前列腺癌患者外周血中前列腺特异抗原,前列腺特异膜抗原和人腺体激肽释放酶mRNA的表达及临床意义

目的:采用巢式RT-PCR方法,检测前列腺癌合并骨转移的患者外周血中前列腺特异抗原(PSA)、前列腺特异膜抗原(PSMA)和人腺体激肽释放酶mRNA的表达,探讨其临床意义.方法:应用巢式RT-PCR的方法,检测外周血中PSA、PSMA和hK2mRNA表达.结果:巢式PCR能够检测到经淋巴细胞稀释的LNCaP细胞的PSA、PSM和hK2mRNA的灵敏度,稀释浓度分别为10-6、10-6及10-7.检测初发伴骨转移的前列腺癌患者外周血PSA、PSMA和hK2mRNA的阳性率分别为59.45%、51.35%、59.46%,其中三种检测同时阳性的为32.43%;检测接受内分泌治疗后出现骨转移的前列腺癌患者的阳性率分别为57.14%、85.71%、83.33%,其中三种检测同时阳性的为52.48%.局限性前列腺癌患者、健康男性及健康女性的检测结果均为阴性.以β-actin mRNA做为内参照,所有临床标本检测均为阳性.结论:采用巢式RT-PCR检测前列腺癌患者外周血PSMA、hK2和PSA mRNA有助于发现进入循环系统的前列腺癌细胞,提示隐匿性转移的存在.PSMA和hK2较适合用于内分泌治疗后患者的检测.三种指标联合检测有助于提高敏感性.     

巢式RT-PCR检测前列腺癌患者外周血中PSA mRNA和PSM mRNA的比较

目的　盲法比较研究巢式反转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测前列腺癌 (PC)患者外周血中前列腺特异性膜抗原(PSM)mRNA和前列腺特异性抗原 (PSA)mRNA在PC诊断中的真实性和可靠性 .方法　根据PSM和PSA的cDNA序列设计合成引物 .应用巢式RT PCR方法分别检测 36例PC患者和 2 3例前列腺增生 (BPH)患者外周血中PSMmRNA和PSAmRNA .结果　PSAmRNA和PSMmRNA阳性表达的灵敏度 (Sen)分别为 :2 9.7% ,6 7.6 % (P <0 .0 1) .特异度 (Spe)分别为 :86 .4 % ,10 0 .0 % (P <0 .0 5 ) .准确度 (Ac)分别为 :5 0 .8% ,79.8% (P <0 .0 5 ) .卡柏值 (κ)分别为 :0 .13(差 )、0 .6 (一般 ) .结论　应用巢式RT PCR方法 ,患者外周血中PSMmR NA在PC的诊断、微转移、术后随访、人群筛选中的真实性和可靠性明显优于PSAmRNA .     

前列腺癌PSCA、PSMA和血清PSA表达及三者之问的相关性研究

目的 研究前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)和前列腺特异性抗原(PSA)在前列腺癌中的表达及三者之间的相关性,并探讨其临床意义.方法 采用免疫组化二步法检测PSCA、PSMA在22例前列腺癌中的表达水平,采用化学发光免疫法测定血清PSA值.结果 PSCA、PSMA在前列腺癌中阳性表达率分别平均为81.82%和77.27%.血清PSA与PSCA表达水平之间呈正相关(r=0.395,p＜0.05);血清PSA与PSMA表达水平之间呈正相关(r=0.341,p＜0.05).PSCA与PSMA表达水平之间呈正相关(r=0.432,p＜0.05).结论 前列腺癌组织中:PSCA只表达于癌细胞的细胞浆中,周围正常前列腺组织中未见表达;PSMA在癌细胞的细胞膜和胞浆中有高表达.在相关性方面,PSCA、PSMA及PSA三者之间均呈正相关性,且均与前列腺癌诊断、预后有关,三者在前列腺癌的发生、发展中可能存在某种联系.     

