变性高效液相色谱检测恶性肿瘤患者血浆DNA p53突变

目的 探讨扩增恶性肿瘤患者血浆DNA的可行性，建立一种快速检测血浆DNA突变的新方法。方法 选取恶性肿瘤患者共40例，采用Qiagen column柱抽提法提取血浆DNA，采用聚合酶链反应（PCR）扩增p53基因外显子7，用变性高效液相色谱法（DHPLC）对产物进行突变分析，并与测序结果比较。结果 40例恶性肿瘤患者血浆提取的DNA均能扩增出目的片断，DHPLC检测到有8例突变，随机送检的8份DHPLC未检测到突变者测序也未发现突变存在，与DNA直接测序结果相一致。结论 对恶性肿瘤患者血浆DNA行PCR扩增是可行的，DHPLC可作为一种快速，简便和经济的突变筛选方法，运用此方法检测血浆中p53等基因的突变有望应用于恶性肿瘤高危人群的预警和早期诊断以及作为预后参考。     

变性高效液相色谱检测乳腺癌患者血浆线粒体D环HVR2突变

目的 :探讨扩增乳腺癌患者血浆线粒体DNA(mito chondrialDNA ,mtDNA)的可行性 ,研究乳腺癌患者血浆线粒体DNA基因突变检测对于乳腺癌早期诊断及其预后的意义 .方法 :选取乳腺癌患者 10例 ,正常健康者 10人 ,提取血浆DNA ,采用聚合酶链反应 (PCR)扩增血浆线粒体DNA的D环HVR2 ,用两对引物扩增 ,用变性高效液相色谱法 (DHPLC)对产物进行突变筛选 .结果 :10例乳腺癌患者血浆提取的DNA能扩增出 11个目的片断 ,DHPLC检测到有 4例突变 ,正常健康者 10人扩增出 1例 .结论 :乳腺癌患者血浆DNA扩增与正常组有明显差异 (P <0 .0 5 ) ,血浆线粒体DNA基因突变检测对于乳腺癌早期诊断及预后有重要意义     

用变性高效液相色谱法检测遗传性因子XⅢA链基因突变

目的:观察变性高效液相色谱(DHPLC)法检测凝血因子XIIIA链基因突变的实用价值。方法:用聚合酶链反应(PCR)扩增正常样品和有XIIIA基因603-606delAAGA突变患者的XIIIA链基因外显子5;用单链构象多态性(SSCP)及DHPLC检测分析扩增的外显子5。结果:SSCP显示患者有异常的区带,患者的DHPLC结果出现异常洗脱峰,与SSCP的结果一致。结果表明DHPLC能检测FXIII因子A链基因突变。结论:DHPLC技术是一种筛查基因突变的快速、简单、可靠的方法。     

胃癌患者血浆DNA p53基因突变的检测

目的:探讨胃癌患者血浆循环核酸p53基因突变检测的可行性,研究基因突变与胃癌的发生、发展、预后的关系。方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增p53基因外显子7,用变性高效液相色谱技术(DHPLC)对产物进行突变分析,再与各生物参数进行相关性研究。结果:在34例胃癌患者中11例(32.4%)发生p53基因突变,突变率与组织类型、组织分化程度有关(P<0.05),与临床分期、淋巴结转移及远处转移无关(P>0.05)。结论:检测胃癌患者血浆循环核酸p53基因突变,对胃癌的恶性程度、预后评估有一定的临床价值。而DHPLC可作为一种快速简便的基因检测手段。     

肺腺癌患者血浆及尿中表皮生长因子受体突变研究

目的:分析血浆和尿中进行表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变检测的可行性。方法:利用改良酚-氯仿方法从血浆和尿中提取DNA,突变富集型PCR技术扩增EGFR外显子19和21,进行基因测序。结果:60例进展期肺腺癌患者中,血浆中检测出12例EGFR突变,其中外显子19缺失突变7例,外显子21点突变5例,尿标本中未检测出突变。血浆EGFR突变与性别相关,与年龄、吸烟史无相关。结论:在进展期肺腺癌患者血浆标本中可检测出EGFR突变,尿标本中未检测出EGFR突变。     

