胃癌及癌前病变中hMLH1启动子区甲基化及表达的研究

目的：探讨具微卫星不稳定性表型的胃癌、癌前病变组织中hMLHl基因启动子区甲基化及其表达的情况。方法：采用同工酶切产物特异性扩增法检测组织hMLHl基因启动子区甲基化情况。并且免疫组化法检测其在组织中的表达。结果：胃癌组织、癌前病变组织甲基化的发生率分别为4l.5％、19．6％；MSI-H、MSI-L、MSS组中甲基化发生率及蛋白异常表达率分别为100％、71．4％；57．9％、52．6％；l.5％、0。结论：MSI阳性组织中hMLHl基因启动子区甲基化发生率高于MSS组，且蛋白表达异常的发生率明显高于MSS组。表明hMLHl基因异常甲基化为基因转录失活的主要原因，且此基因甲基化为胃癌组织中MSI发生的重要因素,从而促进胃癌的发生。     

端粒酶反转录酶启动子突变在肿瘤发生中的研究进展

端粒酶催化端粒延长能维持染色体组的完整性,是肿瘤发生的重要生物学标志。端粒酶反转录酶(TERT)是端粒酶中的催化亚单位,其活性在多数体细胞中受到抑制,在肿瘤细胞中TERT基因过表达的确切机制尚不清楚。在黑色素瘤细胞中存在TERT启动子突变,且具有较高的复现率。另外,TERT启动子突变还广泛存在于神经胶质瘤等多类肿瘤中,可激活TERT,且与肿瘤的恶性程度密切相关。     

胃癌及癌前病变中端粒长度变化及端粒酶活性表达

恶性肿瘤是危害人类健康最严重的疾病之一 ,它的形成是一个多阶段过程。原癌基因激活、抑癌基因的突变等是肿瘤形成的分子基础 ,近年来 ,又发现绝大多数恶性肿瘤中存在端粒酶表达异常。 1989年 Morin[1]在人宫颈癌细胞 (Hela细胞 )中首先发现了活化的端粒酶 ,但当时并未引起人们注意 ,直到 1994年Counter等 [2 ]发现端粒酶活性仅存在于卵巢癌组织细胞中 ,而正常卵巢上皮组织则检测不到 ,这才受到关注。胃癌是我国死亡率最高的恶性肿瘤之一 ,目前有研究表明 ,在胃癌组织中存在着异常高的端粒酶活性 ,端粒酶表达异常在胃癌发生发展中具有重…     

榄香烯乳对胃癌细胞人端粒酶反转录酶及其启动子的影响

目的：观察榄香烯乳对胃癌细胞株SGC7901人端粒酶反转录酶（hTERT）表达及其启动子的影响,以深入了解榄香烯乳的抗癌机制。方法：以榄香烯乳处理胃癌细胞,分别采用实时定量PCR和免疫荧光标记法检测癌细胞hTERT mRNA和蛋白水平的表达。采用脂质体转染法将携带hTERT启动子和报告基因的质粒转染至胃癌细胞株SGC7901细胞中,2h后加入不同浓度的榄香烯乳,孵育48h后,分别检测其报告基因萤虫素酶活性。结果：榄香烯乳处理后,胃癌SGC7901细胞hTERT mRNA和蛋白水平呈浓度和时间依赖性下调。榄香烯乳处理组萤虫素酶活性下降,且呈浓度依赖性。结论：榄香烯乳可能通过下调hTERT启动子活性,抑制hTERT表达,从而抑制胃癌细胞端粒酶活性。     

胃癌及癌前病变中端粒酶活性的表达

目的：观察端粒酶活性在胃癌及胃癌前病变细胞和组织中的表达。方法：采用蜡膜介导热启动端粒重复扩增ＰＣＲ模型方法。结果：胃癌细胞株端粒酶活性３株均呈阳性，在３８例胃癌中，３２例端粒酶活性阳性，其中进展期胃癌为３０／３５，早期胃癌为２／３，而邻近胃组织为２／３８，在２９例胃癌前病变中，５例端粒酶活性阳性，其中不典型增生轻度，中度及重度分别为１／８，１／４和１／３，肠上皮化生和胃息肉分别为１／８和１／６，     