前列腺特异膜抗原基因的克隆和真核表达

[目的]克隆前列腺特异膜抗原(PSMA)基因的编码区序列,并进行真核表达.[方法]用RT-PCR方法扩增前列腺癌组织标本中的PSMA cDNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0.用脂质体转染法,把pcDNA3.0-PSMA转染哺乳动物细胞,鉴定PSMA蛋白的表达.[结果]序列测定结果表明,两条引物之间的片段长度为2 279 bp,与预期长度一致.将克隆的编码区序列与GenBank的PSMA序列进行Blast对比分析,同源性为99.7%;间接免疫荧光法显示表达的蛋白质为膜蛋白,免疫印迹表明表达蛋白质的相对分子质量为100 ku.[结论]成功扩增了PSMA编码区序列,构建了PSMA真核表达载体,建立了PSMA稳定表达的细胞株.经免疫分析,证实了真核细胞内表达的PSMA为分子质量正确的膜蛋白,且具有良好的抗原性.所获得的PSMA真核表达系统为进一步研究PSMA基因修饰的DCs疫苗对前列腺癌的治疗提供了物质基础.     

巢式RT-PCR检测外周血中前列腺特异膜抗原mRNA

目的:应用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测外周血中前列腺特异膜抗原mRNA(PSM-mRNA)并探讨其临床意义.方法: 取40例不同分期前列腺癌患者及对照组30例(15例良性前列腺增生患者,15例健康青年男性)周围静脉血各10 ml,用巢式RT-PCR检测PSM-mRNA,并培养LNCaP细胞进行阳性对照.结果:共有24例前列腺癌血标本检测出PSM-mRNA(60.0％),前列腺增生及健康对照组中无1例阳性;19例伴有远处骨转移的前列腺癌患者中16例检测到PSM-mRNA(84.2％),未发现远处转移的21例中8例阳性(38.1％).在10 ml正常血液中加入10个LNCaP细胞,可检出PSM-mRNA.结论:PSM-mRNA 可作为前列腺癌的辅助诊断指标,PSM-mRNA的检出率与前列腺癌分期(ABCD)、转移与否、血清PSA水平有相关性.     

前列腺癌组织中PSMA基因及蛋白的表达

目的: 检测前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)基因及蛋白在前列腺癌组织中的表达?方法:分别采用半定量RT-PCR法及免疫组织化学法检测52例前列腺癌组织及35例前列腺增生组织中PSMA基因及蛋白的表达情况?结果:①PSMA在前列腺癌及前列腺增生组织中表达阳性率分别为84.6%(44/52)及68.6%(24/35),虽然前列腺癌组织中PSMA表达阳性率高于前列腺增生组织,但两组阳性率间差异无统计学意义(P > 0.05)?PSMA mRNA半定量结果在两组间存在差异,癌组织中PSMA的表达量明显高于增生组织中的表达(P < 0.05)?②前列腺癌组织中PSMA蛋白表达总阳性率高达94.2%,明显高于增生组织中的阳性率(65.7%),且以++~+++居多?结论:PSMA基因及蛋白的表达在前列腺癌组织均高于前列腺增生组织,提示其可作为前列腺癌诊断指标?     

中国人前列腺特异性膜抗原基因的克隆及鉴定

[目的]克隆中国人前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)的cDNA全长,并将其连接到原核表达载体pET-30(a),构建PSMA的原核表达重组子.[方法]从前列腺癌患者活检组织中提取RNA,利用PSMA的cDNA中的EcoR Ⅰ位点,将PSMA分成两段分别做RT-PCR,然后再将其分别连接到pET-30(a)中,从而得到完整PSMA的cDNA的原核表达重组子pET-30(a)-PSMA,并对其进行鉴定.[结果]首次成功克隆到全序列的中国人PSMA的cDNA,并构建了PSMA的原核表达重组子pET-30(a)-PSMA,为以后的PSMA表达、纯化及其抗体库的筛选奠定了基础.[结论]分段克隆基因,然后将基因分别连接到同一载体,是有效地对一些长片段基因进行克隆的方法之一.     

