单纯疱疹病毒Ⅰ型在角膜潜伏感染的研究

眼部感染HSV-1后,在支配该区域的三叉神经节(TG)中建立潜伏感染的理论已被公认,但HSV-1在眼部潜伏感染的确切机理仍不十分清楚。近年众多的研究表明,HSV-1除了在TG潜伏感染外,角膜组织本身也极可能是另一个潜伏感染地。随着组织器官培养和病毒分离技术的提高、DNA探针的应用,为角膜潜伏感染的研究提供了新的、有效的方法,这对全面揭示HSV-1在眼的潜伏感染机制又迈进了一步,将为临床上HSK的治疗提供新的治疗方法和理论依据。     

复发性单疱病毒性角膜炎实验模型的研究

目的：建立一种可靠、实用的复发性单疱病毒性角膜炎（HSK）的实验模型。方法：用单纯病毒I型（HSV－1）Mckrae株行NIH鼠的角膜接种,用人的抗HSV－1血清行鼠的腹腔内注射,使病毒在三叉神经节或角膜内建立起潜伏感染。用紫外线B光照射鼠的角膜,诱导HSK复发。观察诱导HSK复发的成功率、复发性HSK的临床特征、组织学特点。结果：紫外线照射诱导鼠HSK复发的成功率为72．5％,复发性HSK主要表现为基质型角膜炎,组织切片见角膜基质层内有大量的淋巴细胞和一些中性粒细胞浸润。     

单纯疱疹病毒性角膜炎小鼠模型的建立及鉴定

目的：探讨建立不同感染时期HSK小鼠动物模型,为HSK的深入研究建立基础。方法：Balb/c小鼠125只麻醉后在显微镜下用刀片背面尖端于角膜＂#＂字划痕,其中100只小鼠接种HSV-Ⅰ病毒,另25只小鼠不接种病毒作为正常对照组。术后每天用10g/L荧光素钠染色后裂隙灯显微镜下观察角膜病变发生情况,并取角膜表面泪液进行HEK293T细胞检测以确定裂隙灯显微镜下有无病毒复制。对潜伏感染期小鼠模型采用紫外线B光照射以诱导HSK复发。结果：接种HSV-Ⅰ病毒的小鼠模型眼于接种后3d内全部出现急性上皮性角膜炎表现。经阿昔洛韦滴眼液治疗1wk后角膜炎症消失,但角膜和三叉神经节中PCR检测病毒仍为阳性。潜伏感染期小鼠模型经紫外线B光照射后也都在1wk内复发,并表现为以基质型角膜炎为主要临床表现的角膜病变。结论：采用角膜划痕法对Balb/c小鼠接种HSV-Ⅰ病毒和紫外线B光照射可以成功地制作出原发感染期、潜伏感染期和复发感染期等不同感染时期的HSK模型,而且操作相对简单、方便易行。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型潜伏感染和复发的分子机制研究进展

单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV－1）引起的单纯疱疹性角膜炎（HSK），是角膜病中的主要致盲原因。因潜伏感染和反复发作而致盲。HSV－1可引起急性感染和潜伏感染。在潜伏期间HSV－1的基因表达和物理状态与在急性感染期间均不相同。在三叉神经节和角膜中发现病毒的基因组和特异的RNA转录，提示角膜中潜伏的HSV－1可能是复发的另一来源。复发是病毒可从港代感染状态激活后再进入溶细胞性感染或基因表达状态。潜伏感染时立刻早期（IE）基因停止转录。有观点认为IE基因转录可启动联级反应导致复发，另有观点认为是一系列的反应着积所致。彻底阐明HSV－1的潜伏和复发机制，是找到防止HSK反复发作而致盲的关键。     

单纯疱疹病毒性角膜炎动物模型制备

单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis,HSK)是由单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpessimplex virus type Ⅰ,HSV-1)感染引起的具有高复发率、高致盲率及难根治性特点的疾病,可导致角膜溶解、新生血管形成及溃疡穿孔,是目前角膜病中最常见的致盲眼病之一.本文参考目前国内外实验研究时使用的各种HSK动物模型建模方法来进行综述,如建立原发感染模型的划痕法、环钻法、外植体培养法以及潜伏感染模型和诱导复发模型的建立方法.力求探索如何建立一种可靠的HSK动物模型,在为研究人类HSK发病机制、药物治疗和对比以及角膜移植等方面均有重要意义.     

