基于CRISPR/Cas9技术构建GP73基因敲除小鼠模型及表型验证

目的：基于CRISPR/Cas9技术构建高尔基体73(GP73)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。方法：利用非同源末端连接(NHEJ)修复引入突变的方式,造成GP73基因蛋白读码框移码,使其功能缺失,针对GP73基因外显子4设计sgRNA靶位点,体外转录获得sgRNA,与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法获得F0代阳性敲除小鼠,通过繁育及基因型鉴定获得GP73基因敲除纯合子小鼠(GP73^-/-小鼠)。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测肝、肾、皮下脂肪、棕色脂肪组织中GP73 mRNA表达,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清GP73蛋白水平。结果：与野生型(WT)小鼠相比,GP73^-/-小鼠肝、肾、皮下脂肪、棕色脂肪组织GP73 mRNA及蛋白表达水平降低,血清GP73蛋白水平降低(均P<0.05)。结论：基于CRISPR/Cas9技术成功构建了GP73基因敲除小鼠。     

水通道蛋白4基因敲除对老年小鼠行为和脑形态变化的影响

目的：观察AQP4基因敲除（AQP4^-/-）对老年小鼠行为学和脑形态学变化的影响,揭示AQP4在脑老化中的作用。方法：58只CD-1小鼠按基因型与月龄分为4组：年轻（2~3个月龄）AQP4-/-组、老年（17~19个月龄）AQP4^-/-组、年轻AQP4^+/+组和老年AQP4^+/+组。采用开场试验测定小鼠运动量和探究行为,脑切片进行神经元特异性染色（甲苯胺蓝染色、NeuN染色）、星形胶质细胞特异性染色（GFAP染色）和小胶质细胞特异性染色（Iba-1染色）,观察并计数皮层和海马神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞的形态和数量。结果：与年轻小鼠比较,老年AQP4^+/+和AQP4^-/-小鼠在开场试验的总活动距离分别减少41.2%和44.1%（P<0.05）,各组小鼠在中心区域的活动距离和滞留时间无差异;老年AQP4^+/+和AQP4^-/-小鼠皮层神经元密度分别降低19.6%和15.8%（P<0.05）,各组间CA1区神经元胞体层厚度无差异;老年AQP4^+/+和AQP4^-/-小鼠海马CA3区星形胶质细胞密度分别增加57.7%和64.3%（P<0.001）,各组间星形胶质细胞的总面积无显著差异;老年AQP4^+/+和AQP4^-/-小鼠海马CA3区小胶质细胞的面积分别增加46.9%和52.0%（P<0.01）,各组间小胶质细胞密度无显著变化。与AQP4^+/+小鼠相比,AQP4^-/-小鼠在海马CA3区星形胶质细胞总面积明显减小,年轻小鼠减小18.0%（P<0.01）,老年小鼠减小23.6%（P<0.01）,其余指标均无显著差异。结论：AQP4可能影响小鼠星形胶质细胞形态及与星形胶质细胞相关的神经功能,对神经元、小胶质细胞的形态和部分相关神经行为无明显影响,AQP4基因敲除对小鼠脑老化过程发生的脑形态和神经行为变化无显著影响。     

人/猪SERPING1同源性比较及猪SERPING1敲除细胞系的建立

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SERPING1^-/-猪胎儿成纤维细胞(PFFs)系,为构建遗传性血管性水肿模型提供细胞实验材料。方法 首先比较人/猪SERPING1氨基酸同源性。其次,分析猪SERPING1基因有效的编码区,据此选择第八外显子为敲除靶点,设计并合成靶向猪SERPING1的单导向RNA(sgRNA),连接到含有Cas9核酸内切酶的pX330载体上,构建SERPING1打靶载体pX330sgRNA,将其转染至猪胎儿成纤维细胞中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,用T7E1酶切实验检测靶点编辑情况,测序验证单克隆细胞基因型。结果 生物信息学分析结果提示人/猪SERPING1蛋白氨基酸同源性较高,氨基酸比对相似性达到65.87%。成功构建打靶SERPING1的载体,并转染到细胞,药物筛选获得SERPING1基因敲除的单克隆细胞,测序确认了突变的基因型。结论 人/猪SERPING1蛋白同源性较高,适合用于构建遗传性血管性水肿模型。构建的Cas9/sgRNA表达载体实现了SERPING1基因编辑,获得基因敲除的单细胞克隆,为后续SERPI...     

