nested-PCR在人间布鲁氏菌病早期快速诊断中的探讨

目的 探讨Nested-PCR在布鲁氏菌病(布病)患者早期快速诊断中的可行性.方法 用Nested-PCR对布鲁氏菌标准菌株的19生物型、4个疫苗株(M5、A19、S2和104M)和有血清交叉反应的菌株(人苍白杆菌、大肠杆菌O∶157、小肠结肠炎耶尔森氏菌O∶9)进行扩增,评价该方法的特异性;用Nested-PCR对倍...     

多重荧光定量PCR方法鉴定布鲁氏菌属及牛羊种布鲁氏菌研究

摘要：目的 利用多重实时荧光PCR技术,建立快速鉴定布鲁氏菌的方法。方法 根据布鲁氏菌特异性基因Bcsp31,AlkB/IS711和BMEI1162/IS711的部分片段作为靶基因,分别设计探针引物,将扩增产物连接到PUCm18-T载体上,制备标准品及标准曲线,确定此方法的灵敏度。利用布鲁氏菌的其他生物型菌株和同源性较近的致病菌（汉赛巴尔通体、霍乱弧菌、土拉弗朗西斯菌、大肠杆菌O:157、大肠杆菌O:16、小肠结肠耶尔森菌O:9、沙门氏菌N群血清型、嗜麦芽假单胞菌）验证所建立方法的特异性。通过布鲁氏菌标准菌株建立方法,优化体系后扩增97株地方株进行验证。结果 应用多重Taqman荧光PCR技术检测布鲁氏菌结果显示,布鲁氏菌属、牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌有各自的荧光信号,而与其同源性较高的致病菌均未见荧光信号;由标准曲线可知该方法的单重和多重荧光PCR最低检测下限均约为102copy/μL（13-24fg /μL）,是常规PCR灵敏度的100倍。结论建立的方法有灵敏度高、快速易操作等优点,可用于布鲁氏菌快速鉴定,并同时确定是否为牛种或羊种布鲁氏菌。     

基于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法的建立

目的 本文建立一种基于样品检测的特异性好、灵敏性高的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法。方法 以哺乳动物beta-actin基因和外源重组质粒为内参,针对布鲁氏菌属特异性基因IS711,建立用于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法,并验证其敏感性、特异性及稳定性,绘制标准曲线。将该方法用于哺乳动物样品检测,并与细菌分离培养检测结果比较。结果 荧光定量PCR方法对布鲁氏菌检测有良好的特异性,3对引物对阴性对照菌均无非特异性扩增;该方法用于样品检测的最低检测限为17拷贝;内外源内参同时存在条件下,布鲁氏菌荧光定量PCR的标准曲线相关系数为R²=0.997(Y=-3.12X+40.9)。将该方法直接用于181份动物样本的检测,并与分离培养结果相比,荧光定量PCR检测阳性率为11.4%,细菌分离培养检测阳性率为9.9%,且细菌分离培养阳性样品与荧光定量PCR阳性样品中编号基本一致。结论 本文建立的荧光定量PCR检测方法灵敏性高、特异性及稳定性好,可直接应用于样品的检测,检测结果受内参基因质控。     

鼠疫菌6 kb质粒核酸序列同源性比对分析

目的 分析云南省鼠疫菌6 kb(pYC)质粒核酸序列与GenBank中公开报道的多种细菌序列的同源性.方法 通过美国国立图书馆网站序列比对搜索工具(BLAST),对鼠疫菌pYC质粒全序列和开放式读码框架(ORFs)以及翻译蛋白进行核酸与核酸、蛋白与蛋白比对分析.结果 pYC质粒部分基因与宋内志贺菌质粒pKYM具有97.1%的同源性,与流感嗜血杆菌基因有92.1%的同源性,与伤寒沙门杆菌基因LT2和pIMVS1分别具有88.2%和87.2%的同源性,与大肠埃希菌0157:H7、K-12、ECOR31株局部基因分别具有81.4%、81.4%和84.7%的同源性.pYC质粒ORFs翻译蛋白ORF1与副鸡嗜血菌复制蛋白B具有47.2%的相似性,ORF4与大肠埃希菌推定蛋白具有52.7%的相似性,ORF5与假结核菌TriE蛋白具有48.3%的相似性,ORF6与大肠埃希菌PilxS/VirB5相似蛋白具有42.3%的相似性、与小肠结肠炎耶尔森菌TriD蛋白具有38.5%的相似性,ORFIO与伤寒沙门杆菌LT2细胞质蛋白具有83.1%的相似性.与大肠埃希菌0157:H7推定蛋白具有81.9%的相似性.ORF11与大肠埃希菌K12诱导损伤蛋白J具有81.4%的相似性.结论 pYC质粒DNA序列与肠杆菌科部分基因具有高度同源性,可能编码类似埃希菌属和耶尔森菌属推定蛋白、诱导损伤蛋白、TriD和TriE蛋白、Pilx5/VirB5相似蛋白.     

布鲁氏菌单克隆抗体的研究——Ⅰ.7株抗牛种布鲁氏菌单克隆抗体的建立

将SP2/O小鼠骨髓瘤细胞与经牛种布鲁氏菌104M菌种免疫的BALB/c鼠脾细胞融合,获得7株分泌单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,染色体数为120条;用ELISA法检测分泌的抗体滴度在1:1,000～100,000,经检测均为IgG类抗体,3株为IgG_1,4株为IgG_3,其中2株对布鲁氏菌与结肠炎耶尔森氏菌O:9株有一定鉴别意义;对进一步研究布鲁氏菌McAb的理化性质和生物学特性及其应用提供了试剂。     

Rapid isolation and detection of Escherichia coli O157:H7 by use of rainbow agar O157 and PCR assay

This study has evaluated the use of a commercially available Rainbow agar O157 and polymerase chain reaction (PCR) assays for the detection of Shiga-like toxin producing Escherichia coli and to serotype E. coli O157:H7 from raw meat. The Rainbow agar O157 was found to be selective and sensitive for the screening of the E. coli O157 from artificially and naturally contaminated meat samples. Shiga-like toxin producing E. coli were identified with two primer pairs that amplified fragments of the SLT-I (384 bp) and SLT-II (584 bp). E. coli O157:H7 was serotyped with a primer pair specified for the H7 flagellar gene, which amplify specific DNA fragments (625 bp) from all E. coli O157:H7 strains. The use of Rainbow agar O157 described allows for the presumptive isolation of E. coli O157 in 24 hours. Identification and confirmation of the presumptive isolates as E. coli O157:H7 by PCR assays require additional 6-8 hours. The above-mentioned screening and identification procedures should prove to be a very useful method since it allows for the specific detection of E. coli O157:H7.