热变性对血细胞流式细胞术分析结果的影响

目的 初步探讨热变性对外周血细胞在流式细胞术分析结果中的影响,从而提高流式-荧光原位杂交（Flow-FISH）技术的应用.方法 收集5例非骨髓造血干细胞疾病患者肝素抗凝外周血标本,以CD45-Alexa Fluor（R）647标记细胞表面抗原,高温变性后,采用流式细胞术分析热变性前后外周血有核细胞的散射光信号和荧光信号变化.结果 热变性后,外周血粒细胞的侧向散射光明显缩小;单核细胞不易通过散射光被区分和设门.所有细胞CD45表达强度均减弱,以淋巴细胞为著;通过侧向散射光和CD45设门虽能大致区分各群细胞,但不及未热变性细胞清晰.结论 热变性后,外周血细胞在流式细胞术中的散射光信号和荧光信号均发生了变化,按照常规FSC/SSC和CD45/SSC方法设门进行细胞亚群分析的结果不精确,利用系列特异性荧光抗体标记是一种有前景的方法.     

流式细胞仪及其应用

<正> 汽式细胞仪(Flow cytometry FCM)是近代细胞生物学、免疫、单克隆抗体、荧光化学、激光及电子计算机等学科和技术高度发展的结晶, 流式细胞仪可检测细胞大小、胞内颗粒多少、核酸(DNA或RNA)含量、胞内或质膜上物质(如抗原、受体等),借电子计算机综台处理,分析出细胞类     

应用四色荧光标记流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群的变化

目的 探讨四色荧光标记流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测鼻咽癌患者服用云芝丹参胶囊后外周血淋巴细胞亚群:辅助性T淋巴细胞(CD4 ),抑制性和细胞毒T淋巴细胞(CD8 ),B淋巴细胞(CD19 ),NK(CD16 CD56 ) 细胞的绝对数和百分率等的变化.方法 收集鼻咽癌患者27例,设立中药组和安慰剂对照组,采用四色荧光标记流式细胞术对服用云芝丹参胶囊后的鼻咽癌患者外周抗凝全血的淋巴细胞亚群CD4 细胞、CD8 细胞、B细胞、NK细胞进行绝对计数和相对计数,并对两组结果进行比较分析.结果 四色荧光标记流式细胞术结果显示:接受放射治疗的鼻咽癌患者在服用云芝丹参胶囊16周后,外周血T淋巴细胞的绝对数和百分率,以及Ts、Th细胞绝对数的下降均明显低于安慰剂组(P＜0.05);中药组和安慰剂组NK细胞百分率的变化均显著增高(P＜0.05); 但两组NK细胞绝对值的变化不存在明显差异(P＞0.05).结论 云芝丹参能明显减轻放射治疗对鼻咽癌患者的淋巴毒性.     

电针对脑梗塞大鼠脑皮质线粒体通透性转换孔的影响

目的观察电针对脑梗塞大鼠脑组织线粒体通透性转换孔的影响,探讨针刺对缺血神经元保护的线粒体机制。方法将45只成年雄性SD大鼠随机分为对照组、非电针组组(线栓法制造脑梗塞灶)和电针组(梗塞后立即给予电针刺激)。非电针组和电针组分别在梗塞后和针灸后1h、3h、6h取材,提取大脑皮质缺血半暗带线粒体,用流式细胞仪检测各组大鼠脑线粒体内Rhodamine123的荧光强度值(FL1)、线粒体前向角散射(FSC)、线粒体90°侧向角散射(SSC)。结果在1h、3h、6h时,非电针组和电针组与对照组相比FL1、SSC值显著低于对照组值(P<0.05),FSC值均显著高于对照组(P<0.05),具有统计学意义;电针组在上述3个时间点与非电针组相比FL1、SSC值高于非电针组值,但P>0.05,FSC值低于非电针组,但P>0.05,差异均无统计学意义;非电针组内、电针组内FL1、FSC、SSC值各自比较,P>0.05,差异均无统计学意义。结论缺血能显著促使缺血半暗带脑皮质线粒体通透性转换孔的开放,促使线粒体肿胀;未发现针刺在缺血后1h、3h、6h能抑制脑线粒体通透性转换孔的开放。     

