Shirley Clift modified-TG小鼠基因组DNA提取方法及其在Gene-Trap中的应用

目的：介绍一种简单、快速、高效同时从数十、甚至上百个小鼠尾巴中提取基因组DNA的方法。方法Shirley Clift modified-TG小鼠Gene-Trap DNA提取法。结果使用该法从小鼠尾巴中获取的基因组DNA的数量、纯度完全适用各种实验,如在C3H/HCJ-Mgrn1md转基因小鼠杂交C57BL/6小鼠Mahogunin基因变异传代培殖实验中,应用鼠尾抽提的DNA进行Gene-trap。类推该法到小鼠其它组织如肝、肾、肌肉和心脏,也同样得到了高质量的基因组DNA。结论该技术可以连续、高效、快速、批量从小鼠组织中提取基因组DNA,为国内利用小鼠进行基因遗传疾病的研究提供了基础方法。     

丙泊酚通过抑制小鼠海马神经元突触释放组织纤溶酶原激活物引起神经毒性损伤

目的：建立钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin,CAST）基因过表达Balb/C小鼠的培育方法,并探讨碱性裂解液提取基因组DNA在子代鼠基因型鉴定中的价值。方法：将雄性C57BL/6-CAST+/-转基因小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠杂交,将雄性CAST+/-杂合子代小鼠与雌性Balb/C野生型子代小鼠杂交,连续杂交至消除C57BL/6小鼠遗传背景。取子代小鼠鼠尾组织,采用碱性裂解液提取基因组DNA,PCR法扩增CAST基因片段,琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。采用柯萨奇B3病毒（CVB3）感染Balb/C-CAST-/-小鼠以建立急性病毒性心肌炎小鼠模型。结果：C57BL/6 CAST+/-转基因小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠连续杂交10代可消除C57BL/6小鼠遗传背景。采用碱性裂解液提取的基因组DNA数量、纯度能够满足后续实验需要,且产物大小与目的片段一致。成功建立Balb/C-CAST-/-基因型小鼠急性病毒性心肌炎模型。结论：成功建立Balb/C-CAST基因过表达小鼠,为后续研究奠定了基础;碱性裂解液提取基因组DNA简便、高效,值得推广。     

钙蛋白酶抑制蛋白基因过表达Balb/C小鼠的繁育及鉴定

目的:建立钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)基因过表达Balb/C小鼠的培育方法,并探讨碱性裂解液提取基因组DNA在子代鼠基因型鉴定中的价值。方法:将雄性C57BL/6-CAST~(+/-)转基因小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠杂交,将雄性CAST~(+/-)杂合子代小鼠与雌性Balb/C野生型子代小鼠杂交,连续杂交至消除C57BL/6小鼠遗传背景。取子代小鼠鼠尾组织,采用碱性裂解液提取基因组DNA,PCR法扩增CAST基因片段,琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。采用柯萨奇B3病毒(CVB3)感染Balb/C-CAST~(-/-)小鼠以建立急性病毒性心肌炎小鼠模型。结果:C57BL/6-CAST~(+/-)转基因小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠连续杂交10代可消除C57BL/6小鼠遗传背景。采用碱性裂解液提取的基因组DNA数量、纯度能够满足后续实验需要,且产物大小与目的片段一致。成功建立Balb/C-CAST~(-/-)基因型小鼠急性病毒性心肌炎模型。结论:成功建立Balb/CCAST基因过表达小鼠,为后续研究奠定了基础;碱性裂解液提取基因组DNA简便、高效,值得推广。     

酚/氯仿法和盐析法提取人类外周血基因组DNA方法的比较

目的比较两种不同方法提取的基因组DNA的纯度、产量和后续实验效果。方法采用酚/氯仿法和盐析法两种方法直接从全血中提取基因组DNA,并采用电泳、PCR和基质支持的激光释放/电离飞行时间质谱分析（MALDI-TOF MS）方法进行检测。结果酚/氯仿法提取的基因组DNA纯度高于盐析法（P〈0.001）,但两组纯度平均值都高于1.80;没有发现两种方法提取的DNA浓度存在差异（P=0.819）。两组DNA在电泳中都没有出现明显拖尾现象,均很容易扩增出胰岛素诱导基因2片段,并且在MALDI-TOF MS检测中,两组DNA样本结果没有明显差异。结论酚/氯仿法和盐析法提取的基因组DNA质量无明显差异。相比酚/氯仿法,盐析法能简便、快速、无毒地进行DNA提取,适合于大规模的分子生物学实验。     