正常角膜上皮细胞单纯疱疹病毒I型的检测

单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV)在眼部感染主要为HSV-Ⅰ型，其最主要的生物学科特性是能够形成潜伏感染，目前已公认HSV-Ⅰ可以潜伏在静止期单纯疱疹病毒性角膜炎（herpes simplex keratitis,HSK）角膜组织中。针对正常角膜内是否有HSV-Ⅰ的存在，近几的国内外学者采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）检测到正常角膜内存有HSV-Ⅰ DNA。     

单纯疱疹性角膜炎发病机制的研究进展

单纯疱疹性角膜炎(HSK)是一种全球高发的严重感染性致盲眼病,视力的慢性损害常与感染的复发、角膜瘢痕、角膜白斑、新生血管以及新生淋巴管等相关.根据目前的研究,角膜的损伤是免疫系统对单纯疱疹病毒(HSV)抗原反应的结果.由于HSK发病机制尚不明确,治疗效果不满意,因此全面了解其初次感染、潜伏、复发的机制是有效治疗的前提.本文分别阐述自噬、免疫系统、细胞因子和微小RNA等几个方面在HSK感染与发病中的作用机制,以了解HSK的发生和发展过程,在一定程度上为HSK的诊断提供参考,并为HSK的治疗及药物研制等研究带来新的启发.     

用原位杂交法检测单纯疱疹病毒Ⅰ型在潜伏感染时的少量潜伏相关转录本表达

目的探讨单纯疱疹病毒Ⅰ型在三叉神经节内潜伏感染时的基因表达。方法以 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠制备单纯疮疹性角膜炎,种毒后３６天取三叉神经节和角膜,用免疫组化法检测病毒的抗原表达。制备ｃＲＮＡ探针,用原位杂交法检测 ｍ－ＬＡＴ的表达。结果种毒后３６天,免疫组化结果为阴性,原位杂交结果为阳性。结论 ＨＳＶ－１在三叉神经节内潜伏感染时基因的转录并未静止,有ｍ－ＬＡＴ基因的表达。     

用原位杂交法检测单纯疱疹病毒Ⅰ型在潜伏感染时的少量潜伏相关 …

目的 探讨单纯疱疹病毒Ⅰ型在三叉神经节内潜伏感染时的基因表达。方法 以ＢＡＬＢ／ｃ小鼠制备单纯疱疹性角膜炎,种毒后３６天取三叉神经节和角膜,用免疫组化法检测病毒的抗原表达。制备ｃＲＮＡ探针,用原位杂交法检测ｍ－ＬＡＴ的表达。结果 种毒后３６天,免疫组化结果为阴性,原位杂交结果为阳性。结论 ＨＳＶ－１在三叉神经节内潜伏感染时基因的转录并未静止,有ｍ－ＬＡＴ基因的表达。     

rhIL—2治疗单疱病毒性角膜炎实验研究

目的:应用人重组白细胞介素(rhIL—2)配合常规药物治疗兔单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)预防复发。方法:给兔接种HSV前十天应用rhIL-2提高免疫功能治疗,待形成HSK后配合常规药物治疗,同时设对照组。应用PCR技术检测观察兔感染HSV体内动态变化,依据HSK诊断标准观察其疗效。结果:实验组与对照组相比有延长潜伏感染期、发病轻、病程短恢复快效果,HSV在三叉神经节潜伏率低。结论:应用rhIL-2能治疗兔HSK和预防复发效果,无不良反应。     