多色流式细胞术对骨髓增生异常综合征患者外周血免疫表型的分析

目的了解骨髓增生异常综合征(MDS)患者外周血细胞免疫表型特征。方法采用多色流式细胞术CD45/SSC双参数散点图设门方法,对38例MDS组患者及24例Non-MDS组患者外周血原始细胞群、粒细胞群及单核细胞群免疫表型进行分析。结果 MDS组患者外周血原始细胞群、粒细胞群及单核细胞群均存在异常免疫表型。MDS组和Non-MDS组外周血原始细胞群中CD34+细胞聚集的患者为16例和3例,比例分别占42.1%和12.5%,差异有统计学意义(P<0.05)。两组中,外周血原始细胞群表达CD11b+细胞的患者为10例(26.3%)和1例(2.6%)。MDS组高于Non-MDS组,差异有统计学意义(P<0.05)。MDS组粒细胞群中侧向散射光(SSC)的平均荧光强度和CD10的几何平均荧光强度(G-MFI)分别为7.4±2.8,4.0±3.4;Non-MDS组分别为9.5±2.7,8.2±6.6,MDS组均明显低于Non-MDS组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 MDS患者外周血细胞上存在异常的免疫表型,其特点有助于MDS与Non-MDS疾病的鉴别。     

XT-4000i五分类血球分析仪原理、保养与维修

1 原理分析 XT-4000i五分类血球分析仪采用了半导体激光的核酸荧光染色流式细胞技术来进行白细胞计数及分类。当激光照射到细胞后可以得到前向散射光强度（细胞体积大小信息）、侧向散射光强度（细胞内部信息）和侧向荧光强度（细胞所含核酸量）三个信息，利用这些信息对白细胞进行计数以及对单一核细胞和多核细胞进行分化，在DIFF通道中，使用Stromatolyser-4DL试剂中的界面活性剂溶解红细胞，同时在白细胞膜上打出小孔，在Stromatolyser-4DS中的聚次甲基染料可以通过小孔进入细胞，与核酸以及细胞内器官结合，染色后经波长为633nm的激光照射，核酸含量越多的细胞得到的侧向荧光强度就越强。     

小鼠脂肪干细胞的免疫原性及移植安全性*

背景：多组实验证实脂肪干细胞体外能够大量扩增,经一定诱导条件作用后能够向3个胚层分化,并且能够加以一定的基因修饰。 目的：观察小鼠脂肪干细胞的免疫原性和经静脉移植后的安全性。 方法：体外分离培养小鼠脂肪干细胞,流式细胞仪鉴定细胞表面的免疫标记物;体外淋巴细胞增殖试验检测脂肪干细胞对淋巴细胞的活化能力;经小鼠尾静脉移植脂肪干细胞,观察细胞在体内对小鼠T、B淋巴细胞的刺激作用;仔细解剖移植后小鼠,观察细胞移植后的成瘤性。 结果与结论：脂肪干细胞在体外容易扩增培养,表达间质干细胞表面标记物;体外与淋巴细胞共培养时,不能有效刺激淋巴细胞增殖;经静脉移植后,不能激活机体细胞免疫反应,但是能够活化B淋巴细胞,激活机体体液免疫反应;细胞移植后未观察到肿瘤形成和组织畸变。提示脂肪干细胞总体免疫原性较低,移植后不会激活宿主细胞免疫系统;脂肪干细胞移植后无肿瘤样生长,安全性较好。     

人皮肤源性间充质干细胞体外诱导向淋巴细胞分化的可能性(英文)

