经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植对扩张型心肌病兔心肌间质重塑的影响

背景：骨髓单个核细胞为一组多潜能干细胞的混合体，在原发性扩张型心肌病领域的应用尚处于起步阶段。 目的：评价经冠状动脉移植自体骨髓单个核细胞对阿霉素诱导的扩张型心肌病模型兔心肌间质重塑的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006-10/2007-06在复旦大学附属华山医院心血管研究室完成。 材料：普通级3月龄雄性新西兰兔30只，由上海中医药大学实验动物中心提供。阿霉素为深圳万乐药业股份有限公司产品，批号0602E1。 方法：30只兔均经耳缘静脉注射盐酸阿霉素建立扩张型心肌病模型，造模后存活兔取10只用于模型观察，剩余20只随机分为移植组、对照组，10只/组。移植组兔抽取髂骨骨髓，采用密度梯度离心法分离自体骨髓单个核细胞，于造模2周后经塑性的4F造影导管模拟临床冠状动脉内输注骨髓单个核细胞悬液2 mL。对照组兔同样接受骨髓液采集以平衡手术操作创伤对实验结果的影响，完成选择性左冠状动脉造影后，经造影导管注射2 mL生理盐水。 主要观察指标：通过RT-PCR半定量检测心肌胶原容积分数、基质金属蛋白酶1，3 mRNA的表达评价心肌间质重塑，通过血流动力学指标和血清脑钠素浓度评价心功能的变化。 结果：移植组脱落2只，对照组脱落1只。细胞移植4周后与对照组比较，移植组胶原纤维增生进程延缓，心肌胶原容积分数显著降低（P < 0.01），基质金属蛋白酶1，3 mRNA的表达呈下降趋势（t=4.45，P < 0.01），左心室收缩压、压力变化速率最大值均显著升高，左心室舒张末压显著下降（t=9.12，P < 0.01），血清脑钠素浓度明显降低（t=6.05，P < 0.05）。 结论：经冠状动脉移植自体骨髓单个核细胞，可能通过抑制基质金属蛋白酶的应激性改变而延缓心肌间质重塑中胶原代谢进程，有助于改善扩张型心肌病模型兔的心功能。     

自体骨髓间充质干细胞心肌移植后的分化及存活*☆

背景：骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后是否能迁移、分化及存活,目前尚不清楚。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后,在体内的迁移、分化及其存活。 方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞,体外DAPI标记细胞。结扎兔左前降支制作急性心肌梗死模型,造模成功后30只新西兰大耳兔抽签法分为骨髓间充质干细胞组和对照组,每组15只。骨髓间充质干细胞组于冠状动脉结扎后1 h在梗死周边区用微量注射器分4点注射自体骨髓间充质干细胞。对照组于相同部位注射等量生理盐水。每点注射体积30 μL。分别于移植后10 min,3 d,4周时各组各处死5只动物。取心脏行冰冻切片,荧光显微镜观察DAPI标记骨髓间充质干细胞的分布情况;免疫荧光法检测标记细胞是否表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ和α-肌动蛋白。 结果与结论：DAPI标记的骨髓间充质干细胞在兔急性心肌梗死模型心脏微环境中,蓝色细胞核分布广泛,呈椭圆形,似心肌细胞核,其排列方向与宿主心肌纤维方向一致,间接免疫荧光法检测胞浆心肌特异性蛋白肌钙蛋白Ⅰ、α-肌动蛋白均为阳性。说明缺血心肌内移植入骨髓间充质干细胞,可在局部微环境的刺激下向心肌细胞定向分化。     

