基于Caspase-3/PARP通路探究龟鹿二仙胶及拆方对IL-1β诱导的退变软骨细胞凋亡及细胞外基质的影响

目的 基于半胱氨酸蛋白酶3/多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Caspase-3/PARP)通路探究龟鹿二仙胶及拆方对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的退变软骨细胞凋亡及细胞外基质(ECM)的影响。方法 采用SD大鼠制备空白血清、龟鹿二仙胶含药血清、龟甲胶含药血清及鹿角胶含药血清,采用酶消法体外培养C57BL/6小鼠软骨细胞。将软骨细胞分为5组,空白组加入空白血清培养,模型组加入IL-1β和空白血清培养,龟鹿组加入IL-1β和龟鹿二仙胶含药血清培养,龟板组加入IL-1β和龟甲胶含药血清培养,鹿角组加入IL-1β和鹿角胶含药血清培养,干预24 h后,采用CCK-8法检测软骨细胞活性,采用TUNEL法检测软骨细胞凋亡情况,采用免疫荧光染色法检测Caspase-3、PARP-1表达情况,分别采用Western blot和qRT-PCR法检测细胞中Caspase-3、PARP-1、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)蛋白及mRNA表达情况。结果 与空白组比较,模型组软骨细胞活性明显降低(P<0.05),软骨细胞凋亡率明显升高(P<0.05);细胞中Cas...     

活血通络药物对膝骨关节炎小鼠凋亡软骨细胞体外干预的影响

目的 体外培养膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)小鼠凋亡软骨细胞模型,对凋亡软骨细胞模型进行形态学观察和鉴定,传代培养第一代凋亡软骨细胞模型.培养成功后,分别以不同浓度的骨痹合剂以及氨糖美辛、生理盐水干预后,进行形态学观察和绘制细胞生长曲线,确定凋亡软骨细胞变化最明显的时间点以及促进凋亡软骨细胞增殖的最佳给药浓度,观察活血通络药物对凋亡软骨细胞的影响.方法 取SPF级小鼠80只,20只用于软骨细胞取材,60只用于含药血清制备.首先取正常小鼠、KOA造模小鼠各10只,处死后取软骨细胞,对原代细胞进行传代培养,培养成功后对小鼠正常软骨细胞和小鼠KOA退变软骨细胞进行形态特征染色观察以及细胞比较鉴定.取SPF小鼠60只,随机分为骨痹合剂组、氨糖美辛组、生理盐水组,每组20只,分别以3种药物灌胃3d后取含药血清保存备用.以第一代软骨细胞,加入5％、10％、20％不同浓度骨痹合剂、氨糖美辛、生理盐水含药血清进行细胞干预,2、4、6、8 d后,同时观察3组血清不同药含药浓度分别对凋亡软骨细胞模型增殖的影响.结果 由甲苯胺蓝染色后发现,正常软骨细胞以及KOA软骨细胞均成功培养及传代.检测后发现,KOA模型分离出的软骨细胞凋亡程度较高.经含药血清干预后发现,骨痹合剂和氨糖美辛均抑制细胞凋亡,促进细胞增殖,对细胞起保护作用.经MTT检测后发现骨痹合剂组中,10％含药血清相对于5％和20％含药血清浓度更加促进细胞增殖,说明10％含药血清浓度相对为最佳浓度,2d的时间点各组增殖变化最为明显.结论 10％的含骨痹合剂血清相较其余组别可更好地抑制小鼠KOA软骨细胞凋亡,促进软骨细胞增殖.     

风寒湿血清影响软骨细胞TRPM8/TRPV1/TRPA1表达的研究

目的 基于中医风寒湿致痹理论，探索软骨细胞温感蛋白TRPM8/TRPV1/TRPA1在风寒湿血清干预后的的表达情况。方法 采用改良Hulth法结合人工气候箱制备风寒湿血清用以后续干预，取新生SD大鼠软骨细胞结合白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)构建软骨细胞炎症；细胞分组：Control组、KOA组(IL-1β 20ng/ml)、NC组(IL-1β 20ng/ml+正常大鼠血清10%)、FHS组(IL-1β 20ng/ml+风寒湿大鼠血清10%);CCK8法检测风寒湿血清干预后软骨细胞的增殖活性，甲苯胺蓝及阿利新蓝染色鉴定软骨细胞形态，RT-qPCR与Western blot检测软骨细胞炎性因子及TRPA1、TRPM8、TRPV1基因蛋白的表达。结果 风寒湿血清浓度≥20%能显著抑制软骨细胞的增长，10%的血清浓度干预24h、48h对软骨细胞活力无明显影响；Western blot显示，风寒湿血清干预组TRPM8、TRPV1、TRPA1、TNFα、IL-1β、TNFα蛋白表达量明显升高(P<0.05);RT-qPCR显示，风寒湿血清干预组IL-1β、TNFα...     