背景:研究发现真皮组织中存在间充质干细胞,存在自体移植的可能性。如能在一定条件下将皮肤来源的间充质干细胞诱导分化为淋巴细胞,则可解决许多免疫系统损伤疾病。目的:探讨人皮肤源性间充质干细胞经体外诱导向淋巴细胞转分化的可能性。方法:体外培养人皮肤源性间充质干细胞至第14代,流式细胞仪检测细胞表面标志的表达。诱导人皮肤源性间充质干细胞转分化的条件培养基由人淋巴细胞培养上清液和新鲜人皮肤源性间充质干细胞培养液以7:3比例组成。倒置显微镜观察诱导后细胞形态学变化。流式细胞仪检测诱导后1~8d细胞表面淋巴细胞标志的表达。流式细胞仪检测诱导后3,6,9d人皮肤间充质干细胞自身标记表达的变化。结果与结论:人皮肤源性间充质干细胞稳定表达自身特异性标志CD73,Vimentin等,不表达造血系统特异性标志CD34,CD45等,且低表达HLA-I,完全不表达HLA-DR。诱导3d后,细胞体积明显增大,细胞增殖速度明显低于诱导前,细胞内和细胞间存在许多折光性强的囊胞样颗粒。除CD45淋巴细胞标志的表达无明显变化外,诱导后1~4d人皮肤源性间充质干细胞CD3,CD19,CD16,CD4,CD8的表达率均随诱导时间的延长呈线性升高趋势,诱导后5~8d处于平台期。诱导后3,6,9d人皮肤源性间充质干细胞自身标记CD73,CD34,Vimentin,HLA-DR的表达无变化,HLA-I的表达率随诱导时间的延长逐渐上升。提示在体外人皮肤源性间充质干细胞可以被诱导向淋巴细胞转分化,具有参与免疫系统损伤修复的潜能。     

多色流式细胞术对40例急性白血病免疫分型的研究

白血病的形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学分型已成为现代白血病诊断所必需,其中流式细胞术免疫分型已成为急性白血病(AL)诊断和分型的重要依据,具有重要的临床诊断意义.我们采用流式细胞仪四色荧光标记技术,CD45/SSC双参数散点图设门方法,可全面地与特异地检测出白血病细胞抗原的分布,使白血病免疫分型的结果更为准确和客观[1].     

82例SARS患者T细胞亚群的变化与肺内病变的关系

目的 观察SARS患者T淋巴细胞亚群绝对数量的变化与肺内病变情况(病变程度及肺内炎症吸收程度)。方法 用流式细胞仪MultiTEST方法对82例发病14d内的SARS患者外周血标本进行T淋巴细胞亚群绝对数量的动态监测，同时动态观察其与肺内病变程度及炎性病变吸收程度的关系，并分析糖皮质激素对T细胞亚群的影响。结果 ①5l例病情较轻患者的外周血T细胞亚群在正常范围内或轻度异常，临床上不需要糖皮质激素治疗；②3l例病情呈进展状态的患者均伴有CD4^ 细胞减少及肺内病变重，需糖皮质激素治疗。82例患者外周血CD4^ 细胞绝对数量与病变程度的相关性为r=-0．684，P=0．000；③3l例经糖皮质激素治疗的患者CD4^ 细胞及CD8^ 细胞绝对计数明显少于糖皮质激素治疗前(P=0．000)；④CD8^ 细胞数量及与肺内病变吸收程度密切相关(r=-0．816；P=0．000)。结论 ①SARS患者肺内病变程度与CD4^ 细胞数量呈负相关；②糖皮质激素治疗后SARS患者外周血CD4^ 细胞及CD8^ 细胞绝对计数减少；③SARS患者肺内病变的吸收程度与CD8^ 细胞数量有良好的负相关性。     

