恶性疟原虫FCC—1／HN株环子孢子蛋白基因分枝杆菌——大肠杆穿梭表达重组质粒的构建及序列测定

本文对恶性疟原虫环子孢子蛋白(circumsporozoiteprotein,CSP)基因片段进行克隆和序列测定。根据恶性疟原虫837株基因编码序列设计合成一对引物,采用PCR技术从恶性疟原虫FCC-1/HN株基因组DNA中特异扩增CSP基因片段的Ⅰ区、中央重复区、重复区后可变区和Ⅱ区;经纯化的扩增产物用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切后,定向克隆入大肠杆菌——分枝杆菌穿梭表达质粒,转化感受态大肠杆菌DH5α,重组克隆经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定,再经PCR和酶切鉴定,并对重组子进行序列测定。结果表明从恶性疟原虫FCC-1／HN株基因组DNA中可特异扩增出约1171bp的基因片段,阳性重组质粒经双酶切和PCR鉴定与预期的结果一致,序列测定表明所克隆的基因和编码环子孢子抗原的基因片段相符。     

人防御素-5基因的克隆和真核表达载体的构建

目的对人防御素5(HD-5)基因进行克隆,构建真核表达载体HD5-pPICZαA。方法从人cDNA文库中PCR扩增HD-5基因片段,用EcoRⅠ和XbaⅠ分别双酶切HD-5基因扩增产物和毕赤酵母表达载体pPICZαA,用T4DNA连接酶连接目的基因片段和pPICZαA,然后转化到E.coli Top10中,Zeocin筛选转化子并进行PCR、酶切和序列鉴定。结果提取阳性克隆的重组质粒,EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后跑电泳获得预期条带;同时重组质粒经序列测定,证实HD-5基因正确插入pPICZαA中,插入位置、方向均正确。结论成功构建人防御素5基因的真核表达载体HD5-pPICZαA,为HD-5蛋白的真核真核表达奠定基础。     

弓形虫ZS1株抗原基因的扩增及克隆

本文采用PCR技术，自行设计一对寡核酸引物(P1，P2)，从弓形虫ZS2基因组DNA中特异扩增出编码P30抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用FxcoRⅠ和HindⅢ双酶切后,克隆到真核表达质粒pcDNA3中，转化人大肠杆菌TG1，用氨苄青霉素和PCR初筛，将PCR扩增阳性的重组子用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定。结果成功地构成建真棱型表达质粒pcDNA-P30，从而为进一步进行重组P30抗原的体外表达创造有利条件。     

FAA基因治疗及其基因表达调控序列新型重组载体的构建、鉴定

目的：Y国探索新型逆转录病毒载体Lentivector及其基因表达调控序列在造血细胞中的有效表达和基因治疗中的应用,用分子克隆的方法构建Fanconis Anemis(FA)患者A组基因（FANCA基因）基因治疗新型重组载体（Lentivector)和基因表达调控序列（启动子/增强子）,进一步通过内切酶酶切位点鉴定插入的基因表达调控序列方向和目的基因的片段大小、目的原基因特异引物PCR扩增特异片段鉴定目的基因。方法：首先次质粒Friend基因表达调控序列方向和目的基因的片段大小、目的基因特异引物PCR扩增特异片段鉴定目的基因。方法：首先将质粒Friend基因表达调控序列（Fr-MuLV E/P)强启动子/增强子插入载体Lentivector pRRLsin-18中相应克隆位点,成为pRRLsin-18FrMuLV(test1);用NotI、NcoI双酶 切载体FochA-FANCA,低溶点胶回收FANCA目的基因片段;应用polylinker、adapter方法多步克隆插入新型载体Lentivector pRRLsin-18(test1)中相应特异克隆位点,获得重组载体sin-18FrMuLVE/P-FA(test2),通过酶切鉴定重组载体插入的基因表达调控序列方向和目的基因的片段大小和方向,筛选正向阳性重组质粒,用PCR法进一步证实插入的FANCA基因片段。结果：挑取的阳性克隆经多个酶酶切鉴定,有Friend质粒390bp基因表达调控序列（Fr-MuLVE/P)和4.5kbFANCA目的基因片段酶切位点,用PCR引物扩增出目的基因相应片段,证明为正向重组体。结论：已成功构建表达FANCA基因的重组逆转录病毒载体及其基因表达调控序列,为进一步应用FANCA基因的新型重组载体Lentivector经包装后转染造血干细胞及其表达情况和相应的FAA基因治疗奠定了良好的工作基础。     