Chelex-100法快速提取石蜡组织中EB病毒基因组DNA

目的:以鼻咽癌石蜡组织为材料,用Chelex-100法提取鼻咽癌组织中EB病毒基因组DNA,并以此为模板扩增出EBNA-3C片段,以建立快速提取石蜡组织中EB病毒基因组DNA的方法。方法:应用原位杂交方法检测30例鼻咽癌石蜡切片组织中EB病毒编码的小RNA(EBER)的情况,应用Chelex-100法快速提取鼻咽癌组织中EB病毒基因组DNA,并以此为模板用PCR扩增出EBNA-3C片段。结果:(1)30例鼻咽癌石蜡组织中原位杂交检测EBER全为阳性。(2)用Chelex-100法从30例鼻咽癌石蜡组织中提取了EB病毒基因组DNA并成功扩增出EBNA-3C片段。结论:Chelex-100法是快速提取鼻咽癌石蜡组织中EB病毒基因组DNA的高效方法。     

外周血DNA提取方法的比较

快速、经济地从外周血或组织中提取高产量、高纯度的DNA,对于疾病的分子水平研究非常重要。目前基因组DNA的提取方法较多,如酚/氯仿、尿素提取法、氯化锌     

外周血单个核细胞DNA提取方法的研究进展

DNA的提取是分子生物学研究的基础技术,提取的DNA的纯度及结构完整性是进行基因工程各项研究所必需的条件.外周血作为一种常用的临床检测材料,如何从外周血单个核细胞中快速、高效的分离提取基因组DNA,对于临床血液检验与分析非常重要.目前,DNA的抽提方法有很多,如酚-氯仿法、盐析法、离心吸附柱法等人工方法,以及磁珠法等半自动方法及试剂盒法.本文就从外周血血液中提取DNA方法的原理、具体操作步骤及方法评估等给予简要的综述.     

基因组DNA快速提取方法的探讨与应用

目的 探讨以硫氰酸胍作为组织细胞裂解液的可行性,并建立基因组DNA快速提取方法.方法 利用硫氰酸胍等作为裂解消化液,分别从组织、细胞和全血中提取基因组DNA.采用紫外分光光度仪检测基因组DNA含量及纯度,琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性,以提取的基因组DNA作为模板进行PCR扩增GAPDH基因,并用该方法检测凋亡细胞DNA ladder.结果 基因组DNA提取时间短(耗时30～50 min),基因组DNA含量85 μg/mg(组织),52 μg/1×107细胞,27 μg/ml(血液).A260 nm/A280 nm比值在1.8～1.9之间,电泳显示基因组DNA完整性好,无蛋白质和RNA污染,基因组DNA长度大于48 kb.PCR扩增出306 bp GAPDH目的 基因,肿瘤细胞经抗癌基因诱导凋亡后琼脂糖凝胶电泳可见180～200 bp典型的凋亡带.结论 硫氰酸胍可作为基因组DNA提取裂解消化液,该方法具有简便、快捷、稳定性好等特点.     

全自动提取大量全血样本基因组DNA方法的建立及其在HLA基因分型中的应用

目的 研究和建立从大量全血样本中提取基因组DNA的有效方法,以应用于Luminex HLA 流式磁珠基因分型.方法 使用自动工作站(瑞士TECAN公司)提取基因组DNA,提取的DNA样本用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度,DNA的完整性用琼脂糖电泳检测,并统计分析每一DNA样本流式磁珠HLA-A、B和DRB1基因扩增产物经探针分子杂交后的荧光信号强度.结果 从60μl全血中提取基因组DNA,产量平均为(1.584±0.824)μg,样本的A260/A280值平均为1.741±0.229.琼脂糖电泳法测得DNA的分子量约为21kb.结论 本方法适用于从大量全血样本中快速提取基因组DNA,所得基因组DNA适用于高通量HLA流式磁珠基因分型等下游的分子生物学实验.     

