食管癌相关基因NGAL四种融合表达载体的构建及其蛋白表达产物的比较分析

目的：筛选出能高效表达且可溶性好的NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)融合表达载体。方法：将NGAL cDNA全长片段分别定向克隆到表达载体的BamHI EcoRI位点，构建NGAL基因的4种融合表达载体，然后分别转化大肠杆菌并进行IPTG诱导小样表达，监测各NGAL融合蛋白在不同诱导时间内的表达量及其可溶性等。选择pHis-NGAL和pDsbA2．0-NGAL进行IPTG诱导大样表达，通过SDS-PAGE比较表达产物的量与可溶性。结果：成功构建出4种NGAL融合表达载体。经IPTG诱导小样表达后，4种载体的表达水平及其可溶性明显不同，DsbA2．0-NGAL、His-NGAL和Trx-NGAL融合蛋白表达量分别占菌体总蛋白的33．3％、32．3％、28．7％，而它们的可溶性部分分别占各自总NGAL融合蛋白的96．8％、95．3％和63．0％。对pDsbA2．0-NGAL和pHis-NGAL进行IPTG诱导大样表达后发现，DsbA2．0-NGAL融合蛋白的表达量与可溶性较好。结论：pDsbA2．0-NGAL表达载体是能高效表达且可溶性好的NGAL融合蛋白表达载体。     

葡萄糖转运蛋白及其在乳腺癌中的表达

葡萄糖转运蛋白(GIut)存在于细胞表面，是转运葡萄糖跨过细胞膜进入细胞的载体，在恶性肿瘤细胞的表达明显高于周围正常组织。Glut及其基因有望成为一种新的肿瘤预后标记物及治疗的新靶点。现综述Glut及其在乳腺癌中的表达研究进展。     

葡萄糖转运蛋白及其在乳腺癌中的表达

葡萄糖转运蛋白(Glut)存在于细胞表面,是转运葡萄糖跨过细胞膜进入细胞的载体,在恶性肿瘤细胞的表达明显高于周围正常组织.Glut及其基因有望成为一种新的肿瘤预后标记物及治疗的新靶点.现综述Glut及其在乳腺癌中的表达研究进展.     

食管癌相关基因NGAL四种融合表达载体的构建及其蛋白表达产物的比较分析

目的 :筛选出能高效表达且可溶性好的NGAL(neutrophilgelatinase associatedlipocalin)融合表达载体。方法 :将NGALcDNA全长片段分别定向克隆到表达载体的BamHI +EcoRI位点 ,构建NGAL基因的 4种融合表达载体 ,然后分别转化大肠杆菌并进行IPTG诱导小样表达 ,监测各NGAL融合蛋白在不同诱导时间内的表达量及其可溶性等。选择pHis NGAL和pDsbA2 0 NGAL进行IPTG诱导大样表达 ,通过SDS PAGE比较表达产物的量与可溶性。结果 :成功构建出 4种NGAL融合表达载体。经IPTG诱导小样表达后 ,4种载体的表达水平及其可溶性明显不同 ,DsbA2 0 NGAL、His NGAL和Trx NGAL融合蛋白表达量分别占菌体总蛋白的 33 3%、32 3%、2 8 7% ,而它们的可溶性部分分别占各自总NGAL融合蛋白的96 8%、95 3%和 6 3 0 %。对pDsbA2 0 NGAL和pHis NGAL进行IPTG诱导大样表达后发现 ,DsbA2 0 NGAL融合蛋白的表达量与可溶性较好。结论 :pDsbA2 0 NGAL表达载体是能高效表达且可溶性好的NGAL融合蛋白表达载体。     

抗体细胞因子融合蛋白治疗肿瘤的研究进展

抗体细胞因子融合蛋白保持了抗体和细胞因子两者的功能，能在肿瘤微环境浓集并直接增大抗体的抗肿瘤效应和／或宿主的抗肿瘤免疫。综述了IgG融合IL—2、GM—CSF和IL—12融合蛋白的结构、生物学特性和用于治疗人类肿瘤的潜能。     

重组细胞因子融合蛋白的研究进展

应用基因工程实验技术,将细胞因子蛋白分子重组成一种融合蛋白分子.这种新型的融合蛋白分子,可发挥超越其单因子的生物学活性和/或具有便于分离纯化、检测等特性.因此它不仅在理论上有着崭新的内涵值得深入探讨,而且在应用上也具有潜在的广阔前景.本文对此领域的研究进展作一综述.     

