荧光定量PCR检测HCV RNA的测量不确定度评定及应用

目的 对荧光定量PCR测定HCV RNA的测量不确定度进行评定及临床应用.方法 利用罗氏LightCycler1.0荧光定量PCR分析仪选取2个HCV RNA结果阳性的临床样本,HCV RNA拷贝数分别为1×103 copies/ml～1×105 copies/ml和1×105 copies/ml～1×107 copies/ml,各重复测定10次,对测定HCV RNA测量过程的分析,确定并简化测量不确定度的来源,采用不确定度A类评定方法以及不确定度B类评定方法,量化各不确定度分量,确定合成不确定度与扩展不确定度.结果 测量不确定度来源主要有:批内重复性、批间重复性,温度时间,消毒前消毒后和方法偏倚等因素.在各分量中,由温度时间影响导致的不确定度所占比例最大,批间重复性试验所占比例最小.荧光定量PCR测定HCV RNA的扩展不确定度U=0.268.结论 通过荧光定量PCR测定HCV RNA测量不确定的研究有助于各实验室结果的表达趋于一致,可使来自不同实验室的结果或同一实验室不同时期的结果具有可比性.     

荧光定量PCR测定HBV DNA测量不确定度的评定与应用探讨

目的 探讨荧光定量聚合酶链式反应(PCR)测定乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)测量不确定度的评定与临床应用价值。方法 采用批内不精密度和批间不精密度数据评定A类不确定度,采用参加卫生部临床检验中心的室间质评(EQA)数据评定B类不确定度; 根据A类和B类不确定度结果确定合成不确定度和扩展不确定度; 利用不确定度进行HBV DNA检测结果的比较,并建立不确定度报告模型。结果 采用EQA靶值评定偏移引入的不确定度U_bias,以偏移与偏移的标准差评定偏移的不确定度,扩展不确定度U₁(k=1.96,n=2)在检测值为10³和10⁶ IU/ml时分别为0.330 2和0.249 6,而以方法和实验室偏移评定偏移的不确定度,扩展不确定度U₂分别为0.307 6和0.239 4; 采用同方法组均值评定U_bias,U₁分别为0.315 9和0.230 4,U₂分别为0.292 2和0.219 3。如前后两次检测结果均在本实验室测量,取U为0.330 2,两者差值≥0.46(LOG值),差异具有统计学意义。结论 荧光定量PCR测定HBV DNA引入扩展不确定度使结果具有可比性,有助于临床对患者体内病毒复制水平及抗病毒疗效的评价。     

国产和进口荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的比对分析

目的分析国产和进口实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂检测乙型肝炎病毒(HBV)-DNA的相关性,探讨国产和进口试剂在临床应用中的差异。方法使用国产和进口试剂平行检测262例乙型肝炎(乙肝)患者血浆当中的HBV-DNA水平,国产试剂采用手工提取标本,罗氏LightCycler480Ⅱ(LC480Ⅱ)进行核酸扩增;进口试剂则采用罗氏COBAS AmpliPrep(CAP)和COBAS Taqman48(CTM)进行标本提取和扩增;对HBV-DNA病毒载量数据进行对数转换(log10),并将两组数据进行相关分析。结果国产和进口试剂检测结果,经线性拟合,R2=0.814 3。HBV-DNA浓度在10~103 IU/mL的标本,R2=0.300 6;浓度在104~105 IU/mL的标本,R2=0.411 8;浓度在106~108 IU/mL的标本,R2=0.801 7。进口试剂阳性检出率为75.57%(198/262),明显高于国产试剂阳性检出率[65.65%(172/262)]。结论国产试剂和进口试剂相比,相关性良好。HBV-DNA浓度在106~108IU/mL时,相关性最高;浓度在104~105 IU/mL时,相关性一般;浓度在10~103 IU/mL时相关性较差,国产试剂与进口试剂有明显差异,灵敏度有待进一步提高。     

荧光定量PCR测定HBV DNA测量不确定度评定的探讨

目的探讨利用质控数据评定荧光定量聚合酶链反应(PCR)测定HBV DNA测量不确定度的可行性。方法用批内不精密度和批间不精密度数据评定A类不确定度;分别用参加卫生部临床检验中心和美国病理学家协会(CAP)的室间质评数据评定B类不确定度;最后评定合成不确定度和扩展不确定度。结果利用卫生部临床检验中心室间质评反馈结果评定的扩展不确定度(k=1.96,n=1)在检测值为104~105和106~107IU/mL时分别为0.521 6和0.529 8;利用CAP能力比对反馈结果评定的扩展不确定度(k=1.96,n=1)在检测值为104~105和106~107IU/mL时分别为0.973 1和0.977 5。结论目前用室间质评数据评定PCR测定HBV DNA的不确定度不能真实反映实验室的不确定度,使用国家标准物质评定不确定度更合适。     