三种简易提取全血基因组DNA方法的比较

目的比较兰种快速、简便、适用、低成本的从全血中提取基因组DNA的方法。方法选用快速氯仿-异戊醇法、简化盐析法、改良碘化钾法直接从全血中提取基因组DNA。结果改良碘化钾法提取的DNA纯度及含量最高，快速氯仿-异戊醇法次之，简化盐析法则相对较低。结论改良碘化钾法为较好的提取基因组DNA的方法。     

改良盐酸胍法提取脐血DNA 用于HLA基因分型

为了比较经典的盐酸胍(Gu·HCl)抽提DNA法和改良盐酸胍抽提DNA法在提取脐血DNA的效果,探讨这两种方法在脐血组织相溶性抗原(HLA)基因分型中的应用,使用盐酸胍抽提DNA法和改良盐酸胍抽提DNA法提取72例脐血标本的DNA,并分别测定其DNA的浓度和纯度,采用序列特异性引物聚合酶反应方法(PCRSSP)比较这两种方法所提取的DNA.结果表明两种方法提取脐血DNA均获成功;根据对DNA的质量监测发现,用改良盐酸胍抽提DNA在质量上较盐酸胍法好;用于HLA基因分型时,改良盐酸胍抽提DNA法可减少非特异性条带的出现.结论改良盐酸胍抽提DNA法不但操作简便,成本下降,而且在最少血量中能提取出高纯度的DNA,减少非特异性条带的出现.该法完全可以满足脐血库的日常脐血样品DNA的提取以及脐血HLA基因分型的要求.     

固相载体法提取全血中DNA

目的　寻找简便快速的从全血中分离高质量DNA的方法。方法　分别用异硫氰酸胍 硅胶法和经典的酚 氯仿法从全血中提取DNA并进行比较。结果　异硫氰酸胍 硅胶法提取DNA平均含量 (3.70 μg/ 10 0 μl全血 )高于酚 氯仿法 (2 .99μg/ 10 0 μl全血 ) ,P <0 .0 5 ,纯度无显著差异。 2法抽提的DNA琼脂糖凝胶电泳结果及PCR和限制性酶切反应的效果无差异 ,但异硫氰酸胍 硅胶法更为简便 ,所需时间不到 1h。结论　异硫氰酸胍 硅胶法提取全血中DNA简单、快速且可靠     

改良碘化钾法提取冻存外周血基因组DNA的方法探讨

目的探讨用改良碘化钾法（改良法）提取长期冻存外周血基因组DNA的方法。方法对碘化钾（KI）法加以改良,包括：血量由100μL增加到200μL;使用0．9％NH4CL溶液代替无菌重蒸馏水裂解红细胞;增加裂解白细胞膜的5mol／LKI溶液的用量（为70μL）;低温（4℃）离心。然后用改良碘化钾法从82份．80℃冻存外周血标本中提取基因组DNA。同时使用碘化钾法提取其中的30份血标本,比对两种方法提取DNA的浓度和纯度,并进行CYP2C19相关基因PCR扩增。结果两种方法所提取的DNA浓度和纯度分别是碘化钾法为128．2±34．9μg／mL和A260／A280 1．74±0．08,改良法为220±91．29μg／mL和A260／A280 1．87±0．12。改良法获得的DNA纯度更高,差异有统计学意义（P〈0．01）,通过增加样本量及对方法进行改良获得的DNA量较多。对改良后方法提取的基因组DNA进行PCR扩增,结果稳定。结论改良碘化钾法从长期冻存外周血中所提取的基因组DNA质量较高,能够满足对临床冻存样本研究的需求。     

DNA工作站在HLA测序分型中的应用

目的 建立从全血样本中高通量提取基因组DNA的方法,以应用于HLA常规测序分型.方法 采用DNA工作站及2 ml深孔板,从400份全血样本中提取基因组DNA.用紫外分光光度仪测定其浓度和A<,260>/A<,280>值,并采用琼脂糖电泳检测DNA的完整性.扩增产物经纯化后作为测序模板,产物经酒精/EDTA/NaOAc法纯化,用ABI Prism<'TM>3730测序仪电泳检测.相关的分析软件分析HLA基因型.结果 使用400μL全血中400份样本的DNA产量平均为(3.217±0.715)μg,A<,260>/A<,280>值平均为1.710±0.103;琼脂糖电泳表明DNA的分子量均大于15×10<'3>;HLA-A、HLA-B和HLA-DRB1座位序列碱基峰高均在2000以上,测序评分在75分以上.48份HLA-A、B和DRB1基因型已知的室内质控样本,经本文的方法提取DNA并进行HLA基因分型,经盲检质控检测,所得到的结果与已知的HLA基因型相一致.结论 采用本方法所提取的DNA能稳定、可靠地应用于骨髓捐献者样本的HLA-A、B和DRB1座位测序分型,具有快速、高通量化的特点和广泛的应用前景.     