抗体细胞因子融合蛋白治疗肿瘤的研究进展

抗体细胞因子融合蛋白保持了抗体和细胞因子两者的功能 ,能在肿瘤微环境浓集并直接增大抗体的抗肿瘤效应和 或宿主的抗肿瘤免疫。综述了IgG融合IL 2、GM CSF和IL 12融合蛋白的结构、生物学特性和用于治疗人类肿瘤的潜能     

具有缺氧反应性的Notch信号抑制蛋白调节鼠结肠癌细胞的体内生长

目的:研究缺氧细胞中的Notch信号对小鼠结肠癌细胞体内生长的影响.方法:将缺氧诱导因子 (hypoxia-inducible factor,HIF)- 1α中的氧依赖性蛋白降解结构域(oxygen-dependent degradation domain,ODD)、抑制Notch信号的mastermind样(mastermind-like,MAML)突变体蛋白1和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)重组构建融合蛋白表达载体.通过在免疫荧光显微镜下观察荧光强度,应用Western 印迹和实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative-PCR,RFQ-PCR)检测融合蛋白对缺氧的反应性和抑制Notch信号的能力.通过失巢凋亡实验和小鼠体内肿瘤形成实验,观察融合蛋白DNMAML1-ODD-GFP(DOG)对CT26结肠癌细胞体外失巢凋亡和小鼠体内肿瘤生长的影响.结果:DOG融合蛋白在细胞中的稳定表达依赖于缺氧条件,该融合蛋白能够靶向抑制缺氧CT26细胞中的Notch信号靶基因Hes1 mRNA的表达(P<0.01).体外失巢凋亡实验表明,DOG融合蛋白可显著促进缺氧CT26细胞的失巢凋亡(P<0.01).小鼠体内成瘤实验显示,DOG融合蛋白的表达可抑制结肠癌细胞CT26在小鼠体内的生长(P<0.01).结论:成功构建了靶向阻断缺氧细胞中Notch信号的融合蛋白表达载体.缺氧结肠癌细胞中的Notch信号对于肿瘤生长起重要作用.     

重组蛋白转导域-寡聚化域-血凝素融合蛋白抑制慢性粒细胞白血病BaF3-P210细胞小鼠致瘤能力

目的:探讨重组蛋白转导域-寡聚化域-血凝素(protein transduction domain-oligomerization domain-hemagglutinin,PTD-OD-HA)对慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)BaF3-P210细胞小鼠致瘤能力的影响。方法:将BaF3-P210细胞和经40μmol/L PTD-OD-HA处理48h的BaF3-P210细胞分别经尾静脉注射入BALB/c小鼠体内,观察小鼠一般状况以及生存时间,计数外周血白细胞,外周血和骨髓涂片进行Wright-Giemsa染色,肝、脾和肺等各主要脏器组织进行HE染色,蛋白质印迹法检测小鼠骨髓细胞bcr/abl蛋白的表达。结果:BaF3-P210细胞组和经PTD-OD-HA处理的BaF3-P210细胞组小鼠CML发病率分别为90%(9/10)和80%(8/10),外周血白细胞计数分别为(44.3±4.8)×109/L和(20.6±3.2)×109/L(P<0.05),骨髓细胞中bcr/abl癌蛋白表达量分别为5.13±0.46和1.32±0.29(P<0.05),平均生存期分别为(101.3±6.2)d和(185.4±8.7)d(P<0.05)。Wright-Giemsa染色可见,经PTD-OD-HA处理的BaF3-P210细胞组小鼠骨髓、肝脏和脾脏中的白血病细胞浸润程度比BaF3-P210细胞组下降。结论:经PTD-OD-HA处理后的BaF3-P210细胞在BALB/c小鼠体内的致白血病潜能明显受到抑制。     

PTD-OD-HA融合蛋白对bcr/abl阳性细胞凋亡的影响

目的:研究含有蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)、寡聚化结构域(oligomerization domain,OD)和HA标签的PTD-OD-HA融合蛋白对几种bcr/abl阳性细胞株细胞凋亡的影响.方法:将前期制备的PTD-OD-HA蛋白作用于几种bcr/abl阳性细胞后,应用FCM法、DNA 梯度电泳(DNA ladder)和透射电子显微镜检测细胞凋亡,RT-PCR和Western印迹法检测凋亡相关基因bax、bcl-2的mRNA和蛋白水平变化.结果:FCM法检测发现,PTD-OD-HA能促进bcr/abl阳性细胞发生凋亡;DNA ladder实验检测发现,PTD-OD-HA作用后BaF3-P210和K562细胞DNA电泳有梯状条带;透射电子显微镜观察发现,PTD-OD-HA作用后BaF3-P210细胞发生了凋亡;RT-PCR及Western印迹法检测显示,促凋亡基因bax的mRNA及蛋白水平增高,抗凋亡基因bcl-2的mRNA及蛋白水平降低.结论:PTD-OD-HA蛋白可以特异性诱发bcr/abl阳性细胞的凋亡.     

