高浓度葡萄糖条件下罗格列酮对NIT-1细胞FOXO1、TSC2基因表达及细胞分泌功能的影响

目的：研究罗格列酮在不同浓度葡萄糖条件下,对胰岛β细胞增殖凋亡与胰岛素分泌以及叉头转录因子-1(FOXO1)和结节性硬化症-2(TSC2)表达的影响。方法： 将 NIT-1细胞按每孔5×10个放置于24孔细胞培养板,培养48 h后随机分为各处理组：5.6、7.8、11.1、16.7、22.2 和27.6 mmol/L葡萄糖组,继续培养24 h后再分别施加1×10^-5mol/L罗格列酮,分别于干预24和48 h后取细胞培养上清液,采用放射免疫法检测胰岛素水平和免疫荧光法检测细胞增殖情况,RT-PCR半定量法检测FOXO1和TSC2 mRNA表达水平。结果：①1×10^-6～1×10^-5 mol/L罗格列酮可以分别在不同浓度葡萄糖培养条件下使胰岛NIT-1细胞增殖（P<0.05）,且这种变化趋势随剂量的增加而增加（即1×10^-5 mol/L罗格列酮组＞1×10^-6 mol/L罗格列酮组＞1×10^-7 mol/L罗格列酮组）。1×10^-5 mol/L的罗格列酮干预后,可见细胞凋亡百分率增加趋势随着葡萄糖浓度不断升高;②在同一浓度罗格列酮作用下,当葡萄糖浓度为11.1 mmol/L时,胰岛素分泌水平最高,高于其他各组（均P<0.05）,随着葡萄糖浓度增加,胰岛素分泌量逐渐下降（11.1 mmol/L葡萄糖组>16.7 mmol/L葡萄糖组>22.5 mmol/L葡萄糖组>27.6 mmol/L葡萄糖组）,而葡萄糖为5.6 mmol/L时,胰岛素分泌量最低;③ 在1×10^-5 mol/L罗格列酮干预后,FOXO1和TSC-2 mRNA的表达水平均较未干预组明显下降,且呈现出5.6 mmol/L组＜11.1 mmol/L组＜16.7 mmol/L组＜22.5 mmol/L组＜27.6 mmol/L组的变化趋势,而且葡萄糖浓度＞16.7 mmol/L的各组均较前面小剂量葡萄糖组（≤11.1 mmol/L各组）表达明显。结论：罗格列酮可以通过直接影响胰岛β细胞内FOXO1和TSC2表达促进胰岛β细胞的增殖及影响细胞胰岛素分泌功能,提示通过调控FOXO1和TSC2表达,可以直接影响胰岛β细胞的生物学功能,如分泌功能、细胞的增殖与凋亡以及改善胰岛素抵抗状况。     

罗格列酮对RIN-m细胞高糖损害干预作用研究

目的 研究罗格列酮(rosiglitazone,RSG)对胰岛β细胞高糖损害的干预作用.方法 采用生理浓度葡萄糖(5.5 mmol/L)、生理浓度葡萄糖 罗格列酮、高浓度葡萄糖(33.3 mmol/L)、高浓度葡萄糖 罗格列酮培养RIN-m细胞.以放射免疫法检测胰岛素分泌水平.以流式细胞仪及TUNEL法检测RIN-m细胞凋亡.RT-PCR方法 检测胰腺十二指肠同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox factor-1,PDX-1)和胰岛素mRNA表达.结果 ①RIN-m细胞与33.3 mmol/L的葡萄糖孵育2周后胰岛素分泌功能开始下降,细胞凋亡率增长2.7倍(P＜0.01).而罗格列酮可以修复胰岛素的分泌,降低RIN-m细胞凋亡率.②罗格列酮上调 PDX-1(1.30±0.06 vs. 1.61±0.10,P＜0.01)和胰岛素 (1.75±0.09 vs. 1.98±0.11,P＜0.01) mRNA表达.结论 高糖抑制胰岛β细胞胰岛素分泌,并诱导其凋亡.罗格列酮具有直接保护β细胞免于高糖毒性的作用.     