同种异体骨髓间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死后心电生理异常和左室重构的影响

背景：目前干细胞移植修复梗死心肌及改善心脏功能这一作用已被接受,但移植细胞是否和宿主细胞形成有效的电-机械藕联,是否易形成一个有收缩功能的相对电独立体系,并产生移植后严重的恶性室性心律失常等尚缺乏系统观察。 目的：观察心肌梗死大鼠行同种异体骨髓间充质干细胞移植后,其心电生理异常及左室重构情况。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2005-12/2008-10在广西医科大学实验中心完成。 材料：健康Wistar大鼠120只,随机分为正常对照组、假手术组、盐水对照组、细胞移植组,30只/组。另取1月龄健康Wistar大鼠数只用于抽取骨髓。 方法：取体外培养的第3代大鼠骨髓间充质干细胞,加入诱导剂5-氮胞苷使之转化为心肌样细胞,在移植前2 h行DAPI标记。盐水对照组、细胞移植组大鼠结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,假手术组只穿线不结扎冠状动脉。结扎后7 d,细胞移植组将2×1010 L-1骨髓间充质干细胞分多点注射到心肌梗死的边缘区和中心区,其余3组注射等量生理盐水。 主要观察指标：体表ECG及心电生理检测,UCG检测左室功能,左室病理检查测定梗死面积,荧光显微镜下观察DAPI标记的供体细胞迁移、分布情况。 结果：骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为自发搏动的心肌样细胞,表达心肌特异性肌钙蛋白T,并形成肌丝结构。细胞移植后4,8,12周与盐水对照组比较,细胞移植组PR间期、QRS时限和心室有效不应期缩短,而室颤阈值增加(P < 0.05);左室收缩末期内径减小,左室射血分数、左室短轴缩短率均显著增加(P < 0.05);移植后8,12周心肌梗死面积明显缩小 (P < 0.05)。移植后4周,在荧光显微镜下梗死区可见DAPI标记带蓝色荧光的移植骨髓间充质干细胞细胞核,至12周仍然存在,但随移植时间延长荧光强度逐渐减弱。 结论：骨髓间充质干细胞具有分化为心肌样细胞的可塑性,同种异体骨髓间充质干细胞移植可有效改善心肌梗死后的心电生理异常和左室重构。     

经冠状动脉移植自体骨髓单个核细胞治疗犬急性心肌梗死

背景：近年的研究表明,细胞移植可以修复受损的心肌组织,促进缺血区域新生血管的形成,改善缺血心肌的灌注和收缩功能。 目的：观察自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植至犬心肌梗死模型后在体内的分化及对心功能的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2006-09/2008-04在天津泰达国际心血管病医院动物实验室完成。 材料：成年杂种犬16只,体质量15~25 kg,通过结扎冠状动脉前降支中段建立急性心肌梗死模型。 方法：16只杂种犬投币法随机分为移植组(n=10)和对照组(n=6),移植组于心肌梗死后2 h经冠状动脉内移植CM-DiI标记的骨髓单个核细胞;对照组注射等量生理盐水。冠状动脉结扎后2 h及6周时行超声心动图检查,移植后6周处死所有动物于梗死区及其邻近部位取材。 主要观察指标：①心肌梗死后6周两组心功能指标比较。②荧光显微镜下观察骨髓单个核细胞在心肌组织中的分化情况。③透射电镜观察移植组梗死区心肌组织的变化。 结果：纳入杂种犬16只,全部存活。左前降支结扎2 h后可见结扎点远端心肌组织变紫,室壁活动减弱,心电图出现ST段弓背样抬高。①对照组心肌梗死后6周和心肌梗死后2 h相比各项指标均无显著改善(P > 0.05)。移植组术后6周时左心室射血分数、左心室收缩期末内径及左心室短轴缩短率均较心肌梗死后2 h有明显改善(P < 0.01),其中左心室射血分数与对照组相比亦有明显改善(P < 0.05),移植组射血分数较对照组提高7%左右。②荧光显微镜下可见移植组自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植后可分布于梗死区及梗死周边区,并表达肌球蛋白重链;正常心肌组织及对照组心肌组织内未见移植细胞。③透射电镜下可见移植组分化完全的血管内皮细胞及类心肌样细胞。 结论：骨髓单个核细胞可在梗死区梗死周边区存活并逐渐分化成心肌样细胞,促进缺血心肌血管新生,改善心功能。     

兔椎间盘移植人骨髓间充质干细胞的实验观察

背景：国内外动物实验多是研究同种异体骨髓间充质干细胞的移植,但对人骨髓间充质干细胞在活体椎间盘内的存活情况还知之甚少。 目的：观察人骨髓间充质干细胞在兔椎间盘内的存活情况。 方法：选取新西兰大白兔15只,每只兔子的椎间盘被分为3组,即空白组(L1~2)、生理盐水组(L2~3)、绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组(L3~4,L4~5,L5~6)。空白组不注射,生理盐水组髓核内注射生理盐水25 μL,绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组注射1×109 L-1绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞生理盐水混悬液25 μL。移植后1,2,4,6,8周取材,荧光显微镜观察荧光细胞的分布情况及其数量。 结果与结论：绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组移植后1,2,4,6,8周标本切片,髓核内均可见绿色荧光细胞。移植后6,8周的荧光细胞数量明显少于移植后1,2,4周(P < 0.001)。提示移植后8周以内,人骨髓间充质干细胞可在兔椎间盘内存活。     