独活寄生汤含药血清抑制白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症反应的作用机制研究

目的:探讨独活寄生汤含药血清抑制白细胞介素1β(interleukin-1 beta,IL-1β)诱导的软骨细胞炎症反应的作用机制。方法:将10只2月龄雄性SD大鼠随机分为正常组和独活寄生汤组,独活寄生汤组以9.3 g·kg~(-1)剂量的独活寄生汤灌胃,正常组给予等量生理盐水灌胃;每日灌胃2次,连续1周;末次灌胃后,经腹主动脉取血,分别制备独活寄生汤含药血清及空白血清,低温保存备用。截取6只4周龄SD大鼠膝关节软骨,采用酶消化法分离并培养软骨细胞,光学显微镜下观察软骨细胞形态,并用Ⅱ型胶原酶免疫组化鉴定。取生长良好的第2代软骨细胞,采用MTT法检测含药血清培养24 h、36 h、48 h、72 h后的软骨细胞活性,采用酶联免疫吸附法测定不同浓度IL-1β干预后软骨细胞的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-13含量。将培养好的第2代软骨细胞随机分为空白血清组、模型组、独活寄生汤含药血清组,其中空白血清组以含10%空白血清的培养基(dulbecco modified eagle medium,DMEM)培养;模型组加入浓度为15 ng·m L~(-1)的IL-1β干预24 h后,采用含10%空白血清的DMEM培养;独活寄生汤含药血清组加入浓度为15 ng·m L~(-1)的IL-1β干预24 h后,采用含10%独活寄生汤含药血清的DMEM培养;3组均连续培养48 h,采用Western blot法检测软骨细胞中G蛋白偶联信号传导系统关键调控因子的蛋白表达情况。结果:(1)软骨细胞形态及免疫组化鉴定结果。第2代软骨细胞胞浆丰富,细胞周围可见具有折光性的细胞外基质,细胞长势呈"铺路石"状,胞浆呈棕黄色阳性染色。(2)独活寄生汤含药血清培养不同时间后的软骨细胞活性。含药血清培养24 h、36 h、48 h、72 h后的软骨细胞活性比较,差异有统计学意义(1.01±0.01,1.03±0.02,1.07±0.01,1.02±0.02,F=8.300,P=0.008)。含药血清培养24 h时的软骨细胞活性低于培养48 h时的软骨细胞活性(t=-4.648,P=0.002);与培养36 h、72 h时的软骨细胞活性比较,差异无统计学意义(t=-1.549,P=0.160;t=-0.775,P=0.461)。(3)不同浓度IL-1β干预后的MMP-13含量。在含IL-1β浓度为0 ng·m L~(-1)、5 ng·m L~(-1)、10 ng·m L~(-1)、15 ng·m L~(-1)、20 ng·m L~(-1)、25 ng·m L~(-1)的DMEM中培养24 h后软骨细胞MMP-13含量比较,差异有统计学意义[(0.07±0.01)ng·m L~(-1),(0.08±0.01)ng·m L~(-1),(0.09±0.01)ng·m L~(-1),(0.10±0.01)ng·m L~(-1),(0.08±0.01)ng·m L~(-1),(0.06±0.01)ng·m L~(-1),F=6.823,P=0.001]。未经IL-1β干预时的软骨细胞MMP-13含量与浓度为5 ng·m L~(-1)、20 ng·m L~(-1)、25 ng·m L~(-1)的IL-1β干预后软骨细胞MMP-13含量比较,差异均无统计学意义(LSD-t=-2.049,P=0.055;LSD-t=-2.083,P=0.052;LSD-t=0.496,P=0.626);浓度为10 ng·m L~(-1)、15 ng·m L~(-1)的IL-1β干预后软骨细胞MMP-13含量高于未经IL-1β干预时的软骨细胞MMP-13含量(LSD-t=-3.412,P=0.003;LSD-t=-4.216,P=0.001);浓度为10 ng·m L~(-1)的IL-1β干预后软骨细胞MMP-13含量与浓度为15 ng·m L~(-1)的IL-1β干预后软骨细胞MMP-13含量比较,差异无统计学意义(LSD-t=-0.804,P=0.432)。(4)软骨细胞中G蛋白偶联信号传导系统关键调控因子的蛋白表达。空白血清组、模型组和独活寄生汤含药血清组的Gαs、Gαq、Gαo和Gαi蛋白表达量比较,组间差异均有统计学意义[(0.81±0.09)k Da,(0.31±0.07)k Da,(0.78±0.13)k Da,F=23.669,P=0.001;(0.22±0.04)k Da,(0.14±0.02)k Da,(0.20±0.02)k Da,F=6.500,P=0.031;(0.25±0.02)k Da,(0.12±0.01)k Da,(0.18±0.03)k Da,F=27.214,P=0.001;(0.21±0.02)k Da,(0.26±0.02)k Da,(0.19±0.03)k Da,F=6.882,P=0.028];空白血清组Gαs、Gαq、Gαo蛋白表达量高于模型组(LSD-t=6.134,P=0.001;LSD-t=7.370,P=0.000;LSD-t=3.465,P=0.013),Gαi蛋白表达量低于模型组(LSD-t=2.572,P=0.042);模型组Gαs、Gαq、Gαo蛋白表达量低于独活寄生汤含药血清组(LSD-t=5.766,P=0.001;LSD-t=3.401,P=0.014;LSD-t=2.599,P=0.041),Gαi蛋白表达量高于独活寄生汤含药血清组(LSD-t=3.609,P=0.011)。结论:独活寄生汤含药血清可以抑制IL-1β诱导的软骨细胞炎症反应,其作用机制可能与G蛋白偶联信号传导系统的调控有关,但其具体作用靶点有待进一步深入研究。     