高浓度葡萄糖对胰岛细胞的IRS2表达及细胞凋亡的影响

目的 探讨高浓度葡萄糖条件下胰岛细胞胰岛素受体底物2(IRS2)和Bax基因表达和激活情况以及对诱导胰岛细胞凋亡的影响.方法 将小鼠胰腺进行分离纯化所得的胰岛细胞进行体外培养,按培养液里葡萄糖浓度不同分为G1组(5.6 mmol/L)、G2组(7.8 mmol/L)、G3组(11.1 mmol/L)、G4组(16.7 mmol/L)、G5组(22.2 mmol/L)及G6组(27.6mmol/L).细胞培养至72h后,采用放射免疫法检测各组胰岛细胞胰岛素分泌水平、免疫细胞组织化学法检测IRS2表达、免疫荧光法检测细胞Bax激活和细胞核Hoechst33342染色检测细胞凋亡情况.结果 当葡萄糖浓度在5.6～11.1 mmol/L时,胰岛素分泌水平升高,IRS2表达和Bax激活分别呈进行性增加,但此时细胞凋亡率无明显改变.随着葡萄糖浓度升高至超过16.7mmol/L时,IRS2表达逐渐减少,胰岛素分泌量明显降低,而Bax激活则逐渐增强,胰岛细胞凋亡率呈明显增加趋势.结论 高浓度葡萄糖可以导致胰岛细胞IRS2表达下降,胰岛素分泌量下降;同时Bax激活增强,胰岛细胞凋亡率也明显增加.说明IRS2表达下降与凋亡相关蛋白Bax激活及其胰岛细胞凋亡可能存在必然的联系,而且IRS2表达下降可能是胰岛素分泌减少的原因之一.增强胰岛素信号传导通路中IRS2蛋白的表达可能对于保护胰岛细胞有重要作用.

Abstract：

Objective To investigate the role of insulin receptor substrate 2(IRS2) and Bax on mouse islet cell apoptosis in the presence of high glucose in vitro.Methods The pancreatic islet cells were isolated from Kunming mice and divided into 6 groups(G1-G6 groups)for a 72-h culture in the media containing different concentrations of glucose(5.6,7.8,11.1,16.7,22.2,and 27.6 mmol/L,respectively).Insulin secretion by the cells was evaluated by radioimmunoassay,and the expressions of IRS2 and Bax were detected using immunocytochemistry and immunofluorescence assay,respectively.Hoechst33342 staining was employed to observe the cell apoptosis. Results Exposure to 5.6-11.1 mmol/L glucose resulted in increased insulin secretion and progressive elevation of IRS2 and Bax expression,whereas the cell apoptosis underwent no obvious changes.In the presence of glucose above 16.7 mmol/L,the percentages of apoptotic islet cells increased with glucose concentration,but insulin secretion and IRS2 expression decreased;Bax expression significantly increased in the presence of high-concentration glucose.Conclusion Prolonged exposure of mouse islet cells to high glucose induces apoptosis and impairs insulin secretion of the cells.Decreased IRS2 expression and increased Bax expression may play an important role in the glucotoxicity in mouse islet cells.     

罗格列酮对实验性1型糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的影响

目的:观察罗格列酮(Rosiglitazone natrium,RSG)对实验性1型糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的影响.方法:6周龄SD大鼠随机分成3组,正常对照(Control,Con)组24只,糖尿病(Diabetic mellitus,DM)组24只,罗格列酮干预(Rosiglitazone,RSG)组24只.以链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)溶液单次腹腔注射,72 h后测空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)≥16.7 mmol/L为造模成功.应用罗格列酮后5个时间段(2、5、7、10、13周),分别用TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)方法检测胰岛β细胞的凋亡,用免疫组化法检测胰岛中胰岛素(Insulin,Ins)及Fasl的表达.结果:与DM组相比,RSG组胰岛表达胰岛素水平提高,β细胞相对凋亡指数及Fasl表达水平均下降(P均＜0.05).结论:罗格列酮能抑制或延缓β细胞凋亡,其机制可能与抑制Fas/Fasl细胞凋亡通路有关.     