荧光染料CFSE作为细胞标记的特性研究

探讨荧光染料CFSE在作为细胞标记时的特性。方法 :应用激光共聚焦扫描显微术 ,观察CFSE在细胞中的准确定位。利用MTT比色法测定CFSE标记的细胞及未标记细胞的增殖情况 ;通过细胞计数和流式细胞仪 (FCM) ,测定细胞在不加任何刺激及诱导的情况下细胞数及平均荧光强度的变化趋势。结果 :在共聚焦显微镜下 ,可见CFSE标记的细胞的细胞膜、细胞核及细胞质中都带有绿色荧光 ,以胞核荧光最强。利用MTT比色法测定标记及未标记细胞的A值无显著差异。连续 6d记录的细胞数与FCM测定的平均荧光强度呈负相关。结论 :CFSE可作为细胞的标记物 ,用于细胞移植的体内检测、细胞增殖试验及细胞分裂周期的估算等研究     

兔椎间盘移植人骨髓间充质干细胞的实验观察

背景:国内外动物实验多是研究同种异体骨髓间充质干细胞的移植,但对人骨髓间充质干细胞在活体椎间盘内的存活情况还知之甚少。目的:观察人骨髓间充质干细胞在兔椎间盘内的存活情况。方法:选取新西兰大白兔15只,每只兔子的椎间盘被分为3组,即空白组(L1~2)、生理盐水组(L2~3)、绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组(L3~4,L4~5,L5~6)。空白组不注射,生理盐水组髓核内注射生理盐水25μL,绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组注射1×109L-1绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞生理盐水混悬液25μL。移植后1,2,4,6,8周取材,荧光显微镜观察荧光细胞的分布情况及其数量。结果与结论:绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组移植后1,2,4,6,8周标本切片,髓核内均可见绿色荧光细胞。移植后6,8周的荧光细胞数量明显少于移植后1,2,4周(P0.001)。提示移植后8周以内,人骨髓间充质干细胞可在兔椎间盘内存活。     

成人骨髓间质干细胞定向诱导为脂肪细胞的研究

目的:体外定向诱导成人骨髓间质干细胞(MSC)分化为脂肪细胞。方法:采用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液(1.077×10³g/L)离心分离成人MSC,体外扩增,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达,地塞米松、IBMX、胰岛素、indomethacin定向诱导MSC分化为脂肪细胞。油红O检测中性脂肪,光镜下细胞计数。结果:成人骨髓间质干细胞在体外扩增5代可获得1×10⁸个细胞。流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达阳性,CD14、CD34、CD45、CD11a为阴性。诱导48h后,细胞内有脂滴出现,随着时间延长,脂滴逐渐增加并融合为脂泡。细胞由梭形转变为圆形或多角性。细胞计数结果显示85%以上细胞转变为脂肪细胞。结论:成人骨髓间质干细胞在体外可以分化为脂肪细胞。     

骨髓间充质干细胞经大鼠冠状动脉内移植可行性研究

目的 研究骨髓间充质干细胞经冠状动脉内移植的安全性及可行性。方法 左侧开胸结扎SD大鼠左冠状动脉，2周后取心脏建立Langerndorff模型。将CM-DiI标记的骨髓间充质干细胞悬液注入主动脉根部，同时收集右心房回流的液体，离心后通过流式细胞仪计数细胞数量。观察是否有细胞经冠状静脉回流及数量比例。并在不同时间测LVSP、LVDP、±dp/dt、心率，评价其安全性。在体实验中取心梗后2周的大鼠，经左心室--主动脉途径将细胞悬液注射到临时阻断的主动脉根部，分别在移植后1及24h和1及4周取材观察细胞在心脏内的位置及细胞的迁移情况。结果 离体实验发现经冠状动脉内注射髓间充质干细胞90%以上的细胞在心肌组织内存留，移植后对LVSP、LVDP、±dp/dt、心率没有明显变化。在体内实验中发现细胞移植后早期大部分细胞分布在心外膜下心肌组织内，在心内膜下组织内较少细胞分布，而且大部分细胞在正常心肌组织内，只有少量在心梗区域。而在细胞移植后1~ 4周存活的细胞多在心肌梗死及交界区组织内，在正常组织内很少有移植细胞存在。结论 经冠状动脉内途径进行细胞移植是安全可行的。     