中国人腓骨肌萎缩症线粒体融合蛋白2基因突变分析

目的 分析线粒体融合蛋白2(MFN2)基因在中国人腓骨肌萎缩症的突变情况,建立快速、有效和经济的基因诊断方法 .方法 应用变性高效液相色谱(DHPLC)结合DNA直接测序的方法 ,对9个常染色体显性遗传的CMT2先证者和26个散发CMT2病例共35例患者进行MFN2基因编码区17个外显子及其侧翼区的突变检测.结果 在35例腓骨肌萎缩症患者中共检测到3种MFN2基因序列变异:c.281G→A,c.395G→A和c.408A→T,其中c.395G→A(C132T)为首次报道的致病突变,c.281G→A(R94Q)为已知致病热点突变,c.408A→T(V136V)为单核苷酸多态.DHPLC突变检测的敏感性和特异性为100%.结论 首次在国内应用DHPLC结合DNA直接测序对MFN2基因进行突变检测,发现2个致病突变和1个单核苷酸多态.DHPLC结合DNA直接测序法可准确有效地用于大规模MFN2基因突变筛查.     

Marfan综合征FBN1基因新的剪接位点的置换突变

目的 对Marfan综合征(MFS)患者的原纤维蛋白-1基因(FBN1)进行突变筛查,探讨MFS患者新的FBN1突变.方法 应用聚合酶链反应(PCR)和变性高效液相色谱法(DHPLC)对1例MFS患者FBN1的65个外显子进行突变筛查,对DHPLC图形异常的PCR扩增片段用DNA测序鉴定突变位点及性质.用限制性片段长度多态性分析法(RFLP)进一步证实突变.结果 发现1种新的FBN1剪接位点的置换突变(Intron29 4A＞T).结论 FBN1的Intron29 4A＞T可能为该MFS患者的发病原因.     

焦磷酸测序技术检测63例晚期NSCLC患者血浆KRAS基因突变

目的探讨应用焦磷酸测序技术检测血浆KRAS基因突变的实用性,了解晚期非小细胞肺癌(NSCLC)血浆KRAS基因突变率和突变特征。方法收集63例晚期NSCLC患者的外周血标本,分离血浆并提取DNA,采用巢式PCR结合焦磷酸测序分析KRAS基因12和13号密码子突变。结果在63例晚期NSCLC患者中,3例存在血浆KRAS基因突变(4.76%),突变率较低,与亚裔组织KRAS突变率一致,低于西方人KRAS突变率,其突变类型均为单碱基替换突变。其中2例为12密码子突变,1例为13密码子突变。统计学分析未发现血浆KRAS突变与性别、吸烟史、年龄、病理类型、肿瘤分期、体力状况(PS)评分存在相关性。结论焦磷酸测序技术操作简便,可以快速、高通量地进行外周血循环KRAS基因突变检测,可广泛用于筛选对酪氨酸激酶抑制剂耐药的NSCLC患者,更有利于指导患者的个体化分子靶向治疗。     

应用部分变性高效液相色谱技术检测胃癌组织、血清中基因突变的研究

目的:探讨部分变性高效液相色谱(DHPLC)在检测胃癌组织、血浆中基因突变中的应用.方法:应用DHPLC对39例胃癌组织及血清中p53基因突变进行检测,并测序验证.结果:本研究中p53基因的突变率为21%(8/39);其中肠型胃癌突变率40%(6/15)明显高于弥漫型胃癌8.33%(2/24)(P＜0.01);发现既往未见报道突变3例.血清标本中50%(4/8)可扩增出目的片段,但均未检出突变.结论:DHPLC是一项较好的检测胃癌组织中基因突变的筛查方法,在血清中的应用仍需探讨.     

变性高效液相色谱法筛选XRCC4基因突变

目的应用变性高效液相色谱技术（DHPLC）-异源双链分析对鼻咽癌患者XRCC4基因突变进行筛查与鉴定,研究鼻咽癌患者XRCC4的基因突变情况,探讨DHPLC在筛查相关基因突变、预测放疗敏感性方面的应用。方法采用聚合酶链反应（PCR）和DHPLC筛查88例鼻咽癌患者XRCC4基因的突变。结果对DHPLC图形异常的PCR扩增片断进行DNA测序鉴定突变位点及性质,检测出28例XRCC4基因8号外显子第377位C变成T,导致126号密码子的ser→phe,导致氨基酸残基的替代变化（丝氨酸→苯丙氨酸）。结论用PCR—DHPLC筛查结合测序分析检测XRCC4突变是一种高效、经济、简便、可靠的方法。     

