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1.
目的 观察恢复K562细胞的p53蛋白功能后该细胞的生物学行为的改变,探索用野生型p53基因治疗白血病的可能性。方法 以K562细胞为研究对象,电穿孔法转导野生型p53基因,RT-PCR和免疫细胞化学方法检测p53基因的表达,^3H-TdR掺入法检测细胞增殖,用流式细胞仪分别以TUNEL、annexin-V、细胞周期检测细胞的凋亡情况和细胞周期分布情况。结果 转染p53基因的K562细胞,出现明显细胞周期G1期停滞,增殖抑制率为24.17%,但用TUNEL、annexin-V和亚二倍体峰检测未发现与未转染p53基因组有凋亡细胞比例差异。结论 P53基因对K562细胞有一定的治疗效应,但不能诱导其发生凋亡。 相似文献
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钙调素 (calmodulin ,CaM )是普遍存在于真核细胞内的Ca2 受体蛋白 ,是细胞内信号传导系统的重要成分 ,可缩短细胞周期 ,促进细胞增殖。近年来发现CaM也存在于细胞外 ,细胞外CaM能促进K5 6 2细胞、Burkitt细胞的增殖[1,2 ] 。本课题用抗CaM抗体 (RACaM )及纯化的重组人钙调素 (rhCaM )进行的研究结果初步表明 ,抗CaM抗体可抑制K5 6 2细胞增殖。1 材料和方法1 1 细胞及试剂 K5 6 2细胞 (本中心保存 ) ;MTT (Sigma ) ;N 羟基琥珀酰亚胺基 3 (2 吡啶二硫 ) 丙酸酯 (SPDP ,… 相似文献
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目的探索人锌指转录因子Krüppel样因子4(KLF4)过表达对人慢性髓系白血病细胞K562增殖及迁移能力的影响。方法设稳定过表达KLF4的白血病K562细胞系作为实验组(命名为K562-KLF4细胞),空白K562细胞及空质粒转染的K562细胞(命名为K562-C1细胞)作为对照组。实时荧光定量PCR检测各组细胞KLF4mRNA的表达含量;Western blot检测各组细胞KLF4的蛋白相对表达含量;MTS法检测各组细胞的增殖水平;Transwell检测各组细胞的迁移能力。结果 K562-KLF4细胞KLF4 mRNA的相对表达量比2个对照组明显增高(P0.05);与对照组相比,K562-KLF4细胞KLF4蛋白相对表达含量明显增加(P0.05),其过表达率为77.78%;K562-KLF4细胞增殖和迁移能力明显被抑制(P0.05)。结论 KLF4过表达能抑制K562细胞的增殖及迁移能力。 相似文献
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为肿瘤过继免疫治疗开发体外激活T细胞、NK细胞的高效途径,研究双表达外源性4-1BBL和IL-15的K562细胞刺激外周血淋巴细胞活化的能力。采用分子克隆技术,分别将4-1BBL和IL-15基因插入双表达载体pVITRO-2,命名为pV4-1BBL-IL-15。经测序鉴定后,利用脂质体介导的转染及潮霉素筛选,获得稳定双表达4-1BBL、IL-15分子的K562细胞(K562/4-1BBL/IL-15)。经流式细胞仪(FACS)分选后,K562/4-1BBL/IL15细胞和K562细胞分别用丝裂霉素C处理,与外周血淋巴细胞孵育24 h,FACS检测淋巴细胞表面活化性受体CD69的表达。对NK细胞不仅同时检测活化性受体NKG2D的表达,还用乳酸脱氢酶释放法观察NK细胞受不同刺激细胞作用后,细胞毒活性的变化。结果显示受K562/4-1BBL/IL15细胞刺激后,T细胞CD69的表达无明显变化。γδT细胞CD69表达增长5倍。NK细胞CD69表达增长6倍,而NKG2D的表达增加1.5倍;NK细胞受K562/4-1BBL/IL15细胞作用72 h后,细胞毒活性明显提高。提示双表达4-1BBL/IL-15的K562细胞能够高效激活γδT细胞及NK细胞,有望用于肿瘤的过继免疫治疗。 相似文献
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目的 通过构建靶向同源盒A10(HOXA10)的真核表达载体,探讨利用RNA干扰沉默HOXA10基因对人慢性髓系白血病细胞株K562增殖和凋亡的影响.方法 根据筛选的针对HOXA10的特异性有效小干扰RNA(siRNA)序列设计合成短发夹RNA(shRNA)寡核苷酸链,构建pGPHI-GFP-Neo-HOXA10真核表达载体并测序,应用阳离子脂质体转染K562细胞.实验分为细胞对照组(仅加等量细胞及培养基),阴性对照组(脂质体转染阴性对照质粒)、实验组(脂质体转染pGPHI-GFP-Neo-HOXA10).转染载体24 h后利用RT-PCR检测各组HOXA10 mRNA表达;转染载体24、48、72 h后应用MTT法检测各组细胞增殖并计算细胞抑制率;转染载体48 h后应用流式细胞术检测各组细胞凋亡.结果 成功构建pGPHI-GFP-Neo-HOXA10载体并转染K562细胞.与细胞对照组和阴性对照组比较,实验组转染载体能有效降低HOXA10 mRNA的表达水平[(38.86±4.49)%比(88.52±9.24)%、(86.75±7.38)%,P<0.05],而阴性对照组与细胞对照组比较差异则无统计学意义(P>0.05).与阴性对照组比较,实验组载体作用于K562细胞24、48、72 h后,细胞增殖能力均明显下降,细胞抑制率明显升高[(39.92±0.74)%比(7.98±5.52)%;(55.62±1.18)%比(8.27±3.45)%;(66.30±1.26)%比(8.63±3.58)%;均P<0.05].实验组细胞凋亡率较细胞对照组、阴性对照组也显著升高[(22.29±1.67)%比(9.82±0.69)%、(10.14±0.96)%,P<0.05],而阴性对照组与细胞对照组比较差异则没有统计学意义(P>0.05).结论 构建的真核表达载体pGPHI-GFP-Neo-HOXA10可有效沉默K562细胞中HOXA10基因的表达,能明显抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡. 相似文献