同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植：急性心肌梗死后血管新生及相关细胞因子的变化*☆

背景：骨髓间充质干细胞移植途径主要包括外周静脉注射移植、冠状动脉移植以及心肌内注射移植,但存在迁移缺少靶向性,价格高昂等局限性。 目的：观察同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植兔急性心肌梗死后梗死区血管新生及相关细胞因子的变化。 方法：提取兔骨髓进行骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化、扩增、鉴定,并标记。将55只兔随机分为正常组与手术组。手术组急性心肌梗死后1周,再随机分为3组：穴位注射干细胞组、模型对照组、穴位注射生理盐水组。5周后,取心肌组织进行免疫组织化学BrdU染色、心肌特异性肌钙蛋白T免疫组织化学染色检测;免疫组织化学法检测梗死心肌组织血小板内皮细胞黏附因子1水平;免疫组织化学法、夹心酶联免疫法、RT-PCR法、Western-Blot法检测血管内皮细胞生长因子及免疫组织化学法检测碱性成纤维细胞生长因子。 结果与结论：穴位注射的骨髓间充质干细胞可迁移至梗死区,并可以在梗死区分化为心肌样细胞。与模型对照组及穴位注射生理盐水组比较,穴位注射骨髓间充质干细胞可使梗死区及周围组织血小板内皮细胞黏附因子1表达上调,诱导梗死区及周围组织血管新生,其机制是刺激心肌组织中碱性成纤维细胞生长因子表达上调。穴位注射骨髓间充质干细胞组梗死心肌组织中和血清中血管内皮细胞生长因子表达均无上调趋势,因此推测,血管新生由碱性成纤维细胞生长因子及未知因素诱导。     

骨髓单个核细胞移植对心肌基质细胞衍生因子1-CXCR4轴的影响

背景：心脏干细胞移植后心肌基质细胞衍生因子1-CXCR4轴表达及其作用越来越受到人们的关注。 目的：观察经心外膜注骨髓单个核细胞对心衰犬心脏基质细胞衍生因子1-CXCR4轴 mRNA表达的影响。 方法：16只杂种犬随机数字表法均分为移植组和对照组,植入永久起搏器。右室快速起搏三四周后建立心衰模型。移植组犬经心外膜多点注射骨髓单个核细胞悬液,对照组注射等量生理盐水。 结果与结论：快速起搏三四周后,各项超声参数及血流动力学参数较起搏前改变明显,差异有显著性意义。定量PCR检测细胞移植组基质细胞衍生因子1 mRNA及CXCR4 mRNA表达水平高于对照组(P < 0.01)。说明经心外膜注射的骨髓单个核细胞可提高心肌基质细胞衍生因子1 mRNA及CXCR4 mRNA表达水平。     

经冠脉移植自体骨髓单个核细胞对犬梗死心肌的修复作用

背景：细胞移植治疗心肌梗死为重建受损心肌带来希望,但移植后的细胞分化以及细胞移植能否长期持久地改善心脏功能等问题均不明确。 目的：观察骨髓单个核细胞经冠状动脉移植入犬梗死心肌后,在心肌组织的分布、分化情况以及对心功能的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-07/2008-03在泰达国际心血管病医院完成。 材料：成年杂种犬16只,随机分为细胞移植组10只、模型对照组6只。 方法：细胞移植组于髂前上嵴或髂后上棘穿刺抽取骨髓,经Ficoll密度梯度离心法分离获取骨髓单个核细胞,行CM-DiI标记。两组犬均结扎冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型,于心肌梗死后2 h,细胞移植组向心肌梗死区注射骨髓单个核细胞悬液1 mL(3×107~1×108个细胞),模型对照组注射等量生理盐水。 主要观察指标：血流动力学指标及超声心动图指标的变化,免疫荧光染色观察骨髓单个核细胞在心脏的迁移、分布及分化。 结果：与模型对照组比较,细胞移植后6周细胞移植组血流动力学指标左室舒张末压显著降低(P < 0.01),心排出量明显升高(P < 0.05);超声心动图指标左室收缩末容积、左室舒张末容积均得到显著改善(P < 0.01),射血分数、每搏输出量亦明显改善(P < 0.05)。自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植后,可分布于心肌梗死区及梗死周边区,并表达肌球蛋白重链、连接蛋白43。 结论：自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植后可分化为心肌样细胞,改善急性心肌梗死后的心功能。     