胃癌组织中端粒酶活性的检测及临床意义

目的：探讨端粒酶活性在胃癌发生发展过程中的作用。方法：采用端粒重复序列扩增法（ＴＲＡＰ法）检测了４２例胃癌，３７例癌旁及２７例正常组织（２１例胃癌及６例消化性溃疡手术切缘组织）的端粒酶活性，同时对胃癌组织端粒酶提取物进行梯度稀释，以检测其在活性大小。结果：胃癌及癌旁组织中端粒酶阳性率分别为９５．２％（４０／４２）及５４．１％（２０／２７），正常组织中未检出端粒酶活性，端粒酶激活与患者性别，肿瘤的部     

胃癌组织中端粒酶活性的检测

目的　检测中国人胃癌组织及相应癌旁组织中的端粒酶活性,探讨将其作为胃癌肿瘤标志物的可能性。方法　采用以ＰＣＲ为基础的ＴＲＡＰ（ｔｅｌｏｍ ｅｒｅ ｒｅｐｅａｔａｍ ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）方法检测了４２ 例胃癌组织、４２ 例相应癌旁组织及１ 例胃溃疡伴肠上皮化生及轻度不典型增生组织中的端粒酶活性表达。结果　４２ 例胃癌组织中,３７ 例显示端粒酶活性表达阳性,阳性率为８８１％ ;而在４２ 例相应癌旁组织中,仅有２ 例显示端粒酶活性表达阳性,１ 例胃溃疡伴肠上皮化生及轻度不典型增生组织端粒酶活性表达阳性。结论　以上结果提示端粒酶检测有可能成为胃癌辅助性诊断手段     

胃癌及癌前病变中p16基因启动子异常甲基化研究

目的 探讨p16基因异常甲基化在胃癌发生中的作用.方法 应用甲基化特异性pCR技术检测胃腺癌及癌前病变组织中p16基因甲基化状态,并应用免疫组化染色检测p16蛋白的表达.结果 慢性萎缩性胃炎、重度异型增生及胃腺癌组织p16基因启动子甲基化阳性率分别为11.1%、40%和43.3%.胃腺癌组与浅表性胃炎组、萎缩性胃炎组及轻-中度异型增生组间p16基因甲基化阳性率差异有显著性(P＜0.05),而与重度异型增生组间差异无显著性(P＞0.05).p16蛋白阳性率在胃腺癌组、重度异型增生、轻-中度异型增生、萎缩性胃炎组和浅表性胃炎组分别为36.7%、40%、85.7%、83.3%和100%;在19例p16基因甲基化阳性病例中,18例p16蛋白缺失.结论 p16基因启动子异常甲基化可能是其在胃癌蛋白表达缺失的主要原因.p16基因启动子异常甲基化可能是胃癌发生的早期事件,在胃癌的发生起重要作用.     

胃癌组织hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化状态研究

目的 探讨hMSH2基因启动子区的甲基化状态与微卫星DNA不稳的关系。方法 采用甲基化特异性PCR方法检测hMLH1和hMSH2基因启动子区的甲基化状态，采用PCR为基础的方法检测微卫星DNA不稳。结果 正常胃粘膜未见hMLH1和hMSH2基因启动子区的高甲基化。68例胃癌中检出hMLH1高甲基化11例，占16．2％，而且均为去甲基化和高基化并存，未见有hMSH2高甲基化者。将MSI分为高频率MSI（MSI－H，≥2个位点）8例、低频率MSI（MSI－L,仅为1个位点）9例和MSI阴性（MSS）51例3组，结果MSI－H组hMLH1高甲基化的检出率显著高于MSI－L和MSS组（P＜0．01）。结论 hMLH1高甲基化可能参与了MSI病理途径，而hMSH2甲基化状态可能与MSI途径无关。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法：用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3．1( )载体,得到pcDNA3．1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3．1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果：克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论：克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。     

胃癌前病变组织中人端粒酶逆转录酶、p53蛋白的表达与幽门螺杆菌的关系

目的：探讨胃癌前病变组织中人端粒酶逆转录酶（hTERT）和p53蛋白的表达状况及其与幽门螺杆菌（Hp）根除前后的关系。方法：采用实时定量荧光RT-PCR方法检测胃粘膜中hTERT,将hTERT与GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）拷贝数之比的100倍作为标准化hTERT（NhTERT）,用快速尿素酶法和Warthin-Starry银染色法检测Hp,同时用免疫组化检测p53蛋白的表达。结果：Hp阳性组hTERTmRNA和p53蛋白的表达率均显著高于Hp阴性亚组的表达率（均P〈0.05）。Hp根除组hTERTmRNA的表达率显著低于未根除组（P〈0.05）,未根除组与阴性对照组之间无显著性差异。结论：在胃癌前病变阶段,Hp感染与端粒酶表达水平及p53蛋白之间有直接关系,提示端粒酶、Hp感染、p53蛋白在胃癌的发生、发展中起重要作用及Hp根除的必要性。     