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目的:试图用计算机设计并筛选出血管内皮生长因子(VEGF)的高效反义核酸;用实验方法研究VEGF反义核酸对K562细胞增殖的影响。方法:用RNAstructure(version3.7)软件,选择总自由能(overall△G37)相对低的反义核酸,共计7条,长度18-20核苷酸,全硫代修饰;细胞培养72h,采用台盼蓝拒染法观察存活细胞,用ELISA法检测培养液中VEGF蛋白水平,分析反义核酸对K562细胞的作用。结果:筛选出6条反义药物对K562细胞生长有明显抑制作用,均优于阳性对照组(X2)。与随机对照组(X1)相比,最优序列X7组细胞生长抑制率达31.9%、培养液中VEGF蛋白表达抑制率达51.4%,overall△G37与反义药物活性密切相关(r=0.887,P<0.01)。结论:计算机辅助设计有助于获得更好反义药物,VEGF反义药物可抑制K562细胞生长及VEGF蛋白表达,内源性VEGF蛋白具有促进K562细胞增殖的功能。 相似文献
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用选择性多步抽提法配合普通细胞化学、免疫细胞化学、整装电镜及SDS-PAGE、Western印迹方法研究了人红白血病K562细胞内中间纤维的分布及性质。结果表明,K562细胞胞质内含有放射状分布的中间纤维,其性质为分子量55kd的波形蛋白。 相似文献
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亚急性重型肝炎患者TNF-α和IL-1表达及IL-4对其的调控 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:分析IL-4对亚急性重型肝炎(亚重肝)患者外周血单个核细胞(PBMCS)TNF-α和IL-1的调控作用,评价IL-4在亚重肝治疗中的潜在价值。方法:应用细胞生物学、免疫组化和RT-PCR等方面测定PBMCS TNF-α、IL-1的表达。结果:亚重肝患者PBMCS TNF-α、IL-1表达水平均较正常人显著增高血糖素含量和虽然IL-4 MRNA及蛋白质的表达与正常人比较一差异无但IL-4 MR 相似文献
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逆转录病毒载体介导的IL-4基因修饰对HL-60细胞增殖及T细胞功能的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
目的观察IL-4基因转染对HL-60增殖及T细胞功能的影响及其可能机制。方法采用逆转录病毒载体介导基因转染法将人IL-4基因导入髓系白血病细胞HL-60,观察高表达外源性IL-4基因HL-60株的增殖反应及其诱导的正常人PBMC增殖,IL-2、IL-6、IFN-γ基因表达及肿瘤特异性CTL杀伤活性。结果rIL-4或瘤细胞产生的IL-4早期促进HL-60细胞增殖,培养5天后则明显抑制其增殖;与rIL-4处理的HL-60细胞比较,IL-4基因修饰的HL-60细胞明显促进正常人PBMC增殖并合成IL-2、IL-6及IFN-γmRNA,其诱导的特异性CTL杀伤活性明显高于野生型HL-60、仅导入载体的HL-60和加入rIL-4共育的HL-60细胞诱导者。结论IL-4基因转染在影响HL-60细胞增殖和分化过程的同时,可能促进某些抗原(如MHCⅠ类抗原)的抗原性,从而有利于机体建立有效的抗肿瘤免疫反应。 相似文献
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目的 构建一种靶向MR-1基因的shRNA稳定表达载体,并检验其对白血病K562细胞增殖能力的影响.方法 以带有H1启动子可稳定表达靶基因shRNA的pCD-shRNA为载体,采用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pCD-shRNA并回收线性空载体,采用T4 DNA连接酶将MR-1shRNA模板DNA双链与酶切后线性化的载体连接,从而建立稳定表达MR-1-shRNA的载体.将构建的pCD-shRNA-MR-1载体转染人白血病K562细胞,建立稳定沉默MR-1的细胞系,采用细胞计数法和westem blot对MR-1沉默后细胞的增殖能力和信号通路进行检测分析.结果 成功构建了可稳定表达MR-1-shRNA的载体pCD-shRNA-MR-1,经酶切鉴定及基因测序测定,结果表明载体中的MR-1-shRNA与设计序列完全相符,目的基因序列准确无误.将pCD-shRNA-MR-1转染白血病K562细胞,建立了两株稳定沉默MR-1的K562/MR-1细胞株.细胞增殖实验表明,MR-1稳定沉默细胞的增殖能力显著降低;细胞信号通路结果表明,MR-1稳定沉默细胞Jak2和Bcr-Abl的磷酸化水平降低.结论 利用pCD-shRNA质粒构建了一个可表达MR-1-shRNA的表达载体,该载体转染K562细胞后引起细胞增殖能力降低.研究表明MR-1基因在肿瘤细胞增殖过程具有促增殖作用,其机制是降低Jak2和Bcr-Abl的磷酸化水平. 相似文献
