同种异体脱钙骨基质作为骨组织工程载体的实验研究

目的通过体外同种异体脱钙骨基质（DBM）和骨髓基质细胞（BMSC）的复合培养及体内异位成骨实验，研究DBM作为骨组织工程载体的生物相容性及成骨活性。方法参考Urist操作方法大量制备兔同种异体DBM。骨穿取兔骨髓单细胞悬液进行培养，将BMSC与同种异体DBM体外复合培养3～7d，相差显微镜、扫描电镜（SEM）和苏木精-伊红染色后光镜下观察结果。将DBM和BMSC复合培养3d的复合物植入家兔一侧骶棘肌肌袋内，分别在1、2、4周活体取材，扫描电镜和苏木精-伊红染色后光镜观察，对侧单纯植入DBM作为对照。结果体外培养发现BMSC在DBM中贴壁生长、增殖并有分泌活动。体内实验发现BMSC在DBM孔隙内均匀成骨，对照组则从DBM骨块的边缘到中心逐步成骨，成骨所需的时间长，而且成骨量要小于前者。结论DBM作为组织工程载体具有良好的生物相容性和成骨活性。     

组织工程骨膜成骨的构建及血管化超微结构的观察

目的 用组织工程方法构建组织工程骨,从超微结构观察成骨过程中成骨细胞、血管再生的变化,探讨小肠黏膜下层作为组织工程骨支架材料促进组织工程骨血管化的优越性.方法 应用密度梯度离心法体外分离、培养骨髓基质干细胞,并将成骨诱导骨髓基质干细胞与小肠黏膜下层复合培养2周.未复合细胞的单纯材料作为空白对照.将复合培养细胞与单纯材料分别植入无胸腺裸鼠皮下,扫描和透射电镜观察植入前和植入后4、8、12周成骨细胞、血管生成的变化过程.结果 体外复合培养见细胞在材料上生长、分化、增殖良好,细胞分泌大量的细胞外基质,置入体内后成骨良好,形成大量的血管;12周后材料被吸收,与周围组织无明显界限.单纯材料中央部位有大量小血管及血管内皮细胞增生,其周围多为成纤维细胞,无成骨细胞.结论 小肠黏膜下层作为以骨髓基质干细胞为种子细胞的支架材料,有利于骨的再生和血管化形成,是一种良好的骨组织工程支架材料.     

人胰岛素样生长因子-1基因强化组织工程法诱导裸鼠异位软骨形成

目的 探讨人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)基因转染诱导后的人骨髓基质干细胞(hMSCs)与再生丝素膜复合后在裸鼠体内形成组织工程软骨的能力.方法 分离培养hMSCs,体外诱导成软骨样细胞,流式细胞仪测定细胞表型,免疫组化检测软骨细胞表型;脂质体介导hIGF-1转染诱导后的hMSCs, RT-PCR、酶免疫测定法和免疫组化检测hIGF-1及Ⅱ型胶原的表达;转染后的hMSCs与再生丝素膜复合培养,扫描电镜观察细胞形态,复合物植入裸鼠皮下,HE及免疫组化染色观察新生软骨的结构和表型.结果 分离培养出纯化的hMSCs符合间充质干细胞表型,具有快速增殖及经诱导后向软骨分化的能力,诱导后的细胞表达Ⅱ型胶原;转染诱导后的hMSCs能稳定分泌具活性的hIGF-1蛋白,并表达软骨细胞表型;转染后的hMSCs与再生丝素膜复合培养显示良好的生物相容性,新生组织具典型的软骨组织陷窝,并表达Ⅱ型胶原.结论 经hIGF-1基因诱导后的hMSCs与再生丝素膜在体内能构建出软骨样组织.     

PHBHHx与人脐带间充质干细胞的体内异位成骨研究

目的：探讨以3‐羟基丁酸‐3‐羟基己酸共聚酯（PHBHHx）为支架材料,以人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）为种子细胞的复合物体内构建组织工程骨的能力。方法将hUCMSCs接种在PHBHHx上体外成骨诱导培养2周,诱导组为实验组,不滴加hUCMSCs组为对照组,植入裸鼠皮下,并分别于1、3、5个月取材行HE、Ⅰ型胶原免疫组织化学、碱性磷酸酶染色及逆转录聚合酶链反应（RT‐PCR）检测。结果 PHBHHx表现出良好的细胞吸附性。实验组细胞大、小形态基本保持原状,成骨特异性指标检测均为阳性;对照组细胞则不能保持原状,体积逐渐缩小至完全降解,成骨特异性指标均为阴性。结论 PHBHHx复合hUCMSCs经体外成骨诱导后具有在裸鼠体内异位构建组织工程骨的能力。     