乳腺癌血浆循环核酸p53基因突变的意义

目的 探讨血浆循环核酸p53基因突变检测的可行性，研究乳腺癌患者循环核酸p53基因突变对于乳腺癌发生、发展和预后估计的临床意义。方法 应用聚合酶链反应（PCR）扩增p53基因外显子5－8，并用变性高效液相色谱技术（DHPLC）分析产物突变情况，再与各生物学参数进行了相关研究。结果 33例患者中14例（42．4％）p53基因突变，且突变率与组织分化级别、ER阴性显著相关（P＜0．05），与临床分期和淋巴结及远处转移情况无关。结论 DHPLC可作为一种快速简便的基因突变检测手段，p53基因突变在乳腺癌循环核酸中有较高的检出率并预示肿瘤的恶性程度，血浆基因突变有望成为简便的预后参考指标。     

血浆循环核酸p53突变诊断原发性肝癌的价值

目的　研究肝脏良恶性疾病患者血浆循环核酸 p5 3基因突变 ,探讨其突变检测诊断肝癌的可行性和价值 .方法　肝脏疾病患者 6 1例 ,其中原发性肝癌 36例 ,良性组为肝血管瘤、肝囊肿和乙型肝炎肝硬化患者共 2 5例 ,提取血浆DNA,采用 PCR扩增 p5 3基因外显子 5 & 6 ,7和 8(E5 & 6 ,E7和 E8) ,用变性高效液相色谱法 (DHPL C)对产物进行突变筛选 .结果　肝恶性肿瘤患者 36例血浆提取的 DNA扩增出E5 & 6 ,E7和 E8例数分别为 10 ,36和 35 ,良性组对应为 0 ,6和 4例 . DHPL C检测到 4 / 36例 E5 & 6突变 ,12 / 36例 E7突变 ,未检测到 E8突变 ,良性组检测到 2 / 2 5例 E7突变 .结论　良恶性组间扩增阳性率有明显差异 (P<0 .0 5 ) ,p5 3基因突变与乙型肝炎感染有关 ,HBs Ag+肝癌患者 p5 3基因突变率明显高于 HBs Ag- 肝癌患者 (P<0 .0 5 ) ,循环核酸 p5 3突变检测有望成为肝癌高危人群特别是乙型肝炎感染和携带者预警或早期诊断的参考指标     

胃癌患者血浆中p53基因突变的检测

目的:检测并比较胃癌患者外周血浆、肿瘤组织以及癌旁正常黏膜中p53基因突变状况.方法: 从96名胃癌患者的术前血浆、肿瘤组织及癌旁正常黏膜提取DNA,采用PCR、变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)及测序技术,检测p53基因5～8外显子的突变,选择20例健康人的血浆作为正常对照.结果: 96例胃癌患者肿瘤组织中,p53基因杂合性突变的检出率为19.8%(19/96),在其相应的外周血浆中,p53基因杂合性突变的检出率为5.2%(5/96),在p53基因突变阳性的外周血浆中,其对应的肿瘤组织均发现有同样的p53基因突变,在对应癌旁正常黏膜组织及20例健康人对照血浆中均未检出p53基因突变.肿瘤组织和外周血浆中p53基因突变与胃癌患者的临床病理特征无相关性.结论:胃癌患者血浆中可检测出p53基因突变,胃癌患者血浆中p53基因突变的分析有可能作为临床辅助诊断、疾病监测的指标之一.     

Comparison of three methods for detecting epidermal growth factor receptor mutations in plasma DNA samples of Chinese patients with advanced non-small cell lung cancer

Background  Epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations can predict tumor response to tyrosine kinase inhibitors (TKIs). Detecting EGFR mutations in plasma DNA samples in patients with advanced non-small cell lung cancer is challenging and promising. We compared three methods for detecting plasma EGFR mutations, including direct DNA sequencing, denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) and Scorpions Amplification Refractory Mutation System (Scorpions ARMS).

Methods  Plasma DNA samples from 73 patients with stage IIIB to IV adenocarcinoma were analyzed for EGFR mutations in exons 19 (deletion mutation) and 21 (L858R mutation) using direct DNA sequencing, DHPLC and Scorpions ARMS. Sensitivities of the three methods were compared and the relationship between EGFR mutations and patients’ survival was analyzed.