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应用siRNA抑制K562细胞中c-Myc基因的表达 总被引:5,自引:1,他引:4
目的利用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制白血病细胞系K562细胞中c鄄Myc基因的表达,为研究c鄄Myc基因在K562细胞中的作用提供一个新的方法。方法设计c鄄Myc基因特异性小分子干扰RNA,用体外转录方法合成c鄄Myc基因的小分子干扰RNA并转染K562细胞,培养48h后,收集细胞,应用实时荧光定量RT鄄PCR和westernblot方法检测转染细胞中c鄄Myc基因mRNA水平和蛋白表达量的变化,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性。结果转染siRNA后,与对照组相比,实验组c鄄MycmRNA水平和蛋白表达量明显降低,抑制率分别为82.16%和74.0%,MTT法表明实验组的增殖速率明显低于对照组的增殖速率。结论在K562细胞中存在RNA干扰的机制,特异性siRNA能够有效的抑制c鄄Myc基因的表达,为研究c鄄Myc基因在肿瘤细胞中的调节途径提供了一个新的方法。 相似文献
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目的探讨不同序列的反义寡核苷酸对哮喘大鼠CD4+T细胞IL-4表达的抑制作用.方法采用脂质体转染技术,将不同的反义寡核苷酸(AS-1反外显子-1;AS-2反外显子-2;AS-3反翻译终止部位)和空白对照分别转入经免疫磁珠阴性分离的哮喘大鼠CD4+T淋巴细胞,细胞培养28小时后,用ELISA和半定量RT-PCR分别检测细胞培养上清IL-4和细胞内IL-4 mRNA的水平.结果不同组RT-PCR结果(IL-4/β-actin相对吸光度)AS-1、AS-2、 AS-3及空白组分别为0.261 5±0.147 6、0.288 5±0.141 1、1.101 2±0.364 1及1.206 8±0.383 6(F=22.597,P<0.01).ELISA检测培养上清液IL-4结果AS-1、AS-2、 AS-3及空白组分别为13.800±7.233、15.329±7.358、52.643±12.075及58.286±14.100(F=34.976,P<0.01).经AS1、2干预后细胞内IL-4mRNA和细胞培养上清IL-4的水平均较AS-3和空白组干预后 IL-4的水平低(P<0.01).结论IL-4反义寡核苷酸能够抑制哮喘大鼠CD4+T淋巴细胞IL-4和IL-4mRNA表达;不同序列IL-4反义寡核苷酸抑制作用存在差异. 相似文献
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目的 构建高表达人CXCR4蛋白的白血病细胞系并测定CXCR4基因对其侵袭转移能力的影响.方法 从外周血淋巴细胞中提取基因组RNA,用RT-PCR扩展编码CXCR4基因片段,将CXCR4基因定向克隆到含有双启动子的真核表达载体PBudCFA.1,采用酶切和序列测定方法鉴定.将所构建的重组质粒用脂质体2000转染K562细胞,Zeoein筛选阳性克隆.流式细胞术和RT-PCR对阳性克隆进行鉴定;用Transwell板检测转染与未转染CXCR4的K562细胞对趋化因子SDF-1趋化活性.结果 成功构建编码CXCR4基因的真核表达质粒PBudCE4.1/CXCR4.经转染入K562细胞,筛选获得能稳定高表达人CXCR4蛋白的K562/CXCR4细胞;K562/CXCR4细胞对SDF-1的趋化能力较K562细胞明显增强.结论 成功构建了转染人CXCR4基因的白血病细胞系,为进一步研究白血病细胞髓外浸润的分子机制奠定基础. 相似文献
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IL-4和IL-4受体基因多态性与成人变应性哮喘的关系 总被引:3,自引:0,他引:3
目的 研究白细胞介素 4 (IL 4 )、IL 4受体α链的 2个基因多态性位点与中国成人变应性哮喘的关系。方法 采用病例对照方法 ,用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性方法 (PCR RFLP)对IL 4启动子区C - 5 89T和IL 4Rα链Q5 76R进行基因分型。结果 IL 4C - 5 89T与中国成人变应性哮喘无关 ,然而 ,变应性哮喘组IL 4Rα链 5 76R R频率显著性高于对照组 (χ2 =9.36 9,P <0 .0 1;OR =3.797) ,且与血浆高IgE相关。结论 IL 4Rα链 5 76R R基因型是中国成人变应性哮喘的基因危险因子 相似文献
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Cytokine-specific ELISPOT assay single cell analysis of IL-2, IL-4 and IL-6 producing cells 总被引:17,自引:0,他引:17
Kohtaro Fujihashi Jerry R. McGhee Kenneth W. Beagley David T. McPherson Sylvia A. McPherson Chun-Ming Huang Hiroshi Kiyono 《Journal of immunological methods》1993,160(2):181-189