miR-100基因敲除小鼠模型的构建及基因型鉴定

目的探讨miR-100基因敲除小鼠模型的构建及基因鉴定。方法将引进的miR-100^flox/flox小鼠与EIIa-Cre小鼠进行交配繁育出F1代小鼠,将F1代小鼠中基因型为miR-100^flox/-的雌雄小鼠继续进行交配,获得F2代小鼠,待小鼠1周龄时剪尾部组织提取DNA,PCR法扩增目的基因片段,琼脂糖凝胶电泳进行基因型结果判定。结果结果显示有所需要的miR-100基因敲除纯合子小鼠,将获得的敲除纯合子小鼠再交配,就可获得更多的基因敲除纯合子小鼠。F1代杂合子小鼠交配获得的F2代小鼠中出现3种基因型:miR-100^flox/flox、miR-100^flox/-、miR-100^-/-,使用PCR法成功鉴定出了子代小鼠的基因型。同时剪取miR-100敲除纯合子小鼠、miR-100^flox/flox小鼠及miR-100敲除杂合子小鼠的耳朵提取RNA,然后进行qRT-PCR验证miR-100的表达情况。qRT-PCR结果显示,miR-100基因全身敲除纯合子小...     

CRISPR/Cas9介导TKI对非小细胞肺癌基因靶向吉非替尼耐药敏感性的影响及其机制

目的：探讨CRISPR/Cas9介导酪氨酸激酶抑制剂（TKI）对非小细胞肺癌基因靶向吉非替尼耐药敏感性的影响,并阐明其机制。方法：利用CRISPR/Cas9系统建立酪氨酸激酶（TKs）敲除A549细胞株,按照TKI表达情况分为A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株。Western blotting法检测细胞株中P53、MDM2、Bcl-2和Bax蛋白表达水平,CCK-8法检测A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞活性,细胞划痕实验检测A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株的细胞迁移情况,流式细胞术检测A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞凋亡率,克隆形成实验检测细胞集落形成情况。结果：CRISPR/Cas9系统成功建立了TKs敲出A549细胞株,A549、A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞活性比较差异无统计学意义（P>0.05）;3种细胞凋亡率比较差异无统计学意义（P>0.05）,细胞迁移情况变化不大。经6 mol·L^-1吉非替尼干预72 h后,与A549细胞株比较,A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株的细胞活性降低（P<0.05）,细胞凋亡率升高（P<0.05）,细胞划痕愈合率明显降低（P<0.05）,细胞迁移能力明显减弱;与A549细胞株比较,A549TKs^-/+和A549TKs^-/-细胞株中P53和Bax蛋白表达水平降低（P<0.05）,MDM2和Bcl-2蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,细胞集落生成率明显降低（P<0.05）。结论：采用吉非替尼对敲除A549细胞株进行干预可以降低细胞活性和迁移能力,升高细胞凋亡率和吉非替尼耐药的敏感性。     

免疫抑制受体igsf 9基因敲除鼠的构建以及对肿瘤生长的影响

目的构建免疫抑制受体igsf 9基因敲除小鼠模型,并探究该小鼠模型对肺癌细胞生长的影响。方法将Cas 9 mRNA和igsf 9-sg RNA显微注射到C57BL/6小鼠受精卵中,利用非同源重组修复引入突变,造成igsf 9基因蛋白移码突变、功能缺失;应用PCR和测序技术进行基因型鉴定。将2×10⁶个Lewis肺癌细胞(LL/2)皮下接种到C57BL/6-igsf 9^+/+和C57BL/6-igsf 9^-/-小鼠皮下,每3天检测肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线;当肿瘤体积大于2 cm³时,在麻醉状态下处死小鼠,称肿瘤质量、流式细胞仪检测肿瘤组织各免疫细胞水平。结果 igsf 9基因4-9外显子区域出现了2 892 bp缺失,igsf 9基因发生移码突变,提前出现终止密码子,成功构建igsf 9基因敲除小鼠模型,而且该小鼠的体质量以及外周血、脾脏和骨髓中免疫细胞的比例未见明显差异。与C57BL/6-igsf 9^+/+小鼠相比,C57BL/6-igsf 9^-/-小鼠...     