稳定表达GFP的胚胎干细胞株的建立及其生物学特性研究

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的胚胎干细胞株,为探索胚胎干细胞及其衍生细胞移植后在体内的分化、迁移及整合提供细胞模型。方法构建含Neo抗性基因质粒pCX-EGFP-Neor并用脂质体转染胚胎干细胞系ES-D3,G418筛选得到稳定表达的细胞株。细胞计数检测其倍增时间、流式细胞仪分析细胞周期,酶组织化学检测碱性磷酸酶(AKP)的表达,免疫组化检测阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)并观察其体外分化能力。结果该细胞株可在体外形成拟胚体及各种形态的成熟细胞且均可发出绿色荧光。该细胞株的倍增时间约为12h,G0/G、G2/M、S期分别为22.16±2.03%、18.46±1.54%、59.38±5.76%。倍增时间和细胞周期与未转染GFP的ES-D3相比没有显著性差异(P>0.05)。碱性磷酸酶(AKP)和SSEA-1呈强阳性表达。结论我们成功地建立了稳定表达GFP的胚胎干细胞株,且其生物学特性未受到GFP的影响。     

流式细胞仪检测胶原诱导的关节炎大鼠γδT细胞胞内TNF-α和IL-10的表达

目的研究牛Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型(CIA)大鼠外周血中γδT细胞胞内TNF-α和IL-10的表达情况,探讨其在CIA中作用的分子机制.方法于Wistar大鼠背部及尾根部多点皮内注射牛Ⅱ型胶原乳剂制作CIA模型.运用流式细胞仪,通过直接荧光标记的抗TNF-α和抗IL-10抗体来检测单个细胞水平γδT细胞胞内细胞因子的表达.结果与正常大鼠相比,CIA模型大鼠外周血中γδT细胞所占淋巴细胞的百分比显著下降(P＜0.01),γδT细胞胞内TNF-α(P＜0.01)和IL-10(P＜0.01)的表达均明显降低.结论γδT细胞在CIA中其前炎症细胞因子表达下调,可能γδT细胞在CIA的发病中不起致病作用.     

干细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子与心肌梗死大鼠体内骨髓间充质干细胞的迁移

背景：外周静脉移植间充质干细胞只有1%~5%的移植细胞能归巢到心肌梗死区域。 目的：观察干细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子对骨髓间充质干细胞归巢的影响。 方法：采用贴壁培养法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取传至3~5代细胞。建立SD大鼠急性心肌梗死模型,干细胞生长因子组、粒细胞集落刺激因子组、干细胞生长因子+粒细胞集落刺激因子组在骨髓间充质干细胞移植前3 d和移植后3 d单独或混合皮下注射干细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子,骨髓间充质干细胞组不注射细胞因子。 结果与结论：荧光显微镜下观察,骨髓间充质干细胞迁移至心肌梗死组织,骨髓间充质干细胞组、干细胞生长因子组、粒细胞集落刺激因子组迁移至心肌梗死区的骨髓间充质干细胞数量没有明显的区别(P > 0.05),干细胞生长因子+粒细胞集落刺激因子组的骨髓间充质干细胞数量明显高于其他3组(P < 0.05)。免疫荧光组织化学显示,植入的部分骨髓间充质干细胞表达心肌特异蛋白cTnI。结果说明干细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子两种细胞因子联合应用可以促进骨髓间充质干细胞归巢至心肌梗死区域,在体内微环境的诱导下,骨髓间充质干细胞能够转化为心肌样细胞。     