大鼠电针后血清对肿瘤坏死因子α诱导凋亡软骨细胞Erk1/2、C-Myc、C-Fos和C-Jun基因表达的影响

目的观察大鼠电针后血清对肿瘤坏死因子α诱导凋亡软骨细胞Erk1/2、C-Myc、C-Fos和C-Jun表达的影响。方法应用随机数字表法将2月龄大鼠分为3组,经干预后,制备正常组、电针15 min组和电针30 min组血清。用Ⅱ型胶原酶消化法获取4周龄SD大鼠膝关节软骨细胞,应用随机数字表法将软骨细胞分为正常组、模型组、电针15 min组、电针30 min组。正常组予正常组血清干预,模型组予含10 ng/m L肿瘤坏死因子α(TNFα)的正常组血清诱导软骨细胞凋亡,电针15 min组和电针30 min组分别予含10 ng/m LTNFα的电针15 min组和电针30 min组血清进行干预。Annexin V-FITC/PI双染法检测各组软骨细胞凋亡率,实时荧光定量PCR法检测各组Erk1/2、C-Myc、C-Fos和C-Jun m RNA的表达。结果 (1)软骨细胞凋亡率:模型组细胞凋亡率较正常组明显增多(P0.05),电针15、30 min组凋亡率较模型组明显减少(P0.05)。(2)相关基因检测:与正常组比较,模型组Erk1/2、C-Myc、C-Fos、C-Jun m RNA的表达显著升高(P0.05);与模型组比较,电针15min组与电针30min组的Erk1/2、C-Myc、C-Fos、C-Jun m RNA表达显著降低(P0.05)。结论大鼠电针后血清能有效抑制TNFα诱导的软骨细胞凋亡,其机制与抑制Erk1/2、C-Myc、C-Fos、C-Jun m RNA表达有关。     

珍骨胶囊对兔关节退变软骨细胞增殖的影响

目的研究珍骨胶囊含药血清对新西兰大白兔退变软骨细胞的调节作用。方法用含药血清、空白血清对大白兔退变软骨细胞干预,用MTT法检测含药血清组、空白组对软骨细胞增殖的影响。结果含药血清组细胞随血清浓度的增加而加快增殖速度,与同浓度空白血清组比较有显著性差异(P0.05)。结论珍骨胶囊含药血清能促进体外培养退变软骨细胞迅速进入增殖周期,促进软骨细胞的增殖。     