Generation of fusion protein EGFRvIII-HBcAg and its anti-tumor effect in vivo

The epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII) is the most common variation of EGFR. Because it shows a high frequency in several different types of tumor and has not been detected in normal tissues, it is an ideal target for tumor specific therapy. In this study, we prepared EGFRvIII-HBcAg fusion protein. After immunization with fusion protein, HBcAg or PBS, the titers of antibody in BALB/c mice immunized with fusion protein reached 2.75 × 10⁵. Western blot analysis demonstrated that the fusion protein had specific antigenicity against anti-EGFRvIII antibody. Further observation showed fusion protein induced a high frequency of IFN-γ-secreting lymphocytes. CD4+T cells rather than CD8+T cells were associated with the production of IFN-γ. Using Renca-vIII(+) cell as specific stimulator, we observed remarkable cytotoxic activity in splenocytes from mice immunized with fusion protein. Mice were challenged with Renca-vIII(+) cells after five times immunization. In fusion protein group, three of ten mice failed to develop tumor and all survived at the end of the research. The weight of tumors in fusion protein were obviously lighter than that in other two groups (t = 4.73, P = 0.044;t = 6.89, P = 0.040). These findings demonstrated that EGFRvIII-HBcAg fusion protein triggered protective responses against tumor expressing EGFRvIII.     

ScFv及重组TNF-α双功能抗体融合蛋白的表达及其软件预测

目的:利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质,以及探讨分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因的表达。方法:在构建融合蛋白之前,运用DNA分析软件(DNAssist)和蛋白质分析软件(ANTHEPROTV5)分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质。采用PCR方法将人工合成的抗体分泌信号肽序列加在抗肝癌ScFv基因5′端,其3′与人的肿瘤坏死因子TNFα基因连接构成分泌型单链双功能抗体ScFvTNFα基因,将该基因克隆至逆转录病毒表达载体PLxSN,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人肝癌细胞命名为HCC/ScFvTNFα,以PCR,RTPCR以及Westernblotting对ScFvTNFα基因修饰的HCC9204细胞进行鉴定。结果:运用DNAssist核酸序列分析软件分析ScFvTNFαDNA序列翻译并获得了氨基酸序列,运用ANTHEPROTV5蛋白质分析软件分析融合蛋白的二级结构及其理化性质。经酶切及PCR分析鉴定,成功地构建了融合基因表达载体pL(ScFvTNFα)SN,并获得高滴度产毒细胞株,以及Westernblotting分析证明ScFvTNFα基因融合蛋白的表达。结论:利用生物信息学网络资源进行分析预测融合蛋白的性质,为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据。     

ScFv及重组TNF-α双功能抗体融合蛋白的表达及其软件预测

目的：利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质，以及探讨分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因的表达。方法：在构建融合蛋白之前，运用DNA分析软件（DNAssist）和蛋白质分析软件（ANTHEPROT V5）分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质。采用PCR方法将人工合成的抗体分泌信号肽序列加在抗肝癌ScFv基因5’端，其3’与人的肿瘤坏死因子TNF-α基因连接构成分泌型单链双功能抗体ScFv-TNF—α基因，将该基因克隆至逆转录病毒表达载体PLxSN，用NIH3T3测定病毒滴度，将重组病毒感染人肝癌细胞命名为HCC／ScFv-TNF-α，以PCR，RT—PCR以及Western blotting对ScFv—TNF-α基因修饰的HCC9204细胞进行鉴定。结果：运用DNAssist核酸序列分析软件分析ScFv-TNF-αDNA序列翻译并获得了氨基酸序列，运用ANTHEPROT V5蛋白质分析软件分析融合蛋白的二级结构及其理化性质。经酶切及PCR分析鉴定，成功地构建了融合基因表达载体pL（ScFv—TNF-α ）SN，并获得高滴度产毒细胞株，以及Western blotting分析证明ScFv—TNF-α基因融合蛋白的表达。结论：利用生物信息学网络资源进行分析预测融合蛋白的性质，为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据。     