金葡菌TG-TPase嵌合基因在甲醇营养型酵母中的表达

目的 设计耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)耐药相关TG-Tpase嵌合基因,构建其真核表达质粒,为嵌合基因的高效、分泌型表达奠定基础.方法 在序列结构分析的基础上,设计引物从MRSA菌株中扩增其耐药性相关转糖基酶(Tgase)和转肽酶(Tpase)活性片段,进一步用酶切连接等分子生物学操作构建TG-Tpase嵌合基因,亚克隆至酵母表达质粒pPIC9K中,转化DH5a大肠埃希菌.经酶切、PCR和核苷酸测序鉴定正确的重组质粒用Sal I线性化,整合入甲醇营养型毕赤酵母GS115中,在DNA和基因转录水平鉴定出阳性重组酵母.结果 采用PCR从MRSA基因组中扩增得到了873 bp的Tgase片段和1 044 bp的Tpase片段.以酶切连接构建的TG-Tpase嵌合基因经酶切、PCR鉴定,能获得约1 900 bp的融合片段,与预期结果 相符,测序表明序列和阅读框均正确.线性化的重组质粒转化GS115后,得到5个高拷贝阳性转化子,经诱导表达和PCR鉴定,这些转化子能转录出目的基因的mRNA.结论 成功构建了含TG-Tpase嵌合基因的重组毕赤酵母工程菌,为进一步高效制备嵌合蛋白、进而利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选创造前提.     

hBDNF基因原核表达重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

我们按照hBDNF基因全长编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出760bp的片段,反向插入到pGEM-3Zf( )载体上,获得pGEMBF18克隆,限制性酶分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因全长编码序列。从pGEMBF18克隆中获取hBDNF全长编码片段,与原核表达载体pGEX-5T连接,构建了p5TBF34原核表达重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌JM109,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE特异区带分子量为43kDa,此重组蛋白占菌体可溶性蛋白总量的7.53%,Western杂交证实该特异区带具hBDNF抗原活性。     

Dystrophin基因常见易缺失外显子片段的克隆

目的对Dystrophin基因18个常见易缺失外显子片段进行克隆、鉴定,以克隆产物作为核苷酸探针为研制Dystrophin基因缺失检测微阵列作准备。方法以人类基因组DNA为模板,应用18对引物,对Dystrophin基因常见易缺失外显子片段进行PCR扩增。将扩增产物与pGEM-T Easy载体连接,转化E．coli JM109感受态细胞。通过平板培养,挑选阳性克隆。提取重组质粒,Not I酶切,获得完整的探针片段,并作测序鉴定。通过核酸序列数据库相似性检索工具验证序列的来源及其与GeneBank收录序列的相似性。结果PCR扩增出18个片段,与Dystrophin基因预期扩增片段大小相一致。重组克隆的酶切产物与PCR产物大小相近,与预期相一致。经测序获得18个克隆片段全序列,其核苷酸数量与预期基本一致,序列相似性检索分析证实了这些克隆片段与GeneBank收录的Dystrophin基因片段具有极高的同源性。结论克隆产物确为Dystrophin基因常见易缺失外显子片段。     

IRE1结构域分析及截短型载体的构建和表达

目的 克隆IRE1基因,根据IRE1基因不同生物学功能的4个结构域构建截短型真核表达载体,并用生物信息学方法对其蛋白产物进行分析.方法 应用PCR重组技术,以pCMV-IRE1为模板扩增IRE1全长及4个截短型片段,利用DNA重组技术将片段定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,经酶切及测序鉴定后,免疫印迹检测...     

日本血吸虫卵黄铁蛋白基因重组质粒pLXSN-Sj YF的构建

目的 构建日本血吸虫pLXSN-Sj YF重组质粒，为进一步在细胞中表达及DNA免疫作准备。方法 用PCR技术从日本血吸虫雌性成虫基因组中扩增编码卵黄铁蛋白(yolk ferritin,YF)的基因片段，定向克隆入逆转录病毒载体PpLXSN，经氨苄LB培养基筛选．酶切、RCR鉴定。结果 从日本血吸虫雌性成虫基因组中扩增出特异的卵黄铁蛋白基因片段，成功克隆pLXSN-Sj YF重组质粒。结论 构建成功pLXSN-Sj YF重组质粒．为下一步研究奠定了基础。     