Modified salting-out method: high-yield, high-quality genomic DNA extraction from whole blood using laundry detergent

Different approaches have been used to extract DNA from whole blood. In most of these methods enzymes (such as proteinase K and RNAse A) or toxic organic solvents (such as phenol or guanidine isothiocyanate) are used. Since these enzymes are expensive, and most of the materials that are used routinely are toxic, it is desirable to apply an efficient DNA extraction procedure that does not require the use of such materials. In this study, genomic DNA was extracted by the salting-out method, but instead of using an analytical-grade enzyme and chemical detergents, as normally used for DNA isolation, a common laundry powder was used. Different concentrations of the powder were tested, and proteins were precipitated by NaCl-saturated distilled water. Finally, DNA precipitation was performed with the use of 96% ethanol. From the results, we conclude that the optimum concentration of laundry powder for the highest yield and purity of isolated DNA is 30 mg/mL. The procedure was optimized, and a final protocol is suggested. Following the same protocol, DNA was extracted from 100 blood samples, and their amounts were found to be >50 microg/mL of whole blood. The integrity of the DNA fragments was confirmed by agarose gel electrophoresis. Furthermore, the extracted DNA was used as a template for PCR reaction. The results obtained from PCR showed that the final solutions of extracted DNA did not contain any inhibitory material for the enzyme used in the PCR reaction, and indicated that the isolated DNA was of good quality. These results show that this method is simple, fast, safe, and cost-effective, and can be used in medical laboratories and research centers.     

一种改良的人DNA微量快速检验技术

目的 探索一种以口腔粘膜脱落细胞为材料的安全、高效、低成本、敏感性高的人DNA微量快速检测方法。方法 采用从漱口液或棉签擦拭口腔粘膜获取脱落细胞,应用混合树脂（Chelex100）煮沸沉淀法提取DNA;用PCR分别对线粒体特异性DNA片断和基因组中的特定基因进行扩增检测。结果 通过对线粒体DNA中440 bp的非编码片段和染色体基因组中220 bp的乙醛脱氢酶DNA片段进行扩增,结果显示,从漱口液脱落细胞提取的DNA中可以稳定地扩增出上述两种DNA片断。结论 建立了一种改良的人口腔粘膜脱落细胞DNA微量快速检验技术。该法取样方便,DNA样品获取量较大,一次取样可同时进行多项线粒体和基因组标志DNA片段的快速PCR检测。     

自动提取大样本全血基因组DNA方法的建立

目的建立从大样本全血中自动提取基因组DNA的方法,并评价提取DNA的质量和产量。方法基因组DNA使用MiniPrep75-Ⅱ自动工作站提取;DNA样本的纯度和含量用紫外分光光度法测定;DNA的完整性用琼脂糖电泳法测定。结果从100μl全血中平均可提取到(7.33±2.58)μg基因组DNA;DNA样本的纯度平均为1.647±0.135(A260/A280);琼脂糖电泳法测得DNA的分子量约为21kb。结论本方法可以快速从大样本全血中自动提取较高质量的基因组DNA,所得DNA适用于下游的分子生物学实验。     

改良碘化钠法提取人类微量全血基因组DNA的探索

目的通过改良碘化钠(NaI)法,建立一种简单、快速、经济的从人微量全血中提取基因组DNA的方法。方法采用经典NaI法和改良NaI法分别从人微量全血中提取基因组DNA,并进行常规和荧光定量聚合酶链反应(PCR),比较两种方法DNA提取的效果。结果采用改良NaI法从人外周全血中提取的DNA浓度和纯度与经典NaI法相比较,差异无统计学意义(P0.05),并且可以在较短时间内获得满意的常规和荧光定量PCR结果,且耗时较短。结论改良NaI法是一种简便、快速的提取人微量全血基因组DNA的方法,在临床和基础研究中具有较大的应用价值。