荧光定量PCR检测HBV-DNA的临床意义

本文采用荧光定量ＰＣＲ法对本院临床和门诊血清标本2 0 0份进行ＨＢＶ ＤＮＡ含量测定 ,探讨ＨＢＶ ＤＮＡ含量与肝病变发展的关系。1　材料和方法1 1　材料　标本取自确诊或怀疑乙肝的患者及无症状体检者 ,共检测 2 0 0例。试剂∶荧光定量ＨＢＶ ＤＮＡ试剂盒由匹基公司提供。仪器∶ＰＥ5 70 0ＰＣＲ仪。1 2　方法　ＨＢＶ ＤＮＡ定量分析采用荧光定量ＰＣＲ法。按操作说明书进行。1 3　统计学方法　各组ＨＢＶ ＤＮＡ含量均数比较采用ｔ检验。遇有阴性结果不参加平均值的统计。2　结果2 1　ＨＢＶ ＤＮＡ、ＦＱ ＰＣＲ标准曲线　ＨＢＶ …     

荧光定量PCR检测HBV-DNA结果分析

目前临床上对乙型肝炎病毒感染的检测主要有两类,血清标志物检测和病毒核酸的检测。由于HBV—DNA能直接反映HBV复制及传染性,故HBV—DNA定量检测已越来越受到临床重视。作者采用荧光定量PCR对866例临床血清标本进行血清HBV—DNA及血清免疫学指标的检测结果进行分析,现报道如下。     

实时荧光PCR检测乙型肝炎患者HBV-DNA的临床意义

目的对应用实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测的乙型肝炎(乙肝)病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)结果进行分析,探讨该检测方法的临床意义。方法选择2009年6月至2011年5月门诊及住院的乙肝患者430例,抽取430份血清标本,应用酶联免疫吸附测定(ELISA)法进行血清学标志物检测(HBV-M),并按照乙肝两对半定性结果分为6组,用实时荧光PCR进行HBV-DNA检测。结果绝大部分乙肝患者实时荧光PCR检测HBV-DNA的结果与HBV-M检测的结果一致。其中大三阳组和小三阳组PCR检测HBV-DNA阳性结果多,拷贝数较高,HBsAb(乙肝表面抗体)(+)或HBsAg(乙肝表面抗原)(-)的血清标本PCR检测HBV-DNA阳性结果很少,拷贝数也较低。结论实时荧光PCR检测HBV-DNA,能够正确反映乙肝患者体内乙肝病毒感染和复制情况,有利于指导临床治疗和进行疗效判断。     

HBV-DNA实时荧光定量检测程序的测量不确定度评估及分析

目的根据国际标准化组织(ISO)15189实验室认可要求,评估乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量检测程序的测量不确定度。方法采用室内质控获得的中间精密度计算HBV-DNA测量重复性引入的测量不确定度,采用卫生部室间质量评价结果计算HBV-DNA偏倚引入的测量不确定度,将二者合成计算出合成标准不确定度和扩展不确定度。结果 HBV-DNA在室内质控水平为4.03(对数的倒数)时实验室内测量重复性引入的相对测量不确定度为3.45%,HBV-DNA偏倚引入的相对测量不确定度为5.27%。相对合成标准不确定度为6.30%;相对扩展不确定度为12.60%;而HBV-DNA在该水平的相对测量不确定度可表示为(4.03±12.60)%。结论 HBV-DNA实时荧光定量检测程序的测量不确定度可作为检验结果质量持续改进的依据,并用于解释临床结果。     

实时荧光定量PCR在人血液循环DNA检测中的应用

循环DNA主要存在于人血浆和血清等体液中，在多种人类疾病中含量升高，具有临床诊断意义和预后判断价值。本研究以人工重组质粒DNA为内参照物，建立双重实时荧光定量PCR检测方法，对健康人血浆和血清DNA含量进行定量测定。[第一段]     

荧光定量PCR测定HBV DNA的不确定度评定与应用

目的 对荧光定量PCR（FQ-PCR）测定HBVDNA测量不确定度进行评定，并探讨其应用价值。方法 通过对FQ-PCR检测HBVDNA测量过程的分析，确定并简化测量不确定度的来源；采用不确定度A类评定方法以及不确定度B类评定方法，量化各不确定度分量；确定合成不确定度与扩展不确定度。结果 测量不确定度来源主要有：批内重复性、批间重复性和方法偏倚等因素。FQ-PCR测定HBVDNA的扩展不确定度U=0．62（k=1．96，n=2）；在各不确定度分量中，由方法偏倚导致的不确定度所占比重最大。结论 FQ-PCR测定HBVDNA引入扩展不确定度使结果具有可比性，同时可作为乙型肝炎患者抗病毒治疗疗效判断和质控物浓度选择的依据。     

HBV—DNA荧光定量PCR检测下限的确立

目的 确立本实验室荧光定量PCR检测HBV-DNA项目的检测下限.方法 分别测定原倍HBV-DNA质控血清及经100、200倍稀释后HBV-DNA含量.结果 原倍质控血清测定结果的均值为3.63×104 IU/mL（4.56）,在给定靶值范围2.14×104～2.14×105 IU/mL（4.33～5.33）的低值附近;100倍稀释后的检测结果的均值为3.32 × 102 IU/mL（2.52）,在试剂盒最低检测下限（500 IU/mL）以下,且100份标本能100%定量检测.结论 本实验室设备及所用的试剂、方法对HBV-DNA〉500 IU/mL的标本完全有能力定量检测;检测下限为500 IU/mL是符合要求的.     