In order to assess cytokine-producing cells at the single cell level, the cytokine-specific ELISPOT assay has proven to be an important and sensitive method. The purpose of this study was to adapt this method to elucidate individual cells producing murine IL-2, IL-4 or IL-6. In order to establish these cytokine-specific ELISPOT assays, IL-2-, IL-4- and IL-6-specific cDNA transfected myeloma cell lines, e.g., X63-Ag8-653 X2, X63-Ag8-653 X4 and X63-Ag8-653 X6, respectively, were used as specific cytokine-producing cells. In the IL-2 ELISPOT assay, the coating reagent, monoclonal antibody (mAb) rat IgG2a anti-mouse IL-2 (CR #40014) was used while rabbit IgG polyclonal anti-mouse IL-2 was employed for detection of IL-2 spot forming cells (SFC). The mAbs anti-mouse IL-4, BVD4-1D11 and BVD6-24G2 were selected as capture and detection antibodies for enumeration of IL-4 SFC. For the IL-6 ELISPOT assay, anti-mouse IL-6 (MP5-20F3) mAb was used for coating and MP5-32C11 mAb was used for detection of IL-6 SFC. When IL-2 producing X63-Ag8-653 X2 cells were subjected to these three different ELISPOT assays, IL-2-specific SFC were only noted with the IL-2 ELISPOT system. In the case of IL-4 SFC, only X63-Ag8-653 X4 cells formed specific spots using the tandem of BVD4-1D11 and BVD6-24G2 mAbs. IL-6-specific spots developed in MP5-20F3 mAb pre-coated wells containing X63-Ag8-653 X6 cells, when developed with mAb anti-IL-6 (MP5-32C11). Addition of cycloheximide (50 μg/ml) inhibited formation of IL-2, IL-4 and IL-6 SFC by approximately 90%. When an unrelated mAb was used as detection antibody in these three different cytokine-specific ELISPOT assays, IL-2-, IL-4-and IL-6-specific SFC were not detected. Further, when concanavalin A stimulated T cells from Peyer's patch of normal mice were subjected to the respective cytokine-specific ELISPOT assay, IL-2, IL-4 and IL-6 SFC were enumerated. These results have shown that cytokine-specific IL-2, IL-4 and IL-6 ELISPOT assays have now been established and will allow analysis of the frequency of cytokine-secreting cells at the single cell level. 相似文献
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Ethanol addition to B lymphocytes in vitro inhibits antigen-induced antibody secretion and antigen-induced cell proliferation. We tested the hypothesis that ethanol can inhibit the effect of interleukins on B-cell proliferation by adding ethanol to in vitro functional assays for IL-2 and IL-4. Ethanol does not inhibit IL-2-induced B-cell differentiation, but it does inhibit IL-4-induced B-cell proliferation and IL-4-induced Ig class switching. 相似文献