组织工程骨膜成骨的构建及血管化超微结构的观察

目的用组织工程方法构建组织工程骨,从超微结构观察成骨过程中成骨细胞、血管再生的变化,探讨小肠黏膜下层作为组织工程骨支架材料促进组织工程骨血管化的优越性。方法应用密度梯度离心法体外分离、培养骨髓基质干细胞,并将成骨诱导骨髓基质干细胞与小肠黏膜下层复合培养2周。未复合细胞的单纯材料作为空白对照。将复合培养细胞与单纯材料分别植入无胸腺裸鼠皮下,扫描和透射电镜观察植入前和植入后4、8、12周成骨细胞、血管生成的变化过程。结果体外复合培养见细胞在材料上生长、分化、增殖良好,细胞分泌大量的细胞外基质,置入体内后成骨良好,形成大量的血管;12周后材料被吸收,与周围组织无明显界限。单纯材料中央部位有大量小血管及血管内皮细胞增生,其周围多为成纤维细胞,无成骨细胞。结论小肠黏膜下层作为以骨髓基质干细胞为种子细胞的支架材料,有利于骨的再生和血管化形成,是一种良好的骨组织工程支架材料。     

骨髓基质干细胞-藻酸钙复合物构建骨组织的实验研究

目的研究犬骨髓基质干细胞(BMSCs)体外成骨活性和在犬体内异位成骨能力,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可能性. 方法抽取成年犬骨髓,梯度离心法获取单个核细胞,条件培养液体外培养、诱导、扩增后,进行组织化学、免疫细胞化学染色,透射电镜下观察其成骨活性.将培养的第3代细胞与藻酸钙所形成的复合物植于犬皮下,3月后行组织学检测. 结果体外培养的BMSCs Von Kossa染色可见钙结节,AKP染色及I型胶原、Osf2/Cbfα1、骨钙素免疫细胞化学染色先后呈现阳性;透射电镜下见基质钙化;组织学检测提示细胞-藻酸钙复合物体内培养3月后形成骨样组织. 结论BMSCs在大量扩增的同时,在一定条件下能向成骨细胞分化,细胞与藻酸钙复合物能在具免疫力的哺乳动物皮下形成骨样组织.BMSCs可作为骨组织工程较理想的种子细胞.     

鸵鸟羟基磷灰石陶瓷支架负载骨髓基质细胞异位成骨性能

目的:观察鸵鸟羟基磷灰石陶瓷支架负载骨髓基质细胞后植入裸鼠皮下的成骨性能. 方法:获取兔髂骨松质骨骨髓基质细胞,体外分离、扩增、诱导后接种于鸵鸟羟基磷灰石支架. 支架/细胞复合物植入裸鼠背部皮下,支架单纯植入作为对照. 植入后3, 6 wk取材,通过大体、组织学观察评价成骨活性. 结果:支架/细胞复合物植入后3 wk,以软骨为主的大量未成熟骨在材料表面及孔隙内形成;植入后6 wk,更多的成熟骨形成. 在支架材料和骨组织的邻接区域见成骨细胞及破骨细胞,部分区域有血管和多核巨细胞分布,可见软骨内成骨方式. 结论:支架/细胞复合物显示良好的成骨活性,鸵鸟羟基磷灰石陶瓷可以用于骨组织工程支架材料.     

双相接种技术构建组织工程骨的异位成骨观察

目的评价双相接种技术体外构建的组织工程骨在体内的成骨潜力和这种体外构建策略的可行性.方法8只山羊抽取自体骨髓体外扩增、定向成骨诱导,再分别采用静置接种法和双相接种法将羊骨髓间充质干细胞(mesenehymal stem cells,MSCs)与脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)复合,复合培养5 d;将这两种方法构建的组织工程骨分别植入羊的背部肌袋内,同时植入单纯DBM作为阴性对照;术后2、8周取标本,进行大体观察、组织学染色检查和免疫组织化学检测.结果双相接种技术体外复合MSCs与DBM构建组织工程骨,细胞在支架上体外生长情况优于普通方法,植入山羊肌肉内术后2周观察到异位成骨,并随时间延长成骨量增加,其组织学半定量评分术后2周为(2.46±0.32)、8周为(4.13±0.42),明显优于普通方法的术后2周(1.96±0.21)、8周(3.66±0.37)(P＜0.01).植入后的组织工程骨材料边缘均可检测到BrdU标记阳性的细胞.单纯DBM植入未见成骨表现,亦无BrdU标记阳性的细胞.结论双相接种技术有利于组织工程骨在体内的成骨,是一种值得推广的组织工程骨体外构建技术.     