磷酸二酯酶4D纯合子敲除小鼠的构建

目的 应用CRISPR/Cas9技术构建磷酸二酯酶4D(PDE4D)纯合子敲除小鼠，为深入探究PDE4D基因的功能及作用机制提供基础。方法 针对PDE4D基因外显子4,5号构建载体显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵中，经过母本繁育和子代交配获得PDE4D^-/-小鼠，通过PCR产物测序及基因型鉴定技术测定小鼠基因型。使用超声成像系统和HE染色检测小鼠主要器官形态和功能的变化，通过Westernblot实验验证PDE4D蛋白在小鼠体内的表达情况。结果 PDE4D^-/-小鼠基因型稳定遗传，小鼠体型较小，体内主要器官无明显形态及组织学改变。PDE4D杂合或纯合敲除小鼠主要组织中PDE4D表达减少或基本不表达，敲除效果较好。结论本课题利用CRISPR/Cas9技术成功建立了PDE4D^-/-小鼠，未发现明显生理异常，可用于以PDE4D为靶点的疾病发病机制及药物研究。     

银松素治疗Nrf2-/-小鼠少弱精症作用机制研究

目的：探究银松素(pinosylvin)对Nrf2基因敲除小鼠少弱精症的治疗作用及机制。方法：将实验小鼠分为野生型(WT)组、Nrf2^-/-组和Nrf2^-/-+pinosylvin组,Nrf2^-/-+pinosylvin组小鼠给予100 mg/kg银松素灌胃,持续灌胃4周,处死小鼠取出睾丸及附睾组织。使用计算机辅助分析系统检测各组小鼠精子浓度与精子活力;苏木素伊红染色观察小鼠睾丸及附睾病理变化;酶联免疫吸附法检测各组小鼠睾丸组织中丙二醛(malondialdehyde,MDA)及活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;Western blot检测各组小鼠睾丸组织中铁死亡相关蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)和凋亡相关蛋白Bax、P53表达。结果：与WT组小鼠比较,Nrf2^-/-组小鼠精子浓度和精子活力明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),表明Nrf2^-/-小鼠出现少弱精症。病理切片染...     

利用CRISPR/Cas9建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除成体神经干细胞（neural stem cell,NSC）PIN1基因,建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系。方法：取8周龄C57BL/6小鼠脑室下区的脑组织进行体外培养;设计靶向小鼠PIN1基因的单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以PX330质粒为骨架,构建PIN1的Cas9打靶载体,转染小鼠的成体神经干细胞,通过puro筛选和测序鉴定获得PIN敲除的单克隆细胞;利用免疫荧光染色和Western blot测定PIN1蛋白表达水平,免疫荧光染色鉴定神经干细胞的特征性标志物巢蛋白（Nestin）的表达,Beta Ⅲ Tubulin免疫荧光染色鉴定神经干细胞分化为神经元的能力。结果：成功构建PIN1基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得PIN1敲除的神经干细胞克隆9个。免疫荧光染色及Western blot显示PIN1蛋白无表达,免疫荧光染色显示PIN1敲除的神经干细胞Nestin阳性,神经干细胞分化培养时可部分分化为Beta Ⅲ Tubulin阳性的神经元细胞。结论：CRISPR/Cas9基因编辑技术可实现对小鼠成体神经干细胞PIN1基因的编辑。在PIN1基因敲除后PIN1蛋白无表达,初步表型分析显示,神经干细胞仍表达特征性标志物Nestin,并具有向神经元分化的能力。     