高浓度葡萄糖对体外培养小鼠胰岛细胞NF-κB的表达及细胞凋亡的影响

目的:探讨核因子κB（NF-κB）在高浓度葡萄糖诱导胰岛细胞凋亡中的作用。方法：对分离纯化的小鼠胰腺胰岛细胞进行体外培养,按DMEM培养液里葡萄糖浓度不同,分为6组：G1组（5.6 mmol•L^-1葡萄糖）、G2组（7.8 mmol•L^-1）、G3组（11.1 mmol•L^-1）、G4组（16.7 mmol•L^-1）、 G5组(22.2 mmol•L^-1)及G6组（27.6 mmol•L^-1）。采用放射免疫法检测各组胰岛细胞胰岛素分泌水平;免疫组织化学染色法检测NF-κB活性;免疫荧光法检测细胞色素C释放和细胞核染色检测细胞凋亡。结果：当葡萄糖浓度5.6～11.1 mmol•L^-1时,随着葡萄糖浓度升高,胰岛细胞胰岛素分泌逐渐增加（P<0.05),NF-κB的活性逐渐增加（P<0.05),但此时细胞凋亡未见显著的变化（P>0.05),细胞色素C释放的组间比较差异无显著性（P>0.05)。当葡萄糖浓度≥16.7 mmol•L^-1时,与葡萄糖浓度≤11.1mmol•L^-1各组比较, NF-κB表达明显增加,细胞色素C的释放也逐渐增强（P<0.05),胰岛细胞凋亡百分率同时也呈明显增加趋势（P<0.05）。结论：高浓度葡萄糖可以诱导胰岛细胞NF-κB表达增加,细胞色素C释放增强,同时诱导胰岛细胞凋亡,提示NF-κB的激活与胰岛细胞凋亡可能存在必然的联系,抑制NF-κB活性可能对于保护胰岛细胞有重要作用。     

苯丙酸诺龙对胰岛NIT-1细胞Nampt表达和胰岛素分泌的影响

目的：观察雄性激素苯丙酸诺龙(BPN)干预下胰岛NIT-1细胞中烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nampt）、胰岛素受体底物-2（IRS-2）和胰岛十二指肠同源盒-1（PDX-1）蛋白表达、细胞周期和胰岛素分泌的变化,探讨高浓度葡萄糖氧化应激状态下BPN对NIT-1细胞Nampt表达和胰岛素信号分子的影响。方法：应用4种不同浓度（5.6、11.1、16.7和27.6mmol•L^-1）葡萄糖培养NIT-1细胞,以10 mg•L^-1 BPN干预NIT-1细胞48 h,以未加BPN处理的相应浓度葡萄糖为对照组。应用Western blotting法检测各组细胞中Nampt、IRS-2 和 PDX-1蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞周期;放射免疫法测定细胞胰岛素分泌水平。结果：与相应浓度葡萄糖对照组比较,各BPN处理组NIT-1细胞中Nampt、ISR-2和PDX-1蛋白表达水平增加（P<0.05或P<0.01）;与相应对照组比较,在低糖（5.6 mmol•L^-1）时,BPN能够明显解除细胞G0/G1期阻滞（P<0.01）,在高糖（27.6 mmol•L^-1）时,能够解除细胞的G2/M阻滞（P<0.01）;除正常葡萄糖浓度11.1mmol•L^-1组之外,各处理组细胞的胰岛素分泌水平均明显增加（P<0.01）。结论：BPN能够增加胰岛NIT-1细胞中Nampt、ISR-2和PDX-1蛋白表达水平,NIT-1细胞中Nampt表达与胰岛素信号传导途径的相关分子间可能存在密切关联,雄性激素在一定条件下能够改善胰岛细胞的胰岛素抵抗状态。     