干扰素诱导的跨膜蛋白1在结直肠癌中表达及其临床意义

目的 探讨干扰素诱导的跨膜蛋白1（IFITM1）在结直肠癌中的表达及临床意义。方法 收集144例具有完整临床病理资料的结直肠腺癌组织标本,运用组织芯片技术和免疫组化法检测IFITM1在结直肠癌及其对应癌旁组织中的表达,分析IFITM1表达与临床病理特征、总生存时间（OS）的关系,以及影响预后的因素。结果 IFITM1在结肠腺癌组织中的高、中、低表达率分别为7.7％、36.9％、55.4％,癌旁组织中分别为3.1％、27.7％、69.2％,差异有统计学意义（P=0.044）;IFITM1在直肠腺癌组织中高、中、低表达率分别为1.3％、39.2％、59.5％,在癌旁组织中分别为5.1％、36.9％、58.2％,差异无统计学意义（P=0.569）。IFITM1表达水平和结直肠癌组织分化有关（P=0.031）,与年龄、性别、淋巴结转移、远处转移及TNM分期等无关（P＞0.05）。IFITM1高、中、低表达结直肠癌患者的中位OS分别为34.3个月、45.7个月和46.7个月（P=0.700）;结肠癌患者的中位OS分别为38.2个月、48.0个月和43.5个月;直肠腺癌患者的中位OS分别为15.0个月、42.7个月和50.1个月（P=0.037）。单因素和多因素分析显示,IFITM1的表达水平不是影响结直肠癌预后的因素。结论 结直肠癌组织中IFITM1表达与组织分化无关。     

TMEM158在乳腺癌中的表达及其对乳腺癌细胞迁移侵袭能力的影响

目的分析跨膜蛋白158（Transmembrane protein 158, TMEM158）在乳腺癌组织中的表达,探讨其对乳腺癌细胞侵袭能力的影响及作用机制。方法分析TCGA数据库中下载的1094例乳腺癌组织和120例癌旁组织的mRNA表达谱数据;Western 印迹验证乳腺癌患者癌组织及其对应癌旁组织中TMEM158蛋白表达差异;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测乳腺癌细胞系中TMEM158表达水平。通过小干扰RNA技术转染乳腺癌SUM1315细胞,Transwell及细胞划痕实验观察沉默TMEM158后对乳腺癌细胞迁移侵袭能力的影响,同时Western 印迹和qRT-PCR实验分析干扰TMEM158对EMT（epithelial-mesenchymal transition）相关标志物E-Cadherin、Vimentin、Snail、N-Cadherin表达量的影响。结果分析TCGA数据库中下载的1094例乳腺癌组织和120例癌旁组织的mRNA表达谱数据显示,TMEM158在乳腺癌组织中的表达水平（6.65 ± 1.76）高于癌旁组织（5.81 ± 1.22）,差异有统计学意义（P<0.05）;分析120对乳腺癌及其对应的癌旁组织,结果表明,TMEM158在乳腺癌组织中表达（6.50 ± 1.76）高于对应的癌旁组织（5.81 ± 1.22）,差异有统计学意义（P<0.05）。Western 印迹检测4对人乳腺癌及对应的癌旁组织标本中TMEM158蛋白的表达差异显示,与癌旁乳腺组织比较,乳腺癌组织TMEM158表达升高,差异有统计学意义（P<0.05）。qRT-PCR分析乳腺癌细胞水平TMEM158表达差异显示,相对于正常乳腺导管细胞（MCF-10A）,乳腺癌细胞中TMEM158表达水平升高,差异有统计学意义（P<0.05）,qRT-PCR结果显示,与正常乳腺导管细胞（MCF-10A）相比,人乳腺癌细胞株TMEM158表达量升高,差异有统计学意义（均P< 0.05）。Transwell实验结果表明,与对照组细胞（SUM1315-SiNC）相比,干扰TMEM158（SUM1315-SiTMEM158）细胞的迁移和侵袭能力降低[（346 ± 59）比(196 ± 33), P< 0.05;（202 ± 68）比（99 ± 21）, P< 0.05）]。细胞划痕实验结果显示,沉默TMEM158后细胞迁移能力降低[（54.68 ± 10.85）比（25.54 ± 7.64）, P< 0.05]。Western 印迹和qRT-PCR结果证明,沉默TMEM158后E-Cadherin表达量增加,而Vimentin、Snail、N-Cadherin表达量下降,差异有统计学意义。结论TMEM158在乳腺癌组织与细胞系中高表达,可通过调控EMT相关蛋白的表达干扰TMEM158,从而抑制乳腺癌细胞迁移侵袭。     