混合皮肤移植中自体角朊细胞表达B7-H1 诱导免疫抑制的相关研究

目的:探讨自体角朊细胞表达的B7-H1 分子在混合皮肤移植中的作用和相关机制。方法:体外模拟混合皮肤移植模拟系统(MELC 体系),通过流式细胞术检测角朊细胞B7-H1 和淋巴细胞PD-1 的表达。同时,实时荧光定量PCR 检测淋巴细胞IL-10、Foxp3、GATA-3 mRNA 的表达。结果:流式细胞仪检测结果显示,在有自体角朊细胞参与的MELC 体系中,随着作用时间增加,角朊细胞上B7-H1 的表达和淋巴细胞上PD-1 的表达水平均明显升高,且具有时间依赖性(P<0.01);实时荧光定量PCR 检测结果显示,随着作用时间增加,与无自体角朊细胞参与的MELC 体系相比,在自体角朊细胞参与的MELC体系中,淋巴细胞IL-10、GATA-3、Foxp3 mRNA 的表达水平均明显升高,且具有时间依赖性(P<0.01)。结论:在体外混合皮肤移植模拟系统中,自体角朊细胞通过表达共刺激分子B7-H1,上调淋巴细胞表面PD-1 的表达,二者相结合,诱导Th2 细胞和Foxp3+的Treg 细胞分化,从而负向调节免疫反应。     

SARS患者急性期外周血CD3+、CD4+及CD8+细胞数量的变化

目的 探讨SARS患者外周血T淋巴细胞亚群的变化及其临床意义。方法 用全自动血细胞分析仪检测44例SARS患者外周血白细胞计数及分类，用流式细胞仪检测SARS患者外周血T淋巴细胞亚群；并与正常对照组比较。结果 与对照组比较，SARS组患者白细胞总数显著下降，淋巴细胞百分数和绝对数显著下降，粒细胞绝对数显著下降，粒细胞百分数显著增加；CD3^ 、CD4^ 和CD8^ 细胞绝对数显著下降，CD3^ 、CD4^ 及CD8^ 细胞百分数和CD4^ /CD8^ 比值与对照组比较无显著性差异。结论 SARS冠状病毒感染损伤患者细胞免疫功能。     

胚胎干细胞源性肝干细胞在治疗性肝再生中的应用

目的： 应用治疗性肝再生模型进行胚胎干细胞(ESC)源性肝干细胞肝内移植, 观察其在肝组织替代、体内的生长分化及成瘤性等情况，为ESC移植在难治性肝病治疗中的临床应用提供实验依据。方法： 倒千里光碱+70%肝部分切除建立BALB/c小鼠的治疗性肝再生模型。用荧光示踪剂CFDA SE 标记移植细胞，将经淤胆血清“病理微环境”筛选体系筛选出的ESC源性肝干细胞经门静脉移植入治疗性肝再生模型小鼠肝内。然后荧光显微镜下观察，检测移植细胞体内分布、整合与肝细胞替代、体内生长分化等情况。2周后行白蛋白荧光免疫组化(双荧光染色)、血清白蛋白水平检测其功能状况。并通过观察其体内成瘤性对筛选出的ESC源性肝干细胞的安全性进行评估。结果： CFDA SE标记的ESC源性肝干细胞肝内移植1周，受体小鼠肝实质内可见散在绿色荧光分布。2周后，肝实质内绿色荧光分布区域明显扩大，且可见类似肝索样结构排列。共焦白蛋白荧光免疫组化(双荧光染色)结果表明，受体小鼠肝组织内可见标记细胞表达白蛋白阳性信号（呈黄色荧光），血清白蛋白水平则无明显差异（P>0.05）。6周内未见畸胎瘤形成，而将未分化的ESC移植入小鼠腋区皮下6周后则可见畸胎瘤形成。结论： 经淤胆血清“病理微环境”筛选体系筛选出的ESC源性肝干细胞移植入治疗性肝再生模型小鼠肝内后可有效整合入宿主肝板、在肝内能进一步生长分化并部分表达肝细胞功能。其安全性较好，6周内未见畸胎瘤形成。