组织工程骨表面微观形貌和生物矿化的实验研究

目的：用绿色荧光蛋白( GFP)标记结合扫描电镜和X射线能谱分析( SEM/EDS)技术对组织工程骨的表面微观形貌和生物矿化进行观测,以评价脱钙骨( DBM )支架体外构建组织工程骨的生物性能。方法用重组腺病毒介导GFP基因转染兔骨髓间充质干细胞( BMSCs)进行示踪标记,细胞与DBM复合经成骨诱导后,通过倒置荧光显微镜对细胞生长情况进行即时观察,结合SEM/EDS技术,观测组织工程骨的表面微观形貌和生物矿化。结果在倒置荧光显微镜下见细胞在DBM支架上能较好的黏附、重叠生长和增殖,体外培养至14 d 时,细胞内 GFP 有较高水平瞬时表达。SEM见DBM呈疏松多孔结构,孔隙直径为300~600μm,孔隙率达90%。 SEM下观察组织工程骨,见细胞在DBM网孔内表面贴壁生长,分泌基质旺盛,并可见粗糙的生物矿化物覆盖支架。 EDS显示其表面为钙、磷沉积物,其钙磷比( Ca/P)为1．46。结论 DBM体外构建组织工程骨有非常好的生物性能,GFP标记结合SEM/EDS技术可以作为DBM体外构建组织工程骨较好的评价手段。     

VEGF165-BMSCs复合NanoBCP陶瓷支架材料异位成骨性能的实验研究

目的:探讨VEGF165-BMSCs复合NanoBCP陶瓷支架材料异位成骨的可能性.方法:将VEGF165转染至BMSCs,并将其接种于已制备的多孔NanoBCP支架材料培养后植入裸鼠皮下,进行组织学观察和分析.结果:转染后的BMSCs表达VEGF165mRNA和蛋白,NanoBCP材料比BCP的表面和孔隙内有更多的新骨形成,并发现有血管和多核巨细胞的分布.结论:NanoBCP孔隙结构良好,具有一定的生物可降解性,用于骨组织工程支架材料异位成骨性能良好,具有潜在的应用价值.     

ARBX与RBX治疗感染性骨缺损的实验对比

目的：研究抗感染重组合异种骨（ARBX）对感染性骨缺损的治疗作用。方法：在36只新西兰大白兔胫骨近端制备大小为0．8cm×1．2cm×1．8cm的矩形骨缺损并注入金色葡萄球茵,以构建感染性骨缺损模型．2周后再次手术清除病灶。实验分为ARBX组（植入ARBX）、RBX组（植入RBX）及对照组（不植骨）,每组12只。术后12周对缺损修复情况行大体解剖学、影像学、组织学、细菌学观察。结果：ARBX组骨缺损骨皮质与髓腔组织结构接近正常,与相邻正常组织连接较佳,均无明显的骨髓炎表现,而RBX组标本外观显示骨折、死骨、脓液征象,修复新生骨增生与缺损交替存在,与相邻正常组织连接松散,髓腔可见炎症细胞和脓肿存在。ARBX组细菌计数及改良x线N0rden感染分值低于其他两组（P〈0．01）。结论：ARBX抗感染的同时可诱导成骨,是一种较理想的一期修复感染性骨缺损的植骨材料。     

经皮自体骨髓注射治疗长骨骨不连术后局灶性骨缺损疗效分析

目的分析经皮自体骨髓注射治疗长骨骨不连术后局灶性骨缺损的临床疗效。方法用骨穿针穿入骨不连骨缺损部位,同时于髂前上棘处行骨穿抽取红骨髓,注入骨不连骨缺损部位,术后局部加压包扎,应用夹板或石膏外固定。常规应用抗生素,预防感染。每半月摄X线片1次,观察治疗情况。每10d 1次,3次为1个疗程。随访观察至患者临床愈合。结果 37例患者通过1个疗程治疗,均得到随访,随访时间为4～12个月,平均随访时间为6个月。愈合时间在2.5～6.5个月,平均4.5个月。结论经皮自体骨髓注射治疗长骨骨不连术后局灶性骨缺损能取得较好的临床疗效,值得临床进一步推广和研究,以进一步完善和提高本法的疗效和安全性。     