纤溶酶原激活物抑制物-1在哮喘小鼠气道炎症反应中的作用

目的：探讨纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)在支气管哮喘(简称哮喘)小鼠气道炎症反应中的作用。方法：将野生型(WT)和PAI-1基因敲除(PAI-1^-/-)小鼠随机分为野生型对照组(NS/WT组)、基因敲除对照组(NS/PAI-1^-/-组)、野生型哮喘组(OVA/WT组)和基因敲除哮喘组(OVA/PAI-1^-/-组)。通过腹腔注射和雾化吸入卵白蛋白(OVA)建立哮喘模型。肺泡灌洗液(BALF)行细胞分类计数；肺组织行HE染色和免疫组化。Luminex?法检测血浆中IL-4、IL-13、IL-10、IL-2、INF-γ的含量。结果：PAI-1基因敲除使哮喘小鼠BALF中的中性粒细胞数量显著升高(P<0.01),对总炎症细胞数、嗜酸性粒细胞数、淋巴细胞数的改变不明显；PAI-1基因敲除使哮喘小鼠肺组织炎症细胞浸润加重、CD68表达量增加、血浆IL-10和INF-γ水平显著降低(P<0.05或P<0.01),IL-4、IL-13、IL-2水平无显著变化。结论：PAI-1基因缺失促进哮喘小鼠肺部炎症细胞募集...     

CRISPR/Cas9系统构建ROCK2基因敲除肺癌细胞系

目的 利用CRISPR/Cas9编辑系统对人肺癌细胞系A549、H460细胞中Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(ROCK2)基因进行稳定敲除,并对其敲除效果进行验证。初步探讨ROCK2基因敲除肺癌细胞株的细胞水平上的功能改变。方法 利用Rock-2 CRISPR 质粒和Rock-2 HDR 质粒转染构建A549、H460 ROCK2基因敲除稳定细胞株。蛋白质印迹法验证敲除效果、用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测ROCK2基因的mRNA表达水平。平板克隆形成实验、MTT法检测各细胞株的增殖能力。结果 A549、H460肺癌细胞中ROCK2基因稳定敲除株构建成功。与原始细胞株相比,ROCK2敲除株细胞中的蛋白表达水平完全缺失,细胞内的mRNA表达水平显著下降,而且能降低A549、H460肺癌细胞的增殖能力。结论 利用CRISPR/Cas9基因编辑系统获得ROCK2基因敲除的肺癌细胞系,为进一步研究ROCK2对肺癌生长的影响奠定基础。     

基于CRISPR/Cas9系统建立GPR108缺失的THP-1细胞株及其功能初步研究

目的 建立稳定敲除G蛋白偶联受体108(GPR108)基因的人单核细胞白血病细胞系(THP-1),并初步研究其功能。方法 根据人GPR108基因序列设计，合成可应用于成簇有规律的间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)的单链引导RNA(sgRNA1和sgRNA2)对应的DNA,利用分子克隆技术在pL-CRISPR.EFS.GFP慢病毒载体中插入sgRNA1和sgRNA2序列，构建重组载体(pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA1和pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA2)。将测序正确的重组体与包装质粒(pMD2.G和psPAX2)共转染293T细胞进行病毒包装，收集病毒液并感染THP-1细胞。利用流式细胞分选技术分离GFP⁺细胞于96孔培养板中，培养获得单细胞克隆。利用聚合酶链式反应(PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测THP-1细胞中GPR108是否敲除成功。应用脂多糖(LPS)刺激GPR108^-/-和GPR108^+/+的THP-1细胞，Western blot法检...     

诱导型巨噬细胞特异性敲除GRK2基因小鼠模型的构建及应用

目的 建立诱导型巨噬细胞特异性敲除G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)基因(GRK2^flox/floxLyz2-CreERT⁺)小鼠模型。方法 基于Cre/LoxP系统构建GRK2^flox/floxLyz2-CreERT⁺小鼠。通过PCR扩增程序及琼脂糖凝胶电泳鉴定GRK2^flox/floxLyz2-CreERT⁺小鼠的基因型。二氧化碳法处死小鼠后，Western blot检测骨髓源巨噬细胞(BMDMs)和腹腔巨噬细胞(PMs)中GRK2表达。免疫荧光检测小鼠脑、心脏和脾脏巨噬细胞中GRK2表达。流式细胞术分析前列腺素E2(PGE2)诱导的PMs中M1/M2比例。结果 基因型鉴定结果表明，flox扩增产物长度在355 bp处有一条条带且Cre扩增产物长度在355 bp处有一条条带的小鼠即为GRK2^flox/floxLyz2-CreERT⁺小鼠。Western blot结果显示，与GRK2^{flox/flox<...}     