PD-L1-Ig融合蛋白的酵母表达及其对T细胞的抑制作用

目的：利用毕赤酵母表达系统表达PDL1Ig融合蛋白,检测该融合蛋白的生物学活性。方法：化学合成hPDL1IgG4融合基因,构建携带该基因的酵母表达载体,转化GS115酵母菌株后分泌表达融合蛋白,亲和层析和离子交换层析法纯化,SDSPAGE和Western blotting分析鉴定。ELISA法检测融合蛋白与受体PD1的结合能力,混合淋巴细胞反应检测融合蛋白对T细胞功能的抑制能力,51Cr稀释法检测其对CTL杀伤人结肠癌SW480细胞效应的抑制作用。结果：成功构建酵母表达载体pPIC9KPDL1IgG4,转化菌株分泌表达PDL1IgG4融合蛋白,相对分子质量为55 000,含量为120 μg/ml。发酵菌株,纯化制备融合蛋白。融合蛋白与受体PD1具有良好的结合能力,能够显著抑制T细胞增殖、活化（P<0.01）,并抑制CTL对结肠癌细胞的杀伤（P<0.01）。结论：成功制备了酵母表达PDL1IgG4融合蛋白,该融合蛋白具有良好的生物学活性,为深入研究其在肿瘤免疫应答中的调控效应奠定了良好基础。     

靶向性抗肿瘤融合蛋白EGF-E4orf4的表达及其细胞毒性的初步分析

背景与目的:人表皮生长因子(human epidermal growth factor,EGF)是受体起作用刺激细胞增殖和分化的重要生长因子。正常细胞的表面有,但很多肿瘤尤其是实体瘤细胞表面则有异常高水平的EGF受体的表毒早期区4第4编码蛋白,即腺病毒E4orf4蛋白(adenovirus early region ding frame 4 protein)可以特异地诱导肿瘤细胞发生不依赖p53表达的种新型的细胞毒因子。本研究旨在利用EGF的靶向性和E4orf4蛋白的,在分子水平设计合成一个融合蛋白,使其具有组成部分各自的生物学     

干扰素诱导的穿膜蛋白家族在肿瘤中的作用及其临床意义

基因表达异常是肿瘤发生发展的重要原因之一,其可导致肿瘤细胞恶性增殖、抵抗凋亡、浸润甚至转移,基因及其编码蛋白的研究有助于加深对肿瘤发生发展的分子机制的认识以及相关基因诊断和治疗的开展。近年来研究显示,干扰素诱导的穿膜蛋白（interferon-induced transmembrane protein,IFITM）家族异常表达与肿瘤的发生发展有关,其中 IFITM1、IFITM2 和IFITM3已被证实在胃癌、乳腺癌、肺癌和肝癌等多种实体肿瘤中高表达,通过调控细胞周期和凋亡相关蛋白的水平,促进肿瘤细胞增殖并抑制凋亡;通过上调基质金属蛋白酶的表达和活性,加速上皮间质转化进程,促进肿瘤细胞的侵袭和转移。IFITM高表达也与患者预后不良显著相关。本综述将围绕IFITM1、IFITM2和IFITM3讨论IFITM在肿瘤发生发展中的作用,阐述其调控机制及在肿瘤诊断和预后预测等方面的临床价值,为寻找新的肿瘤诊断标志物和治疗靶点提供帮助。     

黏液样/圆细胞型脂肪肉瘤中FUS-CHOP融合基因和MDM2蛋白的表达及意义

目的 探讨FUS-CHOP融合基因与M DM2蛋白在黏液样/圆细胞型脂肪肉瘤(MRCLs)组织中的表达及意义.方法 收集MRCLs标本25例.以非MRCLs的脂肪肉瘤及其它软组织肿瘤共18 例作对照组.用嵌套式RT-PCR的方法检测FUS-CHOP融合基因mRNA并经和DNA测序证实 ,以β-actin基因作为内对照.用免疫组化S-P法检测25例MRCLs中MDM2蛋白表达情况.结果 MRCLs组和对照组β-actin阳性率分别为72.0%(18/25) 和66.7%(12/18).25例MRCLs中15例检出Ⅱ型FUS-CHOP融合基因表达,阳性率为(60 .0%),去除β-actin阴性病例的阳性率为83.3%(15/18).对照组18例标本未检出FUS-C HOP融合基因.MRCLs中MDM2蛋白阳性表达率为56.0%(14/25),在圆细胞为主的病例组阳性表达率最高,差异有显著性.FUS-CHOP融合基因与MDM2蛋白表达无相关性.结论 (1)MRCLs中FUS-CHOP融合基因与MDM2蛋白的表达无相关性.(2)FUS-CHOP融合基因在MRCLs中呈特异性表达,可作为该肿瘤的特异性标志物用于诊断.(3)MDM2蛋白过表达与MRCLs的进展相关.