人生长分化因子-5完整成熟肽基因的克隆

目的：克隆人生长分化因子-5(hGDF-5)完整成熟肽基因。方法：根据Genbank中hGDF-5的序列化学合成两条引物，从人胎儿软骨组织提取总RNA，通过反转录聚合酶链式反应(RT—PCR)得到hGDF-5完整成熟肽基因。将所得基因片段插入克隆载体pMD18-T并转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒，酶切鉴定并测序。结果：DNA琼脂糖凝胶电泳显示：PCR产物为一长约380bp的带，阳性克隆质粒经双酶切可切出约380bp的片段。全自动DNA测序表明与Genbank中的序列完全相符。结论：通过反转录聚合酶链式反应从人胎儿软骨组织中成功克隆出人GDF-5完整成熟肽基因，基因序列完全正确。     

致肾盂肾炎大肠杆菌132特异性基因的筛选

目的通过抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,比较致肾盂肾炎大肠杆菌132(UPEC132)与非致病性E.coli K-12 MG1655之间基因组的差异,筛选UPEC132特有的基因片段。方法应用SSH技术构建UPEC132(tester)与非致病性E.coli K-12 MG1655(driver)菌株差异DNA消减文库,经PCR和斑点印迹法筛选鉴定阳性克隆,并进行测序及生物信息学分析。结果获得约1600个重组菌的UPEC132消减文库,随机挑取其中的300个克隆,有37个含有UPEC132特异的DNA序列。特异性片段测序后进行生物信息学分析,发现与其相关的37个基因为UPEC132所特有,其中1个为新发现的DNA片段,9个为与致病相关基因,7个为与代谢和物质转运相关基因,2个为与外膜蛋白相关基因,3个为与调节相关基因,10个为未知功能蛋白的基因,其他5个为功能未分类的基因。结论SSH技术是筛选病原菌特异基因的有效方法,已确定了37个UPEC132的特异基因,为进一步阐明其致病分子机制打下了基础。     

日本血吸虫线粒体大亚基核糖体基因的亚克隆、测序及同源性分析

目的将筛选日本血吸虫成虫cDNA文库得到基因克隆并测序。方法体外将以阳性克隆为模板的PCR产物和 pGEM T载体连接 ,转化大肠杆菌XL1 blue,经抗生素及生色底物X gal初筛 ,再用限制性内切酶酶切法进一步鉴定和用DNA自动测序仪测序。序列送blast基因服务站进行同源性分析。结果构建了3个含日本血吸虫cDNA基因片段的重组子 ,其中1个阳性克隆序列为编码日本血吸虫线粒体大亚基核糖体rRNA的基因序列 ,另2个序列与已知的日本血吸虫基因序列无同源性。结论获得了日本血吸虫线粒体大亚基核糖体rRNA基因片段 ,为进一步分析其一级结构和功能打下了基础。     

恶性疟原虫红内期PF332抗原基因未知片段的体外扩增与克隆

根据恶性疟原虫FCCI／NH株PF332基因片段5’端巳知序列，设计台成了一条特异引物(SP)；报据PF332基因的结构特点，又设计合成了一条非特异引物(NSP)。应用低严谨PCR技术(LSPCR)，从恶性疟原虫FCC1／FN株基因组DNA中扩增出一系列PF332基因未知片段。利用T-A克隆法将一560bp大小的片段克隆入测序用PMD-18T载体。限制性内切酶酶切及PCR扩增鉴定表明重组正确。     

人PLAGL2基因表达载体质4粒的构建

目的克隆人PLAGL2基因片段并插入（TetO）7-CMV表达载体。方法采用PCR技术扩增出人PLAGL2基因的两个DNA片段，经酶连后获得约2kb的目的DNA片段并插入（TetO）7-CMV载体中，PCR筛选阳性转化株并分析重组质粒的DNA序列。结果DNA测序结果显示重组质粒（TetO）7-CMV-PLAGL2序列正确。结论扩增并连接了人PLAGL2基因的两个DNA片段，最终成功构建了人PLAGL2基因的表达载体质粒-（TetO）7-CMV-PLAGL2。     

人PLAGL2基因表达载体质4粒的构建

目的克隆人PLAGL2基因片段并插入（TetO）7-CMV表达载体。方法采用PCR技术扩增出人PLAGL2基因的两个DNA片段，经酶连后获得约2kb的目的DNA片段并插入（TetO）7-CMV载体中，PCR筛选阳性转化株并分析重组质粒的DNA序列。结果DNA测序结果显示重组质粒（TetO）7-CMV-PLAGL2序列正确。结论扩增并连接了人PLAGL2基因的两个DNA片段，最终成功构建了人PLAGL2基因的表达载体质粒-（TetO）7-CMV-PLAGL2。     