补肾壮筋汤含药血清对力学刺激诱导软骨细胞凋亡的影响

目的探讨补肾壮筋汤含药血清对力学刺激诱导软骨细胞凋亡的影响。方法提取兔补肾壮筋汤含药血清,将软骨细胞培养基分为普通培养基组、空白兔血清培养基组(空白培养基组)及补肾壮筋汤培养基组(含药培养基组),对各组软骨细胞进行四点弯曲机械应力加载诱导凋亡。收集软骨细胞,流式细胞仪测定软骨细胞的凋亡率,并测定相应培养基中的IL-1β和NO的含量。结果含药培养基组中软骨细胞的凋亡[(19.55±7.98)%]比普通培养基组[(39.32±13.45)%]及空白培养基组[(37.87±9.67)%]低,差异有统计学意义(P<0.05);含药培养基组IL-1β和NO含量也低于其他两组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论补肾壮筋汤含药血清对应力加载诱导软骨细胞的凋亡具有保护作用。     

透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞线粒体凋亡通路的影响

目的:探讨透骨消痛胶囊含药血清影响软骨细胞线粒体凋亡通路的作用机制。方法:SD大鼠膝关节软骨建立体外培养的软骨细胞,Ⅱ型胶原原位杂交鉴定。第3代软骨细胞培养72h,SNP诱导软骨细胞凋亡,采用含药血清干预凋亡软骨细胞,Hocehst 33342染色检测软骨细胞的凋亡率,Real time RT-PCR检测Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3 mRNA表达。结果:干预24h,软骨细胞的OD值,对照组、实验2组、实验3组明显高于空白组(P<0.05);软骨细胞Bcl-2mRNA表达,对照组、实验2组、实验3组明显高于空白组(P<0.05);软骨细胞Bax、Caspase-9、Caspase-3 mRNA表达,对照组、实验2组、实验3组明显低于空白组(P<0.05)。结论:透骨消痛胶囊含药血清能下调软骨细胞促凋亡基因Bax、Caspase-9、Caspase-3表达,上调抗凋亡基因Bcl-2表达,抑制软骨细胞线粒体凋亡通路的信号转导。     

加味通幽汤对食管癌Eca-109细胞mTOR/HIF-1α通路及肿瘤缺氧相关因子的影响

目的研究加味通幽汤对食管癌Eca-109细胞雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/缺氧诱导因子1α(HIF-1α)通路及肿瘤缺氧相关因子的影响及干预机制。方法采用加味通幽汤、生理盐水分别灌胃大鼠14 d制备含药和对照血清。实验分为常氧组、缺氧组、常氧含药血清组和缺氧含药血清组,常氧组加入10%对照大鼠血清培养;缺氧组加入10%对照大鼠血清、10%CoCl 2缺氧诱导液培养;常氧含药血清组加入10%含药大鼠血清培养;缺氧含药血清组加入10%含药大鼠血清、10%CoCl 2缺氧诱导液培养。Western blot法检测各组中mTOR、HIF-1α及血管内皮生长因子(VEGF)、骨桥蛋白(OPN)、血管内皮细胞钙黏连蛋白(VE-cadherin)表达情况;实时荧光定量RT-PCR法检测各组中mTOR、HIF-1α、VEGF、OPN、VE-cadherin mRNA表达情况;免疫荧光法分析各组中VE-cadherin与HIF-1α共表达情况。结果Western blot分析显示,缺氧组细胞中mTOR、HIF-1α、VEGF、OPN、VE-cadherin蛋白表达水平均显著高于常氧组(P均<0.05),缺氧含药血清组mTOR、HIF-1α、VEGF、OPN、VE-cadherin蛋白表达水平均显著低于缺氧组(P均<0.05)。实时荧光定量RT-PCR检测显示,缺氧组细胞中mTOR、HIF-1α、VEGF、OPN、VE-cadherin mRNA相对表达水平显著高于常氧组(P均<0.05),缺氧含药血清组mTOR、HIF-1α、VEGF、OPN、VE-cadherin mRNA相对表达水平显著低于缺氧组(P均<0.05)。免疫荧光结果显示,缺氧组HIF-1α与VE-cadherin荧光强度较常氧组明显增强,缺氧含药血清组HIF-1α与VE-cadherin荧光强度较缺氧组均显著降低。结论加味通幽汤可显著抑制缺氧微环境下食管癌Eca109细胞mTOR/HIF-1α通路及肿瘤缺氧相关因子VEGF、OPN和VE-cadherin蛋白和mRNA表达。     