经皮注射骨形态发生蛋白和自体红骨髓修复兔骨缺损与骨不连

目的;评价骨形态发生蛋白（ＢＭＰ）与自体红骨髓复合经皮注射在修复骨缺损与骨不连中的作用。方法：２０只成年新西兰大白兔,双人则桡骨中上段截去１５ｍｍ,包括骨膜,每１０个缺损为一组,随机分为４组,分别植入骨形态发生蛋白（ＢＭＰ）／自体红骨髓（ＲＢＭ）／聚乙比咯烷酮（ＰＶＰ）－Ａ组,ＢＭＰ／ＰＶＰ－Ｂ组,ＲＢＭ／ＰＶＰ－Ｃ组和ＰＶＰ－Ｄ组,植入后２ｗｋ￣８ｗｋ做Ｘ线检查、组织学检查及生物力学试验,结果：     

AAA骨与自体红骨髓复合移植治疗骨缺损

目的 :探讨同种异体低抗原脱钙骨 (AAA骨 )与自体红骨髓复合移植对良性肿瘤刮除后骨缺损修复能力的影响。方法 :58例 66处长骨良性肿瘤刮除后 ,其骨缺损残腔用AAA骨与自体红骨髓复合物充填 ,术后随诊 42例 49处骨缺损 ,每 2个月复查X线照片 1次 ,随访时间 1～ 3年。结果 :49处骨缺损均在 9个月内骨性愈合 ,平均时间为 6个月 ,优良率达 93%。结论 :AAA骨与红骨髓复合物修复骨缺损 ,其疗效显著 ,可视为骨缺损修复的理想材料     

硫酸钙人工骨联合同种异体骨与单纯人工骨治疗下肢良性骨肿瘤的对比研究

目的 评价硫酸钙颗粒人工骨联合同种异体骨与单纯使用硫酸钙颗粒人工骨植骨治疗下肢良性骨肿瘤的效果.方法 回顾性分析第二军医大学长海医院关节骨病外科2010年6月至2015年6月收治的符合研究条件的97例下肢良性骨肿瘤患者的临床资料,其中32例患者接受硫酸钙颗粒人工骨联合同种异体骨植骨治疗(联用组),另65例患者接受单纯硫酸钙颗粒人工骨植骨治疗(单用组).比较并分析两组患者术后的切口不良事件、人工骨完全吸收后的骨质愈合情况等.结果 联用组和单用组患者术后切口不良事件的发生率分别为15.6％(5/32)和26.2％(17/65),两组差异无统计学意义(P＞0.05).联用组和单用组患者在硫酸钙颗粒人工骨完全吸收后,遗留明确或可疑骨缺损的发生率分别为9.4％(3/32)和29.2％(19/65),两组差异有统计学意义(P=0.028).结论 硫酸钙颗粒人工骨联合同种异体骨植骨治疗下肢良性骨肿瘤具有良好的效果,两者的联合使用不会增加切口不良事件的发生风险,并且可能降低人工骨被完全吸收后遗留骨缺损的风险.     

放射性骨显像在组织工程骨修复骨缺损实验中的应用

目的观察修复兔桡骨大段骨缺损时复合了血管内皮祖细胞（EPCs）的组织工程骨的血管化及成骨情况。方法自体骨髓通过不同方法的体外培养,分别获得EPCs及经成骨诱导的骨髓间充质干细胞（MSCs）,与脱钙骨基质（DBM）构建组织工程骨修复兔桡骨大段骨缺损,通过放射性核素骨显像技术评价术后不同时期组织工程骨的血管化进程及成骨情况。结果感兴趣区（ROI）计数和摄取比值显示：术后3d,各组间差异无统计学意义,但低于正常对照。术后2、4、8周,各组均呈逐渐上升的趋势,4周和8周时达到峰值,实验组在各个时相点均高于自身对照及阴性对照组。术后12周,各组均开始下降,其中延迟相结果显示：实验组与自身对照组差异无统计学意义,但二者均高于阴性对照组。术后16周,血池相结果显示：实验组低于自身对照组,与阴性对照组无差异;延迟相结果各组差异无统计学意义。结论放射性核素骨显像对骨修复过程中的血管化及成骨具有良好的监测作用。EPCs可以促进组织工程骨的血管化,加速骨愈合。     