人端粒酶蛋白催化亚单位反义基因转染对胃癌细胞恶性表型的逆转作用

目的 探讨人端粒酶蛋白催化亚单位（hTRT）反义基因治疗对胃癌细胞恶性表型的逆转作用。方法 采用基因重组技术,构建hTRT正比、反义真核表达载体,采用脂质体法导入SGC－790细胞、反义真核表达载体,并导入SGC－790胃癌细胞株中,获得稳定表达正、反义基因的细胞系7901－S、7901－AS1和7901－AS2。7901－AS1和7901－AS2出现显著生长抑制现象,端粒酶活性明显下降,细胞凋亡增加,异型性减小,G0／G1期细胞增加,S和G2M期细胞减少,增殖指数减小,软琼脂中克隆形成,裸鼠体内成瘤消失。结论 hTRT反义基因治疗可以明显抑制SGC－7901细胞的增殖,部分逆转肿瘤细胞的恶性表型,其机制可能主要是通过诱导细胞分化而非诱导细胞凋亡途径实现的,提示hTRT基因可以作为肿瘤治疗的靶基因。     

白藜芦醇对大肠癌细胞hTERT表达及其启动子的影响

目的：观察白藜芦醇对大肠癌细胞生长增殖的影响,并从人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcfiptase,hTERT）表达及其启动子方面探讨可能的抗癌机制。方法：以不同浓度的白藜芦醇处理大肠癌LS-174T细胞后,收集细胞,分别采用荧光实时定量RT—PCR和蛋白质印迹法检测癌细胞hTERTmRNA和蛋白水平。采用脂质体转染法将携带hTERT启动子和报告基因的质粒转染至大肠癌LS-174T细胞中后,加入不同浓度的白藜芦醇,孵育48h后,检测报告基因萤虫素酶活性。结果：白藜芦醇处理大肠癌细胞后,增殖明显受到抑制,且与浓度有关。癌细胞hTERTmRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性。白藜芦醇处理组萤虫素酶活性下降,且呈浓度依赖性。结论：hTERT启动子活性和hTERT表达下调,可能是白藜芦醇抑制癌细胞增殖的重要机制之一。     

hTERT蛋白在胃腺癌组织中定量表达的研究

目的 探讨hTERT蛋白在胃腺癌组织中表达情况及其与胃癌进展的关系.方法 对68例胃腺癌和10例正常组织采用流式细胞术定量检测hTERT蛋白的表达.结果 hTERT蛋白流式细胞术测定在进展期胃癌、早期胃癌和正常胃黏膜荧光指数FI值分别为1.92±0.17、1.60±0.18和0.98±0.15,进展期胃癌hTERT含量高于早期胃癌(P＜0.01)、早期胃癌高于正常胃黏膜(P＜0.01);中、低分化腺癌hTERT蛋白FI值分别为1.89±0.20和1.92±0.19显著高于高分化腺癌1.71±0.19(P＜0.01);有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者(P＜0.05);T1-T2级胃癌TERT蛋白FI值高于T3-T4级胃癌(P＜0.05).结论 hTERT高表达与胃腺癌进展相关,可作为胃癌进展的生物学标志之一.     

hTERT启动子调控下HSV-tk/GCV系统对人卵巢癌细胞系Skov3的杀伤作用

目的 探讨hTERT启动子驱动下的HSV-tk／GCV系统对人卵巢癌细胞系Skov3的体外杀伤作用。方法 应用分子生物学方法构建hTERT启动子调控下的tk基因真核表达载体pBTdel-279-tk,并应用脂质体转染法将之转入Skov3、正常人卵巢上皮细胞(NOEC)和人胚肺成纤维细胞中,加入GCV,用MTT法和流式细胞术检测pBTdel-279-tk／GCV系统对各种细胞的杀伤作用;应用RT-PCR法检测pcDNA3-tk和pBTdel-279-tk转染前后卵巢癌细胞和正常细胞中tk基因的表达情况。结果 pBTdel-279-tk／GCV对端粒酶阳性的卵巢癌细胞有明显的杀伤作用,而对端粒酶阴性的正常细胞则无;hTERT启动子系统诱导卵巢癌细胞凋亡的效能与CMV启动子近似,两者差别无显著性意义。pcDNA3-tk转染后,在Skov3细胞和NOEC中均可探测到tk基因;而pBTdel-279-tk转染后只有Skov3可探测到tk基因,NOEC中则无。结论 hTERT启动子调控下的tk基因治疗是一种新的卵巢癌靶向治疗方法,具有更高的特异性和高效性。     