f/tPSA和PSAD在良性前列腺增生和前列腺癌中的诊断价值

目的 探讨前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原,总前列腺特异性抗原(fit PSA)和前列腺特异性抗原密度(PSAD)在不同PSA水平的诊断意义,及f/t PSA和PSAD诊断前列腺癌(Pca)的灵敏度和特异度.方法 回顾性分析229例良性前列腺增生患者(BPH组)和138例前列腺癌患者(Pca组)血清PSA检测结果.经直肠超声测量前列腺体积,计算f/t PSA、PSAD.结果 PSA＜4ng/ml时,tPSA、fit PSA、PSAD在BPH组和Pca组无显著性差异(P＞0.05);PSA为4-10ng/ml时,tPSA无显著性差异(P＞0.05),而fitPSA、PSAD具有显著性差异(P＜0.05,P＜0.01);PSA＞10 ng/ml时,tPSA、fit PSA、PSAD在两组间均具有显著性差异(P＜0.01).当fit比值和PSAD分别取值0.12和0.22时,其诊断Pca的灵敏度和特异度分别为68.3%和75.6%、83.3%和63.8%.结论 f/t比值和PSAD在辅助诊断前列腺疾病中具有重要意义.     

MRI发现前列腺癌骨转移的分析

目的探讨MRI发现前列腺癌(PCA)骨转移的的灵敏性、特异性及与前列腺特异性抗原(PSA)值的相关性.方法23例行MRI和21例X线(平片和CT)检查的PCA骨转移患者均经临床或病理证实,同时做了PSA检测.结果 MRI检查发现前列腺癌骨转移的灵敏度和特异度均为87.5%,与PSA值的相关度为89.8%;X线检查灵敏度和特异度分别为46.7%和100%.结论 MRI是一种灵敏、简便、安全无害和经济的检查前列腺癌骨转移的方法.     

中国人前列腺特异性膜抗原基因的克隆及鉴定

【目的】克隆中国人前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)的cDNA全长，并将其连接到原核表达载体pET-30(a)，构建PSMA的原核表达重组子。【方法】从前列腺癌患者活检组织中提取RNA，利用PSMA的cDNA中的EcoR I位点，将PSMA分成两段分别做RT-PCR，然后再将其分别连接到pET-30(a)中，从而得到完整PSMA的cDNA的原核表达重组子pET-30(a)-PSMA，并对其进行鉴定。【结果】首次成功克隆到全序列的中国人PSMA的cDNA，并构建了PSMA的原核表达重组子pET-30(a)-PSMA，为以后的PSMA表达、纯化及其抗体库的筛选奠定了基础。【结论】分段克隆基因，然后将基因分别连接到同一载体，是有效地对一些长片段基因进行克隆的方法之一。     

Detection of Tumor Markers in Prostate Cancer and Comparison of Sensitivity between Real Time and Nested PCR

The objective of this study is to investigate and compare the sensitivity in conventional PCR, quantitative real time PCR, nested PCR and western blots for detection of prostate cancer tumor markers using prostate cancer (PCa) cells. We performed conventional PCR, quantitative real time PCR, nested PCR, and western blots using 5 kinds of PCa cells. Prostate specific antigen (PSA), prostate specific membrane antigen (PSMA), and androgen receptor (AR) were compared for their detection sensitivity by real time PCR and nested PCR. In real time PCR, there was a significant correlation between cell number and the RNA concentration obtained (R2=0.9944) for PSA, PSMA, and AR. We found it possible to detect these markers from a single LNCaP cell in both real time and nested PCR. By comparison, nested PCR reached a linear curve in fewer PCR cycles than real time PCR, suggesting that nested PCR may offer PCR results more quickly than real time PCR. In conclusion, nested PCR may offer tumor maker detection in PCa cells more quickly (with fewer PCR cycles) with the same high sensitivity as real time PCR. Further study is necessary to establish and evaluate the best tool for PCa tumor marker detection.     