小鼠胚胎干细胞药物代谢酶CYP3a11基因敲除的实验研究

目的研究小鼠胚胎干细胞药物代谢酶CYP3a11基因的敲除。方法根据已知小鼠的CYP3a11基因组DNA序列,从129品系小鼠E14胚胎干细胞基因组DNA中,通过PCR的方法分别获得用于构建基因敲除载体的0.65kb的5'-短臂(short arm,SA)和(3.3+4)kb的3'-长臂(long arm,LA)片段,通过常规分子克隆技术,构建完成针对小鼠药物代谢酶CYP3a11基因的替代型基因敲除载体pCR-CYP3a11_KO,并对载体进行酶切鉴定。将线性化的pCR-CYP3a11_KO载体通过电穿孔技术转入E14胚胎干细胞。G418药物筛选4～6周直至克隆形成,用PCR和Southern blot技术对筛选出的细胞克隆进行鉴定。结果酶切结果表明基因敲除载体pCR-CYP3a11_KO DNA序列正确;转染后的E14胚胎干细胞经过G418筛选后,存活的细胞可形成单克隆集落,经过PCR和Southern blot技术鉴定,其中有5个单克隆被证实CYP3a11基因已被敲除。结论成功构建了小鼠CYP3a11基因敲除载体,并在小鼠E14胚胎干细胞的CYP3a11基因敲除中获得阳性克隆。     

我国登革2型病毒E基因的克隆与表达研究

以我国登革２型病毒４３（Ｄ２－４３）株ＲＮＡ为模板，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增了Ｅ基因。扩增的ｃＤＮＡ片段约１２９０ｂＰ， 与预期大小相一致，经ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交证实了Ｅ基因片段的特异性。将Ｅ基因的扩增片段首先克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐtⅡＫＳ~＋质粒ＤＮＡ中，利用重组子中载体的酶切位点，将该基因片段再克隆到高效表达载体ｐＢＶ２２０中。用ＰＣＲ技术从２０个重组子中筛选出６个阳性克隆　，经ＳａｌⅠ和ＰｓｔⅠ酶切进一步鉴定，证明这６个重组质粒中均含有Ｅ基因片段。采用温控诱导，４小时表达的蛋白量约占菌体总蛋白的２０％。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证明，表达的蛋白可与该病毒株的多克隆腹水抗体和登革２型病毒标准株的单克隆抗体起特异反应。     

建立Ig基因富集的DNA库进行2F7单克隆抗体基因克隆

用小鼠型抗人小细胞肺癌单克隆抗体的2F7杂交瘤细胞DNA,经限制性内切酶EcoRI或BamHI完全酶解,通过Southern blot,用小鼠Ig基因Cr_(2a)、V_(H)、J_(H)和E_(H)作探针,富集阳性DNA,同时用pSV_2neo质粒为载体与这些DNA重组,经筛选获得了一批杂交阳性的克隆。     

dystrophin基因常见易缺失外显子片段的克隆和鉴定(英文)

背景:dystrophin基因是人类常见的X染色体连锁隐性遗传的神经-肌肉系统疾病,dystrophin基因缺失集中在两个热点区域即外显子2～20和44～53,其主要缺失可以通过对一系列外显子的检测来发现。然而对dystrophin基因缺失的18个常见易缺失外显子片段的系统检测却鲜有报道。目的:拟对dystrophin基因18个常见易缺失外显子片段进行克隆、鉴定。方法:以人类基因组DNA为模板,应用18对引物对dystrophin基因常见易缺失外显子片段进行PCR扩增。将扩增产物与pGEM-TEasy载体连接,转化E.coliJM109感受态细胞。通过平板培养,挑选阳性克隆。提取重组质粒,NotI酶切,获得完整的探针片段,并作测序鉴定。通过核酸序列数据库相似性检索工具验证序列的来源及其与GeneBank收录序列的相似性。结果与结论:PCR扩增出18个片段,与dystrophin基因预期扩增片段大小相一致。重组克隆质粒的酶切产物与PCR产物大小相近,与预期相一致。经测序获得18个克隆片段全序列,其核苷酸数量与预期基本一致,序列相似性检索分析证实了这些克隆片段与GeneBank收录的dystrophin基因片段具有极高的同源性。克隆产物确为dystrophin基因常见易缺失外显子片段。