单纯疱疹病毒性角膜炎的发病机制

单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis,HSK)是一种常见的眼部疾病,由单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)感染引起。人群中超过90%的人曾经感染过HSV。HSV可以在神经组织及角膜组织长期潜伏。在适宜的刺激下,如紫外线照射、发热、精神压力、高温、低温、手术等,病毒活化增殖导致HSK。HSV感染引起的免疫反应是造成角膜组织损害的主要机制。HSK的免疫反应主要是由CD4+细胞介导的,而CD8+细胞对病毒感染具有保护作用。     

疫苗免疫接种预防单纯疱疹病毒潜伏感染的实验研究进展

单纯疱疹病毒(Herpes simplex Virus 以下简称 HSV)最常侵犯起源于外胚层的组织,如皮肤、粘膜、眼和神经系统,而角膜的感染首当其冲。半个多世纪前,Goodpas-ture 提出角膜感染 HSV 后能在三叉神经节建立潜伏感染,这一论断直到70年代经 Stevens等人的动物实验和 Baringer 等从人尸三叉神经节分离病毒成功而得到证实。感觉神     

可溶性B、T淋巴细胞衰减因子及其配体在单纯疱疹性角膜基质炎小鼠体内的异常表达

目的 研究B、T淋巴细胞衰减因子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)及其配体疱疹病毒侵入介体(herpes virus entry mediator,HVEM)在单纯疱疹性角膜基质炎(herpetic stromal keratitis,HSK)小鼠角膜组织中及外周血CD4+T细胞上的表达水平,探讨共抑制信号BTLA-HVEM是否参与了CD4+T细胞介导的HSK免疫病理反应.方法 将106 PFU的单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)KOS毒株接种于BALB/c鼠的角膜上建立HSK动物模型,分别于角膜接种病毒前(0 d),接种病毒后的第3、7、10、14、21天,用毛细管取小鼠的左眼眼眶静脉窦血1 mL,分离淋巴细胞,行荧光抗体染色,用流式细胞仪检测CD3+ CD4+ BTLA+T细胞和CD3+ CD4+ HVEM+T细胞阳性率;在裂隙灯显微镜下观察小鼠角膜变化;免疫组织化学方法检测BTLA蛋白及HVEM蛋白在角膜组织中的表达.结果 BALB/c鼠的角膜接种HSV-1后的1～5d,角膜擦拭液中均检测出HSV-1复制,表明小鼠感染了单纯疱疹病毒.裂隙灯显微镜观察显示:角膜接种HSV-1后第3天,所有小鼠均患了急性上皮性角膜炎,并于感染后1周内痊愈,自病毒接种后第8天起,小鼠出现角膜基质炎的改变,表现为角膜基质呈灰白色混浊,角膜基质混浊于病毒接种后的第10天达到高峰,持续至第14天后逐渐减轻.流式细胞仪检测显示,小鼠外周血淋巴细胞中CD3+CD4+BTLA+T细胞和CD3+ CD4+ HVEM+T细胞的阳性率,在角膜接种病毒前(0 d)分别为(3.15±0.60)％和(9.84±1.06)％,在角膜接种病毒后第10天(HSK疾病程度最严重时)分别增加到(20.47±3.15)％和(45.18±3.90)％(与0d相比差异均有显著统计学意义,均为P＜0.01).免疫组织化学方法检查HSK小鼠角膜组织中BTLA和HVEM的蛋白表达结果一致:HSK临床表现最严重时,即病毒接种后第10天时,BTLA蛋白和HVEM蛋白在角膜组织中表达最强,主要表达于角膜基质层内浸润的炎性细胞上,角膜上皮层和内皮层也有表达.结论 在HSK小鼠模型中,BTLA及其配体HVEM蛋白在角膜组织中及外周血CD4+T细胞上表达明显增强,共抑制信号BTLA-HVEM参与了CD4+T细胞介导的HSK的免疫病理过程.     

