缺氧后适应中HSP70对心肌细胞TLR4/NF-κB信号通路及免疫炎性损伤的影响

为探讨缺氧后适应(hypoxic postconditioning, HPC)中热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)对心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)损伤的作用及其机制,将H9C2心肌细胞分为4组:对照组(常氧培养10 h)、H/R组(缺氧4 h后复氧6 h)、 HPC组(缺氧4 h后行复氧5 min/缺氧5 min,共3次,再复氧6 h)、HPC+槲皮素(quercetin, Quer)组(缺氧前1 h加50μmol/L的HSP70抑制剂Quer后行HPC)。采用Hoechst 33242染色观察细胞形态变化,FACS检测细胞凋亡情况,Western blotting检测HSP70、TLR4、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-6、B淋巴细胞瘤2基因(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bcl-2-associated X protein, Bax)、Caspase-3蛋白表达水平。结果显示,HPC组HSP70、Bcl-2表达水平较H/R组显著升高(P0.05),TLR4、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-6、Bax、Caspase-3表达水平较H/R组显著下降(P0.05);HPC+Quer组HSP70、Bcl-2表达水平较HPC组显著下降(P0.05),TLR4、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-6、Bax、Caspase-3表达水平较HPC组显著升高(P0.05)。该研究提示,HPC可通过上调HSP70表达抑制TLR4/NF-κB信号通路,减轻H/R诱导的心肌细胞免疫炎症损伤。     

瘦素对缺氧复氧L02肝细胞凋亡及Fas/FasL表达的影响

目的： 观察瘦素(leptin)对缺氧复氧人正常肝细胞（L02）凋亡的影响。方法: 将L02细胞分别分为正常对照组、单纯缺氧12 h复氧组(IR组)和缺氧12 h复氧加不同浓度的瘦素（分别为100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L、800 μg/L 和1 600 μg/L）干预组, 以流式细胞仪分析、DNA缺口末端标记 (TUNEL) 试验、荧光定量 PCR 等方法观察leptin 对L02肝细胞凋亡、Fas/FasL mRNA表达的影响。结果: （1）与正常对照组相比,IR组细胞凋亡率和TUNEL细胞阳性率增加（P<0.01）,加用不同浓度瘦素干预组的细胞凋亡率和TUNEL细胞阳性率与IR组相比明显下降（P<0.05）;（2）与正常对照组相比,IR组 L02 细胞中Fas/FasL mRNA表达明显上调(P<0.01);加用不同浓度瘦素干预组与IR组相比,Fas/FasL mRNA表达下降,以400 μg/L瘦素作用明显,结果有显著差异（P<0.05）。结论: 瘦素能减轻缺氧复氧培养L02肝细胞的凋亡,其机制可能与其下调细胞中Fas/FasL mRNA的表达有关。     

附子多糖保护缺氧/复氧乳鼠心肌细胞及其抗内质网应激的机制研究

目的: 观察附子多糖对缺氧/复氧后心肌细胞的保护,并探讨附子多糖的保护机制是否与其抑制内质网应激反应有关。方法: 建立乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型,将乳鼠心肌细胞分为正常对照组、缺氧/复氧组(缺氧3 h后复氧6 h)和不同浓度附子多糖(0.1 g/L、1 g/L、10 g/L、20 g/L)+缺氧/复氧组。MTT法测定心肌细胞存活率,流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,Western blotting分析葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)及caspase-12的表达,荧光定量PCR进一步检测CHOP及caspase-12 mRNA表达。结果: 缺氧复氧后,心肌细胞中内质网应激反应标志蛋白GRP78表达增加,内质网应激凋亡相关蛋白CHOP及caspase-12蛋白和mRNA表达亦明显升高。与缺氧/复氧组相比较,附子多糖预处理24 h后可以有效抑制缺氧/复氧引起的GRP78、 CHOP和caspase-12的表达上调,增加心肌细胞的存活率,抑制心肌细胞凋亡的发生。附子多糖的保护效应呈剂量依赖形式,10 g/L剂量时达到峰值。结论: 附子多糖保护缺氧/复氧后心肌细胞的可能机制与其抑制内质网应激所介导的细胞凋亡途径相关。     

黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元钙调蛋白表达的影响

目的: 观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元钙调蛋白(CaM)表达的影响, 探讨黄芪注射液抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡的机制。方法: 取原代培养8 d的大鼠海马神经元,随机分为4组:正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪注射液溶剂对照组和黄芪注射液组。除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5 h再复氧复糖。各组于复氧复糖后0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、48 h、72 h和120 h采用免疫组织化学染色法检测caspase-3的表达,采用Western blotting和RT-PCR方法检测CaM的表达。结果: 与正常对照组相比,除0 h和0.5 h之外,缺氧缺糖/复氧复糖组各时点海马caspase-3蛋白阳性神经元数目、占神经元总数的百分率及平均吸光度值均明显增多(P<0.05),于24 h达到高峰。黄芪注射液组除0 h和0.5 h之外,各时点以上指标比缺氧缺糖/复氧复糖组显著减少(P<0.05)。黄芪注射液溶剂对照组以上指标与缺氧缺糖/复氧复糖组无差异(P>0.05)。各时点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元CaM 蛋白表达均较正常对照组明显升高(P<0.05);与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时点CaM蛋白表达无明显变化(P>0.05),而黄芪注射液组在各个时点CaM蛋白表达明显降低(P<0.05)。各时点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元CaM mRNA表达均较正常对照组明显降低(P<0.05);与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时点CaM mRNA表达无明显变化(P>0.05),而黄芪注射液组在各个时点CaM mRNA表达明显升高(P<0.05)。结论: 黄芪注射液抑制CaM表达,可能是其减轻缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡的机制之一。     

缺氧后适应中HSP90对补体介导的H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用

目的:探讨缺氧后适应(HPC)中热休克蛋白90(HSP90)对补体介导的大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的作用及机制。方法:大鼠H9c2心肌细胞按处理方式不同分为7组:(1)对照组(常氧培养10 h);(2)H/R组(缺氧4 h后复氧6 h);(3)HPC组(缺氧4 h后行复氧5 min/缺氧5 min,重复3次,再复氧6 h);(4)HPC+格尔德霉素(GA)组(缺氧前20 min加入1μmol/L的HSP90特异性抑制剂GA后行HPC);(5)阴性对照组(转染空载质粒后行HPC);(6)C3过表达组(转染C3a质粒后行HPC);(7)C5过表达组(转染C5a质粒后行HPC)。采用Hoechst 33242染色观察细胞形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测HSP90、C3a、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-6、Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果:HPC在上调HSP90的同时显著减少H/R诱导的心肌细胞凋亡,并抑制C3a、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-6和Bax的表达,增加Bcl-2的表达,上述效...     

PI3K/Akt在线粒体ATP敏感性钾通道开放抑制缺氧复氧大鼠心肌微血管内皮细胞FKN表达中的作用 

目的 观察PI3K/Akt信号在线粒体ATP敏感性钾通道（mito-KATP）开放抑制缺氧复氧大鼠心肌微血管内皮细胞（MMECs）fractalkine(FKN)表达中的作用。方法 培养SD大鼠离体MMECs,建立缺氧复氧损伤模型24皿,随机分为4组( EM>n /EM>=6)：正常对照组（N组）、缺氧/复氧组（H/R组）、二氮嗪预处理+缺氧/复氧组（DZ组）、LY294002+二氮嗪预处理+缺氧/复氧组（LY294002+DZ组）。DZ组加入100μmol/L二氮嗪预处理2h,LY294002+DZ组在加入 100μmol/L LY294002预处理2h后再加入100μmol/L二氮嗪预处理2h,然后和缺氧复氧组同样进行缺氧2h、复氧2h。Hoechst染色观察凋亡细胞显微结构,四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定细胞活力,RT-PCR检测Akt和FKNmRNA水平, Western blotting检测Akt蛋白水平。结果 与N 组比较,H/R组细胞增殖率显著降低（EM>P /EM><0.01）、凋亡率显著升高（EM>P/EM> <0.01）, FKN mRNA和FKN蛋白表达显著增加（P <0.01）、Akt mRNA和Akt蛋白升高（ EM>P/EM> <0.05）。与H/R组比较,DZ组细胞增殖率显著升高（EM>P/EM> <0.01）、凋亡率显著降     

肝细胞生长因子减轻皮质神经元的缺氧/复氧损伤

目的研究肝细胞生长因子(HGF)对缺氧/复氧诱导大鼠皮质神经元凋亡的保护。方法分离培养SD大鼠皮质神经元,经HGF(15、30和60μg/L)预处理后经缺氧/复氧诱导凋亡,用MTT比色法检测细胞存活率;用Hoechst33258染色法和流式细胞仪检测神经元的凋亡;用比色法检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)和caspase-3活性变化。结果与正常对照组相比,缺氧/复氧组神经元的细胞存活率显著下降,细胞凋亡率和caspase-3活性升高(均P<0.05);而HGF预处理12 h可显著逆转缺氧/复氧所致的细胞存活率降低、凋亡率增加、LDH活性上升、caspase-3活性升高的改变(均P<0.05),且这些效应与HGF剂量正相关。此外,HGF的抗凋亡效应可被PI3K/Akt通路抑制剂LY294002阻断。结论HGF减轻缺氧/复氧所诱导的神经元凋亡可能与其激活神经元的PI3K/Akt信号通路、减少caspase-3表达有关。     