Results  In 73 patients, we detected EGFR mutations in 5 samples (6.9%) by direct DNA sequencing, in 22 samples (30.1%) by DHPLC, and in 28 samples (38.4%) by Scorpions ARMS. EGFR mutations were found in 13 samples in exon 19 and in 9 samples in exon 21 by DHPLC, while we found mutations in 15 samples in exon 19 and in 13 samples in exon 21 by Scorpions ARMS. Among the 73 patients, there was 90.4% concordance between DHPLC and Scorpions ARMS (66/73, κ=0.79, P=0.07). Of the 73 patients, 46 patients were treated with gefitinib, including 18 patients with mutations and 28 patients without mutations as determined by Scorpions ARMS. The 18 patients with mutations had a significantly longer progression-free survival (PFS) time (median PFS was 21.0 months) than the 28 patients without mutations (median PFS was 7.0 months) (P=0.022).

Conclusions  Among the three methods for detecting EGFR mutations in plasma DNA samples of patients with advanced lung adenocarcinoma, direct gene sequencing had the lowest sensitivity, while Scorpion ARMS showed the highest mutation detecting capability. DHPLC is slightly less sensitive than Scorpion ARMS. EGFR mutations in exons 19 (deletion mutation) and 21 (L858R mutation) predict a longer PFS.

     

应用变性高效液相色谱筛查颅内静脉系统血栓形成AT-Ⅲ基因突变及多态性

目的 应用变性高效液相色谱(DHPLC)方法筛查生育期女性颅内静脉系统血栓形成(CVT)AT-Ⅲ基因的突变及多态性.方法 标本来自于2006年6月～2007年12月南方医院生育期女性CVT患者,及52例严格配伍的健康女性外周静脉血.提取所有受试者全血DNA.PCR扩增后应用变性高效液相色谱(DHPLC)技术分析抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)基因的启动子区,第1～6外显子及其侧翼序列的基因变异情况.结果 DHPLC技术分析发现病例组出现6种异常峰形,经测序证实1例致病突变为Exon6 G13328A的杂合突变,1例新发现的同义突变Exon4+243 G>A;SNP位点6个,其中4个SNP库已报道的SNP位点.2个新发现的SNP位点,对照组发现一种异常峰型(三峰).结论 DHPLC是一种自动、快速、高通量的基因突变及SNP位点的筛查方法,AT-Ⅲ基因突变可能是导致生育期非妊娠女性CVT的遗传因素之一,功能性SNP位点也可能参与了该人群VTE的发生.

Abstract：

Objective To identify antithrombin Ⅲ(AT- Ⅲ) gene mutation and polymorphisms in pregnant women and parturients with cerebral venous thrombosis (CVT) using denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC). Methods The genomic DNA was extracted from the blood samples of 50 pregnant women and parturients with CVT and 52 matched healthy women for molecular analysis using a PCR/DHPLC assay followed by DNA sequence analysis. Ten primer pairs were designed for amplifying the AT-Ⅲ promoter region and exons 1-6 including the exon/intron boundaries. A rapid screening assay based on DHPLC was established to screen the mutation and polymorphisms of AT- Ⅲ gene. Results Six abnormal peaks were detected in 40 of the patients by DHPLC. Direct DNA sequencing was performed on representative samples detected by DHPLC profiling. One pathogenic heterozygous G13328A missense mutation in exon 6, and a novel silent mutation in exon 4+243 G>A were identified. Six single nucleotide polymorphism (SNP) sites were found, including 4 previously reported ones in the SNP library and two were novel SNP sites. An abnormal peak was detected in the control group by DHPLC. Conclusion DHPLC allows automated and rapid high-throughput detection of AT-Ⅲ gene mutation and polymorphisms in the clinical setting and prenatal diagnosis. Our findings suggested that AT-Ⅲ gene mutation, as well as its polymorphisms, contributes to the occurrence of CVT in pregnant women and parturients.     

结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的：建立结核分枝杆菌PPE68蛋白基因重组质粒的真核表达载体,为以后对PPE重组蛋白的免疫原性分析奠定基础。方法：提取结核分枝杆菌总DNA,PCR法扩增出PPE68编码基因,通过线性T克隆载体pGEM—T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）后,转染至I-IeLa细胞中表达,Westernblot鉴定表达产物。结果：PCR产物、pGEM-T—PPE68及pcDNA3．1（＋）一PPE68分别经双酶切后均获得同一大小基因片段,表达产物经Westernblot鉴定相对分子质量约为40000。结论：成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体,并获得了表达产物。