右美托咪定对缺血性卒中小鼠小胶质细胞极化的影响

目的 探究右美托咪定(Dex)对缺血性卒中小鼠缺血侧小胶质细胞极化的影响。方法 小鼠为C57BL/6(C57)小鼠和C57BL/6背景敲除Nrf2基因(Nrf2 ^-/-)小鼠，将两种小鼠分为假手术组(C57-Sham组和Nrf2^-/--Sham组)、脑缺血组(C57-MCAO组和Nrf2^-/--MCAO组)、Dex组(C57-Dex组和Nrf2^-/--Dex组)。小鼠体内构建缺血性脑卒中模型，假手术组小鼠仅分离颈动脉，不插入线栓。缺血性卒中模型构建期间，Dex组小鼠腹腔注射Dex溶液(50 mg/kg)治疗。24 h后评估各组小鼠神经功能。将小鼠处死，取外周血用于炎性细胞因子检测，取全脑组织用于TTC染色，取缺血侧脑组织用于荧光定量PCR与Western blot检测。结果 C57小鼠中，与C57-Sham组相比，C57-MCAO组神经功能评分增加，出现梗死区域，外周血中炎性细胞因子含量增加，M1型小胶质细胞极化标记基因表达明显提高，Nrf2蛋白表达减少但HO-1蛋白表达增加，且NLRP3与p-NF...     

利用CRISPR/Cas9技术敲除HeLa细胞中YAF2基因

目的 利用CRISPR/Cas9技术建立YAF2（YY1 associated factor 2）基因敲除的宫颈癌HeLa细胞株,用于YAF2基因在宫颈癌细胞中分子功能的研究。方法 首先利用CRISPR/Cas9序列设计网站,设计两对靶向YAF2基因第2外显子不同位点的向导RNA（single-guide RNA,sgRNA）。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,分别克隆至质粒pX335中,测序确认插入片段正确的克隆。先用一对重组载体转染HeLa细胞,7天后,再用另一对转染HeLa细胞,第2对转染3天后,取培养细胞的2/3提取基因组DNA,对敲除位点附近的片段进行PCR扩增后通过DNA测序对敲除效率进行分析,剩余细胞在96孔平板上通过有限稀释法筛选YAF2敲除的细胞株。用蛋白质免疫印迹实验初步鉴定YAF2蛋白质表达缺失的细胞克隆,提取其基因组DNA,对敲除位点附近的序列进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pGEM-T easy载体,通过DNA测序确认YAF2基因纯合敲除的细胞株。结果 成功构建两对针对人YAF2基因第二外显子的pX335-sgRNA质粒;PCR产物测序证明两对重组载体均有YAF2基因敲除活性;得到2株YAF2敲除的HeLa细胞株。结论 利用CRISPR/Cas9技术在HeLa细胞中成功敲除YAF2基因,为在HeLa细胞中研究YAF2的分子功能奠定基础。     

应用CRISPR/Cas9和Cas9⁃D10A建立Nsun5基因敲除小鼠模型并分析脱靶效应

目的：为了检测CRISPR/Cas9系统的潜在脱靶效应,分别利用野生型Cas9和切口酶Cas9?D10A构建了RNA甲基转移酶Nsun5基因敲除小鼠模型,并对两种策略得到的F0小鼠进行脱靶分析,以比较两种敲除策略的特异性。方法：针对Nsun5基因第3外显子,设计1对sgRNA,将野生型Cas9 mRNA和切口酶Cas9?D10A mRNA分别同这对sgRNA混合后注入小鼠一细胞期受精卵中,实现靶基因敲除,比较两种Cas9得到的F0代敲除小鼠的脱靶效应。结果：利用CRISPR/Cas9和Cas9?D10A成功建立Nsun5基因敲除小鼠模型,对两种Cas9得到的F0代突变小鼠进行潜在脱靶位点分析,均未检测到脱靶位点的存在。结论：两种策略都成功构建了不含脱靶位点的Nsun5基因敲除小鼠模型,为进一步研究Nsun5的生物学功能打下基础。     