右归丸对肝肾亏虚型退变髓核细胞活力及相关炎性因子表达的影响

目的:研究右归丸含药大鼠血清对肝肾亏虚型退变髓核细胞活性及IL-1、TNF-α表达的影响。方法:选取48只雌雄各半质量为180～220 g SD大鼠,按随机数字表法分为空白对照组、桃红四物汤组及右归丸组,各组药物干预后取血清冻存备用。选3例辨证肝肾亏虚型的腰椎间盘突出且需要手术的患者,获取髓核组织细胞并进行细胞培养。各组冻存的含药血清分别配置成5%、10%、20%浓度梯度干预髓核细胞,运用MTT法获取细胞OD值并制作细胞生长曲线,选取各组最佳含药血清浓度。将2代髓核细胞分为空白血清组、桃红血清组、右归血清组。选用各组最佳浓度血清分别连续干预3、7、14 d, Western Blot检测2代髓核细胞中IL-1、TNF-α的表达水平。结果:10%空白血清、20%桃红四物汤含药血清及20%右归丸含药血清有利于髓核细胞生长。分别在第3、7、14天与空白血清组比较,桃红血清组、右归血清组髓核细胞中IL-1、TNF-α的表达水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05),且右归血清组相比桃红血清组IL-1、TNF-α降低更加明显,差异有统计学意义(P0.05)。结论:右归丸大鼠含药血清干预肝肾亏虚型退变髓核细胞可显著提高细胞增殖活力,下调炎性因子IL-1、TNF-α的表达,右归丸含药血清干预肝肾亏虚型退变髓核细胞效果优于桃红四物汤含药血清,从侧面进一步论证了辨证论治理论的科学性。     

抗纤软肝颗粒对肝星状细胞整合素α5β1蛋白表达的影响

目的观察抗纤软肝颗粒对肝星状细胞整合素α5β1、蛋白表达的影响。方法运用细胞培养技术,以HSC-T6细胞系为研究对象,分为空白包被+10%生理盐水组,纤维连接蛋白(FN)+10%生理盐水组,FN+5%抗纤软肝颗粒含药血清(KXR)组,FN+10%KXR组,FN+20%KXR组。按以上分组进行药物干预,干预后继续培养48h。采用MTT法检测细胞增殖,甲苯胺蓝染色方法测定细胞黏附率,流式细胞仪测定HSC凋亡;应用免疫细胞组织化学方法检测整合素α5β1蛋白的表达。结果抗纤软肝颗粒含药血清组HSC的整合素α5β1蛋白表达显著下调,与对照组及FN组相比有显著性差异(P0.05,P0.01)。结论抗纤软肝颗粒能够下调HSC整合素α5β1的表达,可能是其阻抑整合素信号转导的位点之一。     

抗骨增生胶囊含药血清对大鼠软骨细胞增殖凋亡及基质金属蛋白酶分泌的影响

目的:考察抗骨增生胶囊含药血清对大鼠软骨细胞增殖凋亡和基质金属蛋白酶分泌的影响。方法:大鼠灌胃制备抗骨增生胶囊含药血清,骨性关节炎软骨原代细胞培养,采用CCK-8法测定抗骨增生胶囊含药血清对骨性关节炎软骨细胞增殖的影响,采用Annexin V法测定抗骨增生胶囊含药血清对骨性关节炎软骨细胞凋亡的影响,采用ELISA法检测MMP-1、MMP-3和MMP-13。结果:培养24、36和48 h后,抗骨增生胶囊含药血清低、中、高组和硫酸氨基葡萄糖组OD值均显著高于对照组(P0.05);抗骨增生胶囊含药血清低、中、高组和硫酸氨基葡萄糖组早期凋亡率和总凋亡率均显著低于对照组(P0.05);各组MMP-3无统计学差异(P0.05);抗骨增生胶囊含药血清低、中、高组和硫酸氨基葡萄糖组MMP-1和MMP-13均显著低于对照组(P0.05);结论:抗骨增生胶囊含药血清可通过降低软骨细胞凋亡率增加细胞的增殖率,抑制MMP-1和MMP-13分泌从而保护软骨组织。     