兔自体骨髓间充质干细胞移植联合激光心肌血运重建治疗急性心肌缺血

背景：应用骨髓间充质干细胞移植修复坏死心肌，改善心脏功能已受到广泛关注。最近有报道指出激光具有促进骨髓间充质干细胞治疗心肌缺血的作用。 目的：观察兔自体骨髓间充质干细胞移植联合激光心肌血运重建治疗急性心肌缺血的效果。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006-01/07在安贞医院外科实验室完成。 材料：成年雄性新西兰大白兔32只，随机分为4组：模型对照组、细胞移植组、激光组、联合组，8只/组。 方法：造模前3 d，经兔双侧胫骨穿刺抽取骨髓，经密度梯度离心和换液法分离纯化骨髓间充质干细胞，并行BrdU标记。各组兔均在全麻下结扎冠状动脉前降支建立急性心肌缺血模型，2周后，模型对照组在标记部位分3点注射0.6 mL α-MEM培养基；细胞移植组同法注射等量第4代骨髓间充质干细胞悬液，细胞总数约3×106个；激光组应用高功率CO2治疗仪进行激光心肌打孔3个，功率为5 J；联合组在标记点先行激光打孔，再在孔道周围心肌中层注射等量细胞悬液。 主要观察指标：治疗4周后取出心脏，采用抗BrdU及抗肌钙蛋白T双重免疫组化染色检测骨髓间充质干细胞在梗死区心肌存活及分化情况，采用抗CD146免疫组化染色测定毛细血管密度，通过超声测定左室射血分数，通过计算心尖部位位移趋势及运动速度(应变)评价心肌阶段运动功能。 结果：细胞移植组、联合组均检出岛状分布的双染阳性细胞，胞核呈黑色、胞浆呈棕色。与模型对照组比较，细胞移植组、激光组、联合组治疗区血管密度均显著增加(P均< 0.05)，且联合组增加幅度明显高于细胞移植组、激光组(P均< 0.05)，细胞移植组、激光组血管密度基本相似。与治疗前比较，治疗后4周细胞移植组、联合组左室射血分数、心尖段位移和应变值均明显改善(P < 0.05)，且与模型对照组、激光组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。 结论：兔自体骨髓间充质干细胞可在心肌微环境内存活并分化为心肌样细胞，移植后联合激光心肌血运重建在增加心肌毛细血管密度方面优于单纯细胞移植或激光心肌血运重建治疗，在提高心脏功能方面的优势尚需进一步分析。     

人脐血单个核细胞静脉移植心肌梗死模型兔心肌组织肿瘤坏死因子α的表达

背景：有报道指出心肌梗死部位及其周围区域炎性细胞浸润和炎性因子渗出,参与心室重构、心功能损害的发生和发展,干细胞移植治疗心肌梗死与移植干细胞抑制心肌梗死后局部炎症反应相关。 目的：探讨静脉移植人脐血单个核细胞对兔心肌梗死后心肌组织炎症反应及炎性因子肿瘤坏死因子α表达的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-02/12在中南大学湘雅医院医学实验研究中心和中南大学实验动物学部完成。 材料：6份脐血来自中南大学湘雅医院产科身体健康足月分娩的产妇。健康纯种中国家兔45只,随机分为细胞移植组、模型组、假手术组,15只/组。 方法：Ficoll法分离培养人脐血单个核细胞,传至第2代用于移植,移植前24 h行BrdU标记,调整浓度至0.04×1013 L-1。细胞移植组、模型组兔结扎冠状动脉左前降支建立急性心肌梗死模型,假手术组兔左前降支穿线不结扎。造模后24 h,细胞移植组经耳缘静脉注入0.5 mL人脐血单个核细胞悬液,含2×107个人脐血单个核细胞;模型组、假手术组同法注入等量生理盐水。分别于细胞移植后1,2,4周取材。 主要观察指标：超声心动图测量结果,心肌组织切片白细胞计数,免疫组化检测心肌BrdU阳性细胞及肿瘤坏死因子α的表达水平,RT-PCR法检测心肌肿瘤坏死因子αmRNA的表达。 结果：与模型组比较,移植后1,2,4周细胞移植组心功能明显改善,左室短轴缩短率及左室射血分数均明显升高(P < 0.05);各时间点细胞移植组白细胞数均明显降低(P < 0.05)。移植后第4周,假手术组心肌细胞无肿瘤坏死因子α表达;模型组可见明显肿瘤坏死因子α表达;细胞移植组肿瘤坏死因子α表达程度明显减弱,且呈黄褐色的BrdU阳性细胞散在分布于梗死周边区域。与模型组比较,移植后1,2,4周细胞移植组肿瘤坏死因子αmRNA的表达水平均明显降低(P < 0.05)。 结论：静脉移植人脐血单个核细胞可改善兔心肌梗死后心功能,抑制心肌组织肿瘤坏死因子α表达,减轻心肌梗死后局灶性炎症反应。