CRISPR/Cas9联合Cre-Loxp系统建立VASN条件敲除的小鼠肝细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统的条件性敲除策略构建VASN基因敲除的AML12小鼠肝细胞株。方法：在VASN基因第二外显子上下游设计靶点并合成gRNA序列,构建2个CRISPR/Cas9重组载体;设计构建VASN上下游分别带有Loxp序列和旁侧同源序列的供体载体donor DNA质粒;将3个质粒共转染至小鼠肝细胞AML12中,分离单克隆,提取基因组DNA,经PCR及测序鉴定获得稳定敲入Loxp序列的单克隆细胞株AML12-Loxp;将pALB-Cre质粒转染至AML12-Loxp,筛选建立敲除VASN基因的细胞系。结果：成功构建2个靶向敲除VASN基因的pX459-gRNA-VASN-1和pX459-gRNAVASN-2重组载体及一个供体载体;转染药筛后获得12个单细胞克隆,经测序,5个单克隆细胞实现VASN基因上下游精确敲入Loxp序列;同源重组敲入效率为41.6%;p ALB-Cre质粒转染后获得20个单细胞克隆,经PCR和测序获得12个VASN基因敲除的单克隆细胞,敲除效率为60%。结论：利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统成功构建...     

RG108对HT22细胞系增殖和基因表达的影响

目的 探讨DNA甲基转移酶抑制剂RG108对体外培养的小鼠海马神经元细胞系HT22细胞的影响。方法 DNA甲基转移酶抑制剂RG108浓度设置为0.5、5、50 μmol/L,对体外培养的HT22海马神经元细胞进行干预,CCK-8检测细胞活力;利用RT-qPCR检测细胞中下游基因的表达情况。结果 CCK-8实验表明,50 μmol/L RG108处理HT22细胞48、72 h后可以促进细胞增殖,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-qPCR结果证明,50 μmol/L RG108处理HT22细胞后突触可塑性相关基因nr1、reln表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 DNA甲基转移酶抑制剂RG108能促进小鼠海马神经元细胞系HT22细胞增殖并调控神经可塑性相关基因表达。且RG108可能会影响突触可塑性,对突触可塑性相关行为(如记忆)的形成造成影响。     

IKKβ缺失和NF-κB p65缺失对小鼠成骨细胞分化的影响

目的:探讨IKKβ和NF-κB p65缺失对小鼠成骨细胞分化的影响。方法:使用CRISPR/Cas9基因编辑工具分别敲除小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中的Ikbkb或Rela基因,获得不表达IKKβ或NF-κB p65蛋白的Ikbkb^-/- MC3T3-E1和Rela^-/- MC3T3-E1细胞。用10 mmol/Lβ-甘油磷酸+50 mg/L抗坏血酸诱导MC3T3-E1、Ikbkb^-/- MC3T3-E1、Rela^-/- MC3T3-E1细胞成骨分化。诱导培养4 d后,qPCR法检测细胞中成骨分化标志性基因Sp7、Alpl、Spp1、Bglap mRNA的表达,Western blot法检测细胞中成骨分化相关蛋白ALPL、FZD9的表达;16 d后,茜素红染色法检测细胞外基质矿化水平。结果:诱导培养后Ikbkb^-/- MC3T3-E1细胞中Sp7、Alpl、Bglap mRNA表达以及ALPL、FZD9蛋白表达高于MC3T3-E1细胞和Rela^-/- M...     

KCNH6基因肝脏特异性敲除小鼠的构建及其初步应用

目的 构建KCNH6基因肝脏细胞特异性敲除小鼠,并监测其肝脏血脂变化。方法 运用Cas9技术构建KCNH6^flox/flox转基因小鼠,将其与肝脏细胞特异性表达Cre重组酶工具鼠（Alb-cre）进行杂交,采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）方法鉴定基因型。监测基因敲除小鼠和同窝对照小鼠的体质量和进食量。分别检测8周和20周雌雄各两组小鼠的三酰甘油、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。结果 成功构建KCNH6基因肝脏细胞特异性敲除小鼠,其基因型为KCNH6^flox/flox/Cre^T。与同窝对照组相比,基因敲除小鼠的体质量和进食量均无明显变化。8周雄性和雌性小鼠的血脂无明显变化。20周时雄性小鼠的胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇均有明显升高。结论 成功构建了KCNH6基因肝脏细胞特异性敲除小鼠动物模型,成年雄性小鼠存在肝脏血脂代谢异常。动物模型的构建为探讨KCNH6基因在肝脏脂代谢中的作用提供重要研究平台。