宁心痛颗粒及其有效组分抑制HSP60诱导的THP-1细胞炎症反应的实验研究

目的观察NF-κB、MAPKs信号通路在介导重组人热休克蛋白60(HSP60)诱导巨噬细胞(Mφ)炎症反应中的作用,探讨益气活血方宁心痛颗粒的抗炎机制。方法采用人急性单核白血病细胞株(human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)体外培养模型,结合血清药理学与中药组分配伍方法进行论证。将THP-1细胞诱导分化为Mφ,分为对照组(Mφ+培养液)、HSP60(10μg/mL)组、黄芪多糖(APS,200μg/mL)组、藁本内酯(LIG,20μg/mL)组、APS(200μg/mL)+LIG(20μg/mL)组、含药血清(3%)组、辛伐他汀(15μg/mL)组,各药物干预组以相应治疗药物预处理24h后,除对照组外,其余各组均加入终浓度为10μg/mL的HSP60。检测磷酸化的NF-κB(p-NF-κB)、MAPKs[包括p-p38、胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)]蛋白表达及TNF-α、IL-6含量。结果与对照组比较,HSP60组的p-NF-κB及p-p38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达和TNF-α、IL-6含量升高(P0.01);与HSP60组比较,各药物干预组检测蛋白表达和TNF-α、IL-6含量均降低(P0.05,P0.01);与APS组比较,APS+LIG组、含药血清组和辛伐他汀组检测蛋白表达和TNF-α、IL-6含量均降低(P0.05,P0.01);与LIG组比较,APS+LIG组检测蛋白表达均降低(P0.05,P0.01),TNF-α、IL-6含量差异无统计学意义(P0.05),含药血清组和辛伐他汀组检测蛋白表达及TNF-α、IL-6含量均降低(P0.05,P0.01);含药血清组和辛伐他汀组均较APS+LIG组蛋白表达和TNF-α、IL-6含量降低更明显(P0.05,P0.01),且辛伐他汀组降低蛋白表达的效果优于含药血清组(P0.01)。结论 NF-κB及MAPKs信号通路是HSP60诱导THP-1源性Mφ发生炎症反应的关键信号通路,宁心痛颗粒含药血清、APS、LIG、APS配伍LIG可不同程度通过调控以上通路发挥抗炎效果,其中宁心痛颗粒含药血清的效果最强。     

痛痹方血清对体外培养乳兔关节软骨细胞增殖和MMP-3与TIMP-1的影响

目的观察痛痹方含药血清对体外培养的乳兔关节软骨细胞和MMP-3与TIMP-1的影响。方法采用体外培养的乳兔软骨细胞为干预对象,并加入10μg/LIL-1建立变性软骨细胞损伤模型,制备痛痹方含药血清作为干预措施,培养48h后,采用MTT比色法检测软骨细胞增殖,ELISA法测定分离的上清培养液中MMP-3和TIMP-1含量。结果不同浓度的痛痹方含药血清均能拮抗IL-1抑制软骨细胞增殖,降低MMP-3/TIMP-1,与空白血清对照均有显著性差异(P<0.01)。结论痛痹方血清能拮抗IL-1抑制软骨细胞增殖,下调软骨细胞MMP-3/TIMP-1。     

温肾壮阳方含药血清调控HIF-1α/VEGF通路对髓核细胞凋亡与增殖的影响

目的 探讨温肾壮阳方含药血清对髓核细胞凋亡、增殖及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/血管内皮生长因子(VEGF)通路的影响。方法 将25只SD雄性大鼠随机分为5组，分别用生理盐水、依托考昔溶液及低、中、高浓度温肾壮阳方进行灌胃7 d制备相应含药血清。取人髓核细胞，实验分为6组：空白对照组用正常大鼠血清培养，缺氧造模组用300μmol/L氯化钴(CoCl₂)溶液干预24 h诱导缺氧状态，依托考昔组用300μmol/L CoCl₂+依托考昔含药血清同时干预24 h,低、中、高浓度温肾壮阳方组分别用300μmol/L CoCl₂+相应浓度肾壮阳方含药血清同时干预24 h。采用CCK-8实验检测细胞生存率，采用Western blot法和qPCR法检测细胞中HIF-1α、VEGF、半胱天冬酶-1(Caspase-1)、p53蛋白与mRNA表达情况，流式细胞术检测髓核间充质干细胞(NPSCs)增殖情况。结果 缺氧诱导各组细胞存活率均明显低于空白对照组(P均<0.05),中浓度温肾壮阳方组、高浓度温肾壮阳方组的细胞存活率均明...     