血管紧张素-(1-7)对胰岛素分泌细胞株NIT-1增殖的影响

[目的]探讨血管紧张素[Ang-(1-7)]对小鼠胰岛素分泌细胞株NIT-1细胞增殖的影响.[方法]NIT-1细胞按以下分组分别处理24 h,采用CCK-8比色法检测细胞增殖.(1)11.1、25.0、30.0、35.0和40.0 mmol/L葡萄糖液,35.0 mmol/L甘露醇分别处理24 h;(2)0、10-7、10-6、10-5和10-4 mol/L Ang-(1-7)分别处理24 h;(3)高糖(HG,35.0 mmol/L)、HG+Ang-(1-7)(10-5 mol/L)、HG+Ang-(1-7)+Mas受体拮抗剂(A-779,10-5 mol/L)和HG+A-779组.[结果](1)较11.1 mmol/L组,葡萄糖浓度为35.0和40.0 mmol/L时,NIT-1细胞的增殖明显减低(1.02±0.07 vs 1.21±0.10;0.90±0.05 vs 1.21±0.10,P＜0.05).(2)在11.1 mmol/L葡萄糖培养条件下,10-7～10-4mol/L之间的Ang-(1-7)不影响NIT-1细胞的增殖.(3)与HG组相比,HG+Ang-(1-7)组细胞的增殖率明显增加(1.44±0.24 vs 1.14±0.07,P＜0.05),加入A-779共同孵育可逆转Ang-(1-7)的促增殖效应(1.20±0.02 vs 1.44±0.24,P＜0.05).[结论]Ang-(1-7)通过Mas受体拮抗高糖对NIT-1细胞增殖的抑制作用.     

蛋白激酶5过度激活诱发β细胞凋亡和调节胰岛素分泌的机制研究

目的探讨高糖诱导细胞周期素依赖蛋白激酶5(CDK5)过度激活在胰岛β细胞凋亡及胰岛素分泌调节中的作用机制。方法体外培养Min6小鼠胰岛β细胞。采用不同浓度的葡萄糖(5 mmol/L组、20 mmol/L组和30mmol/L组)刺激胰岛β细胞6 h,收取和固定细胞,行免疫印迹和免疫荧光法测定p35的表达;将p35基因克隆到腺病毒载体中,将p35病毒和空载体病毒(EV)分别转染到胰岛β细胞中(p35组和EV组),测定p35蛋白表达、CDK5活性及胰岛素分泌水平;采用CDK5抑制剂(p35+Ros组)进行抑制试验;采用细胞凋亡相关抗体Cleavedcaspase 3测定胰岛β细胞凋亡。结果 20 mmol/L组和30 mmol/L组p35的表达较5 mmol/L组升高,30 mmol/L组p35的表达较20 mmol/L组升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。不同浓度葡萄糖培养的胰岛β细胞CDK5的表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。20 mmol/L组和30 mmol/L组胰岛β细胞CDK5活性较5 mmol/L组增高,30 mmol/L组胰岛β细胞CDK5活性较20 mmol/L组增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。20 mmol/L组和30 mmol/L组在刺激6 h较2 h胰岛素分泌均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。p35组p35表达较EV组增高,p35组可见p25条带,p35组CDK5活性较EV组增高,p35组胰岛素分泌水平较EV组增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。EV组和p35+Ros组细胞凋亡相关抗体Cleaved caspase 3表达较p35组减少,差异有统计学意义(P<0.05)。EV组和p35+Ros组胰岛素分泌较p35组增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论高浓度的葡萄糖可以抑制胰岛细胞正常分泌胰岛素。高糖环境下p35的表达增加进而诱发p25的表达,引起CDK5的过度激活和胰岛细胞的凋亡从而抑制胰岛素的分泌,可能是其作用机制之一。     

胰岛素对高糖条件下人脐静脉内皮细胞凋亡及小窝蛋白-1表达的影响

目的:探讨不同浓度的胰岛素对高糖条件下人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)凋亡及小窝蛋白(caveolin,Cav)-1表达的影响?方法:体外培养HUVEC,分为A组(对照组,葡萄糖浓度5.5 mmol/L)?B组(高糖组,葡萄糖浓度33.3 mmol/L)?C组(高糖+低浓度胰岛素组,葡萄糖浓度33.3 mmol/+胰岛素浓度20 mU/L)?D组(高糖+高浓度胰岛素组,葡萄糖浓度33.3 mmol/L+胰岛素浓度1 000 mU/L)?采用流式细胞仪检测细胞凋亡比例及细胞周期,免疫组化检测HUVEC的Cav-1表达?结果:在高糖条件下,HUVEC凋亡比例显著升高,停滞于G0/G1期细胞增加,Cav-1表达减少;低浓度胰岛素使细胞凋亡比例减少,Cav-1表达增加;加入高浓度胰岛素不能改变细胞凋亡比例及细胞周期,Cav-1表达亦无明显改变?结论:低浓度胰岛素可抑制高糖导致的内皮细胞凋亡,而高浓度胰岛素无此作用,其机制可能与Cav-1表达有关?