自体骨／固骼生移植治疗四肢良性骨肿瘤性骨缺损

目的探讨自体骨／固骼生复合物应用在四肢良性骨肿瘤、瘤样病变骨缺损中的应用和疗效。方法自2000年3月至2006年12月,38例患者病理证实为四肢良性骨肿瘤;术中将病灶于外科边缘彻底刮除,根据病损情况选择自体骨颗粒加固骼生彻底紧密填塞骨缺损空腔;术后固定关节6周,避免负重。结果38例患者术后随访1—8年,平均3年6个月。所有病例均未见病变复发,4例发生轻度病理性骨折,1例术后切口渗液较多,1个月后停止渗出,切口愈合。其余病例均一期愈合。所有骨移植体X线片上显示理想的再生形态。结论自体骨／固骼生复合物应用在四肢良性骨肿瘤、瘤样病变骨缺损中的应用效果良好。     

牛骨形态发生蛋白复合煅烧骨治疗骨缺损的实验研究

目的 :验证从牛皮质骨中提取的骨形态发生蛋白 (bBMP)的异位诱导成骨能力 ,探讨煅桡骨 (SB)作为其载体对骨缺损的治疗作用。方法 :①将bBMP植入 1 6只balb/c小鼠肌袋内 ,每周宰杀 4只行细胞学检查 ,连续 4周。② 1 6只新西兰大白兔手术造成双侧桡骨 1cm缺损 ,分别植入bBMP -SB和SB进行自身对照 ,分批宰杀后行X -线照片和组织学检查。结果 :植入肌袋内的bBMP术后一周即可诱导软骨细胞形成 ,2周时可见编织骨 ,4周时可见小梁骨及骨髓成形。而骨缺损实验中 ,bBMP -SB组在软骨诱导、小梁骨的形成数量、骨折愈合等方面均明显优于单纯SB组。结论 :①bBMP有强大的异位诱导成骨能力 ;②bBMP -SB复合骨可促进骨缺损愈合     

双膦酸盐对骨形成蛋白诱导骨的作用

目的：研究双膦酸盐对骨形成蛋白（BMP）诱导骨的作用。方法：42只大白鼠背部植入BMP,诱导出异位骨后,将大白鼠分成实验组和对照组。实验组在BMP植入后第3～7周,每周腹腔注射双膦酸盐（YM175）3次, 剂量1 μg·kg^-1·d ^-1。对照组按同样的方式给予等量的生理盐水。在BMP植入第3、4、7和10周,将BMP诱导骨取出,采用显微放射照片（CMR）和HE染色方法观察双膦酸盐对骨形成蛋白诱导骨的作用。结果：BMP诱导骨3周时（即双膦酸盐未投药前）,在BMP植入体周边形成编织骨,大量破骨细胞出现在新生骨组织表面。在4周时,实验组和对照组新生骨组织均向BMP植入体内生长。在10周时,对照组骨细胞变小,实验组可观察到有规律地排列的板层状骨的特征。结论：双膦酸盐对骨形成蛋白诱导骨破骨骨吸收有明显的抑制作用。     

骨缺损修复材料煅烧牛骨粉的理化特性

目的:获得具有良好生物相容性和骨引导作用的骨修复材料——煅烧骨粉并探讨其理化特性,为骨缺损修复寻找理想支架。方法：以牛骨为材料,通过煅烧彻底去除其有机成分（相应的抗原性和可能存在的病原微生物）,保留其与人体骨基本一致的无机成分和天然的三维交通结构,经前期处理后煅烧至850℃的牛骨制成颗粒状,通过X-射线衍射、电子探针、电感耦合等离子体原子光谱法、电镜及光电子能谱检测煅烧骨理化特征及化学成分。结果:X-射线（粉末）衍射显示煅烧后牛骨粉的成分为羟基磷灰石(HAP),通过电感耦合等离子体原子光谱法检测煅烧骨未检出氮元素,表明无蛋白、无有机成分;扫描电镜观察显示清晰的天然骨的骨小梁、小梁间隙及骨内管腔系统;孔隙大小为200～850 μm,平均孔隙率为（84.9±0.6）%。 结论:高温煅烧后的牛骨粉主要成分是羟基磷灰石,与骨组织有亲合力,具有三维交通孔隙结构,基本符合骨缺损修复理想支架的要求。