消渴通痹颗粒对高糖诱导的HUVEC屏障功能的影响及保护作用

目的:观察益气活血中药消渴通痹颗粒对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)屏障功能及紧密连接蛋白(ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)表达的影响,探讨消渴通痹颗粒保护糖尿病周围神经病变内皮细胞屏障功能的作用及机理。方法:将不同浓度的消渴通痹颗粒含药血清和5.5 mmol/L葡萄糖作用于HUVEC 24 h,MTT法检测细胞的存活率,确定消渴通痹颗粒含药血清的给药浓度。根据葡萄糖的浓度和消渴通痹颗粒含药血清的浓度将实验分为正常对照组,高糖模型组和消渴通痹颗粒22.5 g/kg含药血清组。各组细胞传代8代～15代时,应用HRP检测HUVEC单层通透性;流式细胞术检测HUVEC凋亡;免疫荧光法、流式细胞术检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达。结果:与正常对照组相比,5%、10%消渴通痹颗粒22.5 g/kg含药血清组的存活率明显升高(P<0.05),15%、20%消渴通痹颗粒22.5 g/kg含药血清组的存活率明显下降(P<0.05或P<0.01),故而确定消渴通痹颗粒含药血清的浓度为5%、10%、15%。与正常对照组相比,高糖模型组单层通透性增加,凋亡率显著上升,ZO-1、Occludin蛋白的表达减少、荧光信号减弱、边缘粗糙、细胞与细胞之间的连接有断裂(P<0.05或P<0.01)。与高糖模型组相比,5%、10%消渴通痹颗粒22.5 g/kg含药血清组单层通透性降低,凋亡率下降,ZO-1、Occludin的蛋白表达上调、荧光信号加强、边缘趋于光滑、细胞与细胞之间连接紧密(P<0.05或P<0.01);15%消渴通痹颗粒22.5 g/kg含药血清组单层通透性降低,凋亡率下降,Occludin蛋白表达下调、荧光信号减弱(P<0.05或P<0.01),ZO-1蛋白表达变化不明显(P>0.05)。结论:益气活血中药消渴通痹颗粒改善了高糖诱导的HUVEC细胞屏障功能,其机制可能与增加紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达有关。     

健骨颗粒对成骨细胞分化的影响

目的:观察健骨颗粒对成骨细胞分化过程的影响。方法:取第3代SD大鼠颅骨成骨细胞,生理盐水血清组加入生理盐水血清;含药血清组加入最佳浓度的健骨颗粒颗粒含药血清;MTT法检测最佳含药血清浓度;运用采用ELISA法检测成骨细胞OCN的表达,采用比色法测羟脯氨酸(HYP)、碱性磷酸酶(AKP),实时荧光定量PCR-SYBR GREEN法检测核心结合因子(Cbfα1)、I型胶原(Col I)、成骨转录因子(OSX)mRNA的表达。取第4代细胞采用茜素红染色法染色矿化结节。结果:MTT法检测显示含药血清最佳浓度为20%;钙化结节观察显示含药20%组最先出现矿化结节,结节数量增多;含药血清组细胞液内OCN、AKP和HYP含量高于生理盐水血清组(P0.05);Real-time PCR检测结果显示含药血清组Cbfα1、ColⅠ、OSX基因mRNA的相对表达水平明显高于生理盐水血清组(P0.05)。结论:健骨颗粒含药血清能提高体外培养成骨细胞中矿化结节的数量、AKP、HYP、OCN的含量、ColⅠ、Cbfα1、OSX mRNA的表达,促进成骨细胞增殖,加快细胞分化。     