巢式逆转录多聚酶链反应检测大肠癌外周血中CK20mRNA

目的：研究大肠癌患者外周血中CK20mRNA作为大肠癌细胞微转移的标示。方法：巢式逆转录多聚酶反应（RT－PCR）法。结果：CK20mRNA巢式TR－PCR最低可检测到每50ml血液中仅存5个结肠癌细胞的存在;大肠癌组32例,外周血中CK20mRNA阳性率56．26％（18／32）;对照组中CK20mRNA均为阴性。结论：CK20mRNA巢式RT－PCR可作为大肠癌细胞微转移的敏感而特异的检测方法。     

尿液中PCA3 mRNA和融合基因TMPRSS2:ERG mRNA的检测在前列腺癌早期临床诊断中的应用

目的研究前列腺按摩后尿液中PCA3 mRNA联合融合基因TMPRSS2:ERG亚型T1E4 mRNA的定量检测在早期前列腺癌临床诊断中的应用价值。方法收集前列腺癌(PCa)患者53例和前列腺增生(BPH)患者37例,收集前列腺按摩后尿液,离心取细胞沉淀物,提取总RNA,用实时荧光定量RT-PCR的方法检测PSA mRNA、PCA3 mRNA和T1E4 mRNA的含量,以PSA mRNA来校正尿液中的前列腺癌细胞。以PCA3 mRNA/PSA mRNA表示PCA3 mRNA的含量,以T1E4 mRNA/PSA mRNA表示融合基因T1E4 mRNA的含量。用ROC曲线对T1E4 mRNA及PCA3 mRNA诊断PCa的性能进行分析。结果尿T1E4 mR-NA/PSA mRNA比值诊断PCa的ROC曲线下面积(AUC)为0.802(95%CI:0.709～0.895),以0.007为截断值时,其诊断前列腺癌的敏感度和特异度分别为56.6%和94.6%。尿PCA3 mRNA/PSA mRNA比值诊断PCa的ROC曲线下面积(AUC)为0.646(95%CI:0.533～0.758),以0.001为截断值时,其诊断前列腺癌的敏感度和特异度为47.2%和73.0%。PCa组PCA3 mRNA(P=0.009)及T1E4 mRNA(P=0.000)的含量均高于BPH组,T1E4 mRNA联合PCA3 mRNA定量检测的敏感度为81.1%,比单独应用PCA3 mRNA和T1E4 mRNA检测的敏感度分别提高了33.9%和24.5%。结论前列腺癌按摩后尿沉渣中可以检测到TMPRSS2:ERG亚型T1E4 mRNA,联合PCA3 mRNA和T1E4 mRNA两个指标定量检测,可以显著提高检出前列腺癌的敏感度。此联合检测方法可以用于早期的前列腺癌诊断。     

非小细胞肺癌外周血癌胚抗原mRNA表达与肿瘤微血管密度的相关性

目的:探讨非小细胞肺癌(NSCLC)外周血癌胚抗原(CEA)mRNA的表达与肿瘤微血管密度(MVD)之间的相关性。方法:采用逆转录巢式聚合酶链反应(nestedRT-PCR)和微流控芯片(micro-fluidchip)技术检测57例NSCLC患者术前外周血CEA mRNA;选择单克隆抗体CD31和CD34,采用免疫组化对肿瘤组织进行MVD计数。结果:57例NSCLC患者外周血CEA mRNA阳性表达率为61.4%;CD31和CD34显示的MVD结果分别为(29.7±12.1)条和(38.2±12.7)条,范围分别是10~61条和19~76条。CEA mRNA阳性表达率和MVD计数呈正相关关系(P<0.05)。结论:在NSCLC患者,其肿瘤MVD较高的则更容易发生外周血微转移。     

前列腺癌患者外周血单个核细胞PSA mRNA表达

目的：检测前列腺癌患者及对照者外周血单个核细胞前列腺特异性抗原(PSA）mRNA表达,并探讨其临床意义。方法：选择39例前列腺癌患者,12例健康体检者作为对照,取5 mL静脉血,肝素抗凝,Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞,RT-PCR检测PSA mRNA表达。结果：①39例前列腺癌患者外周血单个核细胞PSA mRNA表达阳性检出率66.7%（26/39）,其中血清PSA＞20.0 μg·L^-1者23例,PSA mRNA表达阳性检出率87.9%（20/23）;血清PSA≤20.0 μg·L^-1者16例,PSA mRNA表达阳性检出率37.5%（6/16）。对照组未见阳性表达。②16例血清PSA≤20.0 μg·L^-1的前列腺癌患者PSA mRNA阳性表达的Gleason评分为：1~4分0/3,5~7分1/8,8~10分5/5,6例阳性者均为中、低分化癌。 结论：外周血单个核细胞PSA mRNA的检测在血清PSA＞20.0 μg·L^-1的前列腺癌患者中具有较高的敏感度,是一种可靠的检测方法。血清PSA≤20.0 μg·L^-1的前列腺癌患者外周血单个核细胞PSA mRNA的检测可以预示微转移的发生。     