端粒酶启动子调控tk基因靶向性杀伤鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨端粒酶催化亚单位启动子/胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(hTERTp/tk)基因特异载体在体外靶向性杀伤鼻咽癌细胞的效应.方法 通过细胞转染将hTERTp/tk转染鼻咽癌细胞株中,采用RT-PCR及MTT法检测hTERTp/tk/pGL3体外特异性杀伤鼻咽癌细胞的效应及其tk基因、端粒酶表达.结果 转染hTERTp/tk/pGL3后可见tk基因表达,端粒酶及其hTERT表达较对照组下降.hTERTp/tk/pGL3能特异性杀伤鼻咽癌HNE1细胞,而对正常成纤维细胞无杀伤作用,hTERTp/tk/pGL3杀伤细胞的效应比阳性对照CMV/tk/pGL3的无选择性杀细胞作用略低.结论 hTERTp/tk基因特异表达系统具有靶向性杀伤鼻咽癌细胞的作用及抑制肿瘤细胞端粒酶活性.     

人端粒酶反转录酶启动子的克隆与肿瘤靶向治疗的研究

目的 克隆hTERT启动子,并观察hTERT启动子调控下tk/GCV系统对人肺癌细胞系A549的特异性杀伤效果。方法 设计特异性引物,以HepG2基因组DNA为模板,用PCR方法扩增hTERT启动子;分别构建hTERT启动子和hCMV启动子调控的LacZ、tk基因真核表达载体;将上述质粒用脂质体转染A549细胞和人胚肺成纤维细胞系MRC5后,通过RT-PCR和β-Gal染色观察hTERT启动子工作情况;用MTT法检测不同浓度的GCV对A549和MRC5细胞的细胞毒作用。结果 成功克隆hTERT上游-280bp~+40bp的核心启动子。RT-PCR和β-Gal染色显示hTERT启动子能有效地调控其下游tk基因、LacZ基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性转录和表达;hTERT启动子调控的tk/GCV系统对端粒酶阳性的肿瘤细胞系A549有明显的特异性杀伤效应。结论 hTERT启动子可特异性地调控目的基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达而不影响正常的细胞,表明端粒酶启动子调控自杀基因的表达是一种很有希望的肿瘤靶向基因治疗策略。     

反义hTRT转染对SGC-7901胃癌细胞株形态学的影响

目的 探讨人端粒酶蛋白催化亚单位（hTRT）反义基因转染对SGC－7901胃癌细胞株形态学的影响;方法 采用脂质体法将hTRT正、反义真核表达载体导入SGC－7901胃癌细胞株中,从光镜、电镜水平观察转染细胞形态学的变化。结果 与未转染细胞相比,光镜下hTRT反义基因转染的SGC－7901胞体增大,胞浆丰富,分裂相减少,核浆比增大,异型性减小;透射电镜下反义基因转染细胞细胞器丰富,胞浆内出现分泌泡样结构及胞质内微囊;扫描电镜下反义基因转染细胞表面微绒毛增多,胞体周围可见大量颗粒样物质,根据AB／PAS染色结果,这些颗粒样物质有可能是其分泌的粘液颗粒。结论 hTRT反义基因有促进SGC－7901细胞分化的作用。     

肾癌尿沉渣中人端粒酶逆转录酶基因启动子区甲基化检测的临床意义

目的：探讨人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子区在肾癌患者尿沉渣中DNA甲基化状态及临床意义。方法提取76例肾癌（肾癌组）和38例非肾癌（对照组）患者术前尿沉渣中的DNA,经亚硫酸氢钠修饰后,应用甲基化特异性PCR（MSP）方法对DNA进行扩增,将MSP产物进行凝胶电泳观察分析甲基化情况。结果肾癌组患者hTERT启动子区高甲基化发生率明显高于对照组（P＜0．05）,但hTERT启动子区高甲基化与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分期无统计学关联（P＞0．05）。结论尿沉渣中hTERT启动子区甲基化与肾癌发生相关,并且其作为一种无创性检测有助于肾癌的临床诊断。