龟甲胶和鹿角胶含药血清对豚鼠骨关节炎软骨细胞JNK及p38 MAPK基因表达的影响

目的:通过实验观察龟甲胶、鹿角胶含药血清对豚鼠膝骨关节炎软骨细胞促增殖作用以及两种含药血清对JNK及p38 MAPK基因表达的影响,揭示龟甲胶及鹿角胶治疗膝骨关节炎的作用机制。方法:分别用龟甲胶、鹿角胶、盐酸氨基葡萄糖(GHC)含药血清及生理盐水对3月龄豚鼠骨关节炎软骨细胞进行干预,MTT法比较含药血清对软骨细胞的促增殖情况,QPCR检测含药血清干预后软骨细胞JNK及p38 MAPK基因的表达情况。结果:用含药血清浓度为5%的各组培养液干预后(时间72h),龟甲胶组、鹿角胶组、氨基葡萄糖组和空白对照组MTT法检测OD值分别为0.468±0.017,0.425±0.010,0.337±0.017,0.276±0.027,结果显示差异有统计学意义(P0.05)。QPCR检测龟甲胶组、鹿角胶组、盐酸氨基葡萄糖组和空白对照组JNK mRNA相对表达量分别为0.162±0.096,0.333±0.165,0.653±0.141,1.000±0.000,差异有统计学意义(P0.05)。QPCR检测龟甲胶组、鹿角胶组、盐酸氨基葡萄糖组和空白对照组p38MAPK mRNA相对表达量分别为0.058±0.025,0.229±0.057,0.441±0.090,1.000±0.000,结果显示差异有统计学意义(P0.05)。结论:龟甲胶和鹿角胶都能有效减少豚鼠骨关节炎软骨细胞JNK及p38 MAPK基因的表达,对软骨细胞作用为促增殖,对其凋亡产生抑制作用,从而一定程度上减缓骨关节炎的病损进展。     

解毒胶囊治疗乳腺癌的机制研究

目的观察解毒胶囊有效成分对乳腺癌相关特异性指标的影响,并分析其作用机制。方法解毒胶囊10×溶液对大鼠进行灌胃7次制备含药血清,以5%、10%、20%浓度对MCF-7细胞加药,并运用MTT法测定细胞增殖与抑制,采用Western blot法检测Bax、Bcl-2、ERα和PR蛋白的表达。结果与Serum组比较,5%浓度含药血清干预下的OD值升高,差异无统计学意义; 10%、20%浓度含药血清干预下的OD值均降低,差异有统计学意义(P <0. 05)。与Serum组比较,5%含药血清浓度干预下,ERα蛋白表达下降,差异无统计学意义,PR蛋白的表达量降低,有显著性差异(P <0. 05); 10%、20%含药血清浓度干预下,ERα、PR蛋白表达均明显下降,差异有统计学意义(P <0. 05)。与Serum组比较,Bax蛋白表达量明显升高,有显著性差异(P <0. 05); Bcl-2蛋白表达量显著下降,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论解毒胶囊可能是通过诱导病变细胞凋亡、改善性激素紊乱从而达到治疗乳腺癌的目的。     

风湿清对RANKL诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响

目的:通过观察风湿清(Fengshiqing,FSQ)含药血清对RAW264.7细胞向破骨细胞分化及细胞分泌骨免疫相关因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素-17(IL-17)的影响,初步探讨FSQ缓解类风湿性关节炎(RA)骨破坏的机制。方法:5%,10%,15%3个不同体积分数的FSQ含药血清与核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κBligand,RANKL)诱导的RAW264.7共孵育6 d,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察TRAP阳性多核细胞的形成;FSQ含药血清(5%,10%,15%)与白介素-1β(IL-1β)诱导的RAW264.7细胞共孵育24 h后收集细胞上清液,ELISA方法检测TNF-α和IL-17的含量。结果:RANKL诱导RAW264.7细胞形成TRAP阳性多核细胞,IL-1β诱导TNF-α和IL-17在RAW264.7细胞中异常高表达,5%～15%FSQ含药血清能剂量依赖地降低TRAP阳性细胞数;10%和15%的FSQ含药血清能显著抑制TNF-α(P<0.05)以及IL-17(P<0.01)的表达量。结论:FSQ能抑制破骨前体细胞向破骨细胞分化,降低TNF-α和IL-17在RAW264.7细胞中的异常高表达,这可能是FSQ抑制骨破坏治疗RA的作用机制之一。