MicroRNA-30a调控Beclin-1对缺氧复氧乳鼠心肌细胞的保护效应

目的: 观察microRNA-30a(miR-30a)在原代心肌细胞缺氧复氧中的作用,探讨miR-30a保护缺血再灌注心肌的分子机制。方法: 重组构建慢病毒miR-30a表达载体(LV-GFP-miR-30a)感染原代乳鼠心肌细胞,构建缺氧复氧损伤模型。实验分为正常培养组、单纯缺氧复氧组、LV-GFP加缺氧复氧组、LV-miR-30a-GFP加缺氧复氧组和3-甲基腺嘌呤(3-MA)加缺氧复氧组。Real-time PCR检测缺氧复氧和慢病毒感染对miR-30a的表达影响,Western blotting检测LC3和Beclin-1蛋白表达变化,TUNEL和PI染色检测缺氧复氧后心肌细胞死亡情况。结果: (1)缺氧复氧后心肌miR-30a表达水平下调(P<0.05);(2)慢病毒miR-30a表达载体高效感染后心肌细胞miR-30a表达水平上调(P<0.05),心肌过表达miR-30a下调Beclin-1蛋白表达(P<0.05);(3)心肌过表达miR-30a抑制缺氧复氧后Beclin-1表达(P<0.05);3-MA处理减少缺氧复氧后心肌Beclin-1表达,减少缺氧复氧后LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ(P<0.05);(4)过表达miR-30a和3-MA处理减少缺氧复氧后心肌细胞凋亡(P<0.05)。结论: 心肌细胞过表达miR-30a显著下调Beclin-1;抑制自噬可以减少缺氧复氧后心肌细胞死亡。     

黄芪甲苷对氧糖剥夺复氧后星形胶质细胞上TNF-α与AQP-4表达的影响

目的:探索黄芪甲苷(astragaloside IV,ASIV)对氧糖剥夺复氧(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)后星形胶质细胞上肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis facror-alpha,TNF-α)与水通道蛋-4(aquaporin-4,AQP-4)表达的影响。方法:选用第二代第1 d的星形胶质细胞。将星形胶质细胞放入缺氧培养箱(1%O_2、94%N2、5%CO_2),分别干预1、2、3、4 h,复氧24 h后用RT-PCR和Western Blot检测AQP-4和TNF-α的表达情况。将星形胶质细胞分为对照组、OGD/R组、OGD/R+0.001μmol/ml ASIV组、OGD/R+0.01μmol/ml ASIV组,用RT-PCR和免疫荧光检测AQP-4和TNF-α的表达情况。结果:RT-PCR和Western Blot结果显示:氧糖剥夺复氧后AQP-4和TNF-α的表达均增加,且AQP-4在OGD3 h时表达达到高峰,TNF-α在OGD1 h时表达达到高峰(P0.05);OGD3h+0.001μmol/ml ASIV组和OGD3 h+0.01μmol/ml ASIV组的AQP-4基因表达水平较OGD3 h组相比均明显降低(P0.05);与OGD3 h组相比,OGD3 h+0.001μmol/ml ASIV组的AQP-4蛋白表达水平明显降低(P0.05);OGD1 h+0.001μmol/ml ASIV组和OGD1 h+0.01μmol/ml ASIV组的TNF-α基因表达水平与OGD1 h组相比均明显降低(P0.05);与OGD1 h组相比,OGD1 h+0.001μmol/ml ASIV组的TNF-α蛋白表达水平明显降低(P0.05)。结论:氧糖剥夺复氧模型可以诱导星形胶质细胞上TNF-α和AQP-4的表达,且TNF-α的表达先于AQP-4;黄芪甲苷可能是通过下调TNF-α的表达来影响AQP-4的表达,进而影响细胞水肿。     

复方丹参滴丸对培养的乳鼠心肌细胞缺氧及缺氧/复氧时Fas/FasL蛋白表达的影响

探讨复方丹参滴丸 (DanShenPill,DSP)对培养的乳鼠心肌细胞缺氧及缺氧 /复氧时凋亡相关基因Fas/FasL蛋白表达的影响。方法 :按常规培养新生 4d乳鼠心肌细胞 ,于培养 2 4h后进行缺氧及缺氧 /复氧实验 ,以免疫组织化学方法检测心肌细胞Fas/FasL蛋白表达的变化。结果 :缺氧 4 5h及 10 5h后 ,心肌细胞Fas/FasL蛋白的阳性表达指数 (positiveexpressionindex ,PEI %)均显著高于对照。 10 5h组与 4 5h组无明显差异。复方丹参滴丸组PEI明显低于缺氧组 (P <0 0 5 )。缺氧 30min后再给氧 4h与 10h ,心肌细胞Fas/FasL蛋白的PEI显著高于对照 ,复氧 10h组与 4h组无明显差异 ,复方丹参滴丸组PEI低于缺氧复氧组 (P <0 0 5 )。结论 :缺氧及缺氧 /复氧时均有凋亡相关基因Fas及其配体FasL蛋白表达的增强 ,复方丹参滴丸可通过下调Fas/FasL蛋白表达以减少凋亡从而减轻缺氧损伤及缺氧 /复氧损伤。