双重实时荧光逆转录聚合酶链反应检测尿液DD3/PSA mRNA比值及其应用

目的建立双重实时荧光逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测尿液DD3／PSAmRNA比值,评价其初步应用。方法分别在前列腺特异性抗原（PSA）基因外显子1和2、差异显示编码3（DD3）基因外显子1和3之间设计一对引物和一条探针,PSA和DD3基因的TaqMan—MGB探针5’分别标记HEX和FAM荧光素,建立双重实时荧光RT—PCR检测尿液DD3／PSAmRNA比值的方法,并对方法学进行评价。对34例前列腺癌（PCa）、44例良性前列腺增生（BPH）患者前列腺按摩后尿液中的DD3／PSAmRNA比值进行检测,评价其临床应用价值。结果扩增产物经测序证明为PSA和DD3特异性片段。以LNCaP细胞cDNA作模板,PSAmRNA和DD3mRNA最低检测限分别为0,6细胞／反应和60细胞／反应。DD3／PSAmRNA比值批内、批间变异系数分别为3．8％-4,7％和4．1％-4,9％。PCa组尿液DD3／PSAmRNA比值明显高于BPH组（P〈0．01）。尿液DD3／PSAmRNA比值诊断PCa的ROC曲线下面积（AUC）为0．746（95％CI：0．630—0．862）,当截断值为0．254时其敏感度和特异度分别为64．7％和77.3％,其阳性率与临床和病理分级均无关。结论成功建立了双重实时荧光RT—PCR检测尿液DD3／PSAmRNA比值的分子生物学诊断方法。该方法对PCa诊断具有较高特异度和敏感度,且节省操作时间、降低实验成本,有望成为PCa早期诊断的有效方法。     

巢式RT-PCR检测外周血中前列腺特异膜抗原mRNA

目的：应用巢式逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测外周血中前列腺特异膜抗原mRNA（PSM－mRNA)并探讨其临床意义。方法：取40例不同分期前列腺癌患者及对照组30例（15例良性前列腺增生患者，15例健康青年男性）周围静脉血各10ml，用巢式RT－PCR检测PSM－mRNA，并培养LNCaP细胞进行阳性对照。结果：共有24例前列腺癌血标本检测出PSM－mRNA(60.0%)，前列腺增生及健康对照组中无1例阳性，19例伴有远处骨转移的前列腺癌患者中16例检测到PSM-mRNA(84.2%)，未发现远处转移的21例中8例阳性（38．1％）。在10ml正常血液中加入10个LNCaP细胞，可检出PSM－mRNA。结论：PSM－mRNA可作为前列腺癌的辅助诊断指标，PSM－mRNA的检出率与前列腺癌分期（ABCD）、转移与否、血清PSA水平有相关性。     

肝癌外周血AFP mRNA的测定及意义

目的 建立一种灵敏的巢式逆转录聚合酶链反应法（ＲＴ－ＰＣＲ）,用于检测外周血中的ＡＦＰ ｍＲＮＡ。方法 将患者分成四组：原发性肝细胞癌组３８例,慢性肝炎组９例,肝炎后肝硬化组１２例,正常对照组１０例。通过采肝素抗凝外周血、分离单个核细胞、抽提ＲＮＡ、逆转录合成ｃＤＮＡ、设计ＡＦＰ基因引物来进行巢式ＰＣＲ扩增。 结果 所有正常人外周血中ＡＦＰｍＲＮＡ全部阴性,原发性肝细胞癌组的外周血中ＡＦＰ ｍＲＮ