单纯疱疹病毒Ⅰ型潜伏感染的研究——兔三叉神经节致敏T淋巴细胞检测研究

报告应用抗兔致敏T淋巴细胞的单克隆抗体和ABC免疫组织化学技术对22只实验性单纯疱疹病毒性角膜炎的家兔三叉神经节致敏T淋巴细胞检测的结果，首次揭示在角膜原发感染HSV-I过程中三叉神经节内致敏T淋巴细胞的出现。致敏T淋巴细胞在角膜接种后第13天出现。第85天消失，结果表明：T淋巴细胞在TG内HSV-I潜伏感染的建立过程中起重要作用。本研究对指导临床治疗提供了理论依据。     

贝伐单抗对小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎角膜新生血管和瘢痕形成的抑制作用

背景 单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)可诱导发生角膜新生血管和炎症反应,传统的治疗药物为阿昔洛韦(ACV),研究已证实贝伐单抗具有抑制新生血管的作用,但其是否对HSK发挥治疗作用值得研究. 目的 研究贝伐单抗对小鼠HSK角膜瘢痕和新生血管的抑制作用.方法 利用体外培养并感染的Vero细胞生产单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1),以无血清DMEM培养基于冰上对HSV-1进行10倍梯度稀释后制备成HSV-1液.选用SPF级雄性6～8周龄C57 BL/6小鼠200只,用0.6μl滴度为l×l0 7空斑形成单位(PUF)/ml的HSV-1行小鼠角膜基质注射以制备HSK模型,将模型眼分为单纯ACV注射组、ACV+贝伐单抗注射组和生理盐水注射组,按照分组分别于感染后5、8、11和14d选择角膜混浊评分为1分的模型眼结膜下注射50μg ACV、50 μg ACV+5 μl贝伐单抗和5μl生理盐水.此外采用紫外线照射均有轻度新生血管和瘢痕的6只模型小鼠双眼诱导HSK复发,于复发后0、2、4和6d行5μl贝伐单抗(25 mg/ml)右眼结膜下注射,左眼结膜下注射5 μl生理盐水.于造模后5、7、11、14和17d以及复发的0、2、4和6d行小鼠角膜裂隙灯显微镜检查并用角膜知觉测量仪行中央角膜敏感度检测;制备角膜铺片,采用免疫荧光检测法检测角膜中CD31和βⅢTubulin荧光表达以评估角膜新生血管和角膜神经纤维分布;采用Image J软件测定角膜新生血管面积和瘢痕面积. 结果 HSK成模率达80％以上,造模后7d和复发后2d角膜混浊最重,造模后15 d和复发后2d角膜新生血管面积最大.造模后模型眼中央角膜敏感度逐渐降低,于造模后9d下降到最低.ACV+贝伐单抗注射组角膜病变面积小于单纯ACV注射组,ACV+贝伐单抗注射组小鼠中央角膜敏感度为5.50±0.71,明显高于生理盐水注射组的0.50±1.41,差异有统计学意义(Z=-2.397,P=0.029).ACV+贝伐单抗注射组小鼠角膜病变面积增长率为(167.10±52.53)％,低于生理盐水注射组的(312.30±74.18)％,差异有统计学意义(Z=-1.992,P=0.046).实时荧光定量PCR显示造模后7d,模型眼角膜及同侧三叉神经节(TG)中胸苷激酶(TK)和感染细胞蛋白-27(ICP-27) mRNA相对表达量均较高,造模后45 d明显下降,诱导复发后2d TKmRNA和ICP-27 mRNA均再次升高,复发后7d表达量降至最低.造模后45 d同侧TG中均可见LAT mRNA表达量达峰值,诱导复发后2d相对表达量下降,复发后7d相对表达量再次升高,差异均有统计学意义(均P＜0.01).角膜铺片结果显示,造模后生理盐水注射组小鼠较正常对照小鼠角膜新生血管明显增加,角膜神经纤维明显减少,单纯ACV注射组和ACV+贝伐单抗注射组小鼠角膜新生血管少于生理盐水注射组,ACV+贝伐单抗注射组小鼠角膜神经纤维较生理盐水组注射组和单纯ACV注射组均增加.结论 贝伐单抗结膜下注射可抑制HSK模型小鼠角膜新生血管生成和瘢痕形成,与ACV联合应用时二者有协同作用.     

转录因子T-bet在单纯疱疹病毒感染小鼠外周血中的表达

目的研究单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes si mplex virus type1,HSV-1)感染小鼠眼球以后转录因子T-bet在小鼠外周血中的表达,探讨T-bet的表达与单纯疱疹性角膜基质炎之间的关系。方法将106空斑单位(plague forming unit,PFU)·L-1的HSV-1Mckrae毒株接种于BALB/c鼠的角膜上建立单纯疱疹性角膜基质炎(herpetic stromal keratitis,HSK)动物模型,分别于角膜接种病毒后的第1d、3d、7d、10d、14d、21d及28d,用毛细管取小鼠的左眼眼眶静脉窦血1mL,提取淋巴细胞,用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测T-bet mRNA的表达水平;在裂隙灯显微镜下观察小鼠角膜的临床变化,组织学检查角膜的病理改变;用ELISA法检测T-bet蛋白在角膜组织中的表达水平。结果BALB/c鼠的角膜接种HSV-1后的1~5d,角膜擦拭液中均检测出HSV-1复制,表明小鼠感染了单纯疱疹病毒;裂隙灯显微镜观察:HSV-1感染鼠的角膜后,小鼠均患了急性角膜上皮炎,并于感染后1周内痊愈。其中81.7%(49/60)的小鼠自感染病毒后第10d起开始出现角膜基质炎改变,表现为灶状角膜基质混浊,局部角膜新生血管化,角膜基质内大量的炎性细胞浸润。角膜基质混浊逐渐进展,在病毒感染后的第14~21d达到高峰。RT-PCR检测的数据显示:未感染HSV-1的对照组小鼠的外周血中不表达T-bet mRNA;HSV-1感染小鼠的早期即可诱导T-bet mRNA在小鼠外周血中的表达,并且表达持续存在;T-bet mRNA表达的高峰时间(10~28d),位于角膜基质炎发生和发展的过程中。ELISA法检测角膜提取物中的T-bet蛋白显示了相似的结果。结论HSV-1上调T-bet mRNA在小鼠外周血中的表达;T-bet的表达与角膜基质炎的发生和发展密切相关。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型在兔角膜内潜伏和活化的实验研究

在健康新西兰兔角膜上建立HSK模型，待其病变稳定期，一组行自体穿透性角膜移植，另一组与未感染HSV-1的兔角膜行交叉穿透移植，拆线后行肾上腺素离子透入拟使潜伏病毒活化。离子透人后的植片抗原检测均为阳性，透射电镜检查显示病毒感染征象，植片角膜基质细胞培养发生HSV—1自发感染。实验结果显示角膜组织是HSV—1的另一个潜伏感染处和复发源地。     

人三叉神经节细胞体外培养及对HSV—1感染敏感性的实验研究

首次报告了人三叉神经节Trigeminal Ganglian(TG)三种原代培养细胞在体外对单纯疱疹病毒1型(HSV-1)Mckrae株感染后的不同时相的敏感性实验研究。结果表明人TG中的神经节细胞对HSV-1感染最敏感,HSV—1抗原可以在其胞浆及胞核中迅速出现。成纤维细胞和胶质细胞也有部分感染现象。这种结果提示TG中的神经节细胞很可能是HSV-1主要的潜伏感染细胞。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型潜伏感染的研究：兔角膜HSV—1抗原的检测

通过使用HSV-1 Mckrae株在角膜上建立HSK感染的动物模型,应用辣根过氧化物酶免疫组织化学染色技术检测HSV-1抗原在角膜组织内存在的时间,结果发现,在角膜病变消失后5、10、20、30、45天的角膜基质组织内均有HSV-1抗原存在,但在60、80天的切片上抗原阴性。表明HSV-1原发感染消失后抗原在角膜基质内存在45天后转为阴性。说明角膜基质细胞是对HSV-1感染的最敏感细胞。