应用实时荧光定量PCR方法检测血小板制品细菌污染

目的应用实时荧光定量PCR方法检测血小板制品中细菌的探讨。方法选取金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏杆菌,用改良的Chelex-100法抽提细菌基因组DNA,进行荧光定量PCR检测。并应用过滤法去除反应体系中潜在的细菌及其基因组DNA污染。结果针对16srRNA基因保守序列进行扩增的荧光定量PCR方法具有较高的特异性和灵敏度,与人类淋巴细胞及病毒等的基因组无交叉反应。在金黄色葡萄球菌检测中,应用过滤法后最低含菌量组与阴性对照组Ct值有极显著差异(P<0.001)。该方法对金黄色葡萄球菌的最低检出量为0.3CFUs/PCR,与阴性对照Ct值有显著差异(P<0.01),在大肠埃希氏杆菌中该法可检测出0.1CFUs/PCR,与阴性对照Ct值有显著性差异(P<0.01)。结论改良Chelex-100法抽提细菌基因组及后续的荧光定量PCR分析用于检测血小板制品中的细菌污染,检测实验缩短到3-4h,操作简单,灵敏性高,特异性好,为在临床标本大规模检测中的应用提供理论基础和实验数据。     

ABI 7300实时荧光定量PCR仪的性能评估

目的为参加医学实验室认可和评价仪器性能,对ABI 7300实时荧光定量PCR仪的性能进行评估。方法参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)文件对ABI 7300荧光定量PCR仪检测HBV-DNA定量结果的精密度、正确度、灵敏度及线性进行评价。结果精密度:批内变异系数(CV批内)为2.38%~4.61%,批间变异系数(CV批间)为3.87%~5.33%,达到《医学实验室质量和能力认可准则》中基因扩增检验项目分析性能标准(CV批内4.8%,CV批间6.4%)。正确度:参加2011年卫生部室间质评结果总体平均偏倚为2.14%,符合卫生部质评要求(偏倚不超过8%);功能灵敏度:100IU/mL检测限浓度的CV值最接近于20%,与试剂盒检出下限相符;线性:相关系数(r2)为1.0,线性关系符合要求。结论 ABI 7300实时荧光定量PCR仪各项性能指标精确,可以为临床提供快速、准确的报告。     

食品中志贺活菌叠氮溴乙锭实时荧光聚合酶链反应技术研究

目的 利用叠氮溴乙锭（ethidium monoazide bromide,EMA）实时荧光聚合酶链反应（PCR）技术,建立一种简便、快速、特异、灵敏的在食品中检测志贺活菌的方法。方法 根据志贺菌ipaH基因保守序列设计特异性引物和探针。用不同EMA浓度、不同光照次数优化样品EMA前处理条件。用已知菌验证志贺活菌检测的敏感性和志贺死菌检测的抑制性。用31株志贺菌、26株单增李斯特菌、24株沙门菌、25株副溶血弧菌、11株阪崎肠杆菌、10株致病性大肠埃希菌和1株大肠埃希菌验证方法的特异性和稳定性。同时用本研究方法和常规分离培养法,对30件模拟样品进行实样验证。结果 志贺活菌EMA实时荧光PCR方法的循环阈值（Ct）=32.10~3.19log（菌量）（R2=0.994）。最低检测浓度为2.20 CFU/反应。对死菌DNA抑制效率99.97%。31株志贺菌Ct值最低为15.04,最高为26.54,而97株非志贺菌的Ct值均35或无Ct值（呈一条直线）。重复试验Ct值变异系数3。30件模拟样品采用本研究方法和常规分离培养法的检测结果一致,但采用EMA实时荧光PCR方法耗时不超过7.5 h,而常规分离培养方法则需要3～5 d。结论 EMA实时荧光PCR技术是一种快速简便、特异性强、灵敏度高、仅检测志贺活菌的方法,建议在食品检测中推广应用。     

荧光定量PCR法检测乙肝病毒DNA和乙肝病毒标志物检测的临床价值分析

目的 探讨荧光定量PCR法(FQ-PCR)检测乙肝病毒DNA(HBV-DNA)和乙肝病毒标志物(HBV-M) ELISA法检测的临床价值.方法 选取本院收洽的乙肝患者653例,先采用ELISA法对其血液标本进行HBV-M模式定性检测,再采用FQ-PCR法进行HBV-DNA定量检测,观察不同HBV-M模式检测结果.结果 大三阳(1、3、5模式)和1、3模式的HBV-DNA阳性率分别为97.97％和94.74％,显著高于其他模式(P＜0.05).大三阳(1、3、5模式)的HBV-DNA表达水平为(5.59×106±2.42×105),显著高于其他模式(P＜0.05).结论 不同HBV-M模式的HBV-DNA表达水平及阳性率存在显著差异,联合HBV-M定性及HBV-DNA定量检测对临床早期诊断及用药具有重要指导价值.     

急性百草枯中毒大鼠肺组织MMP-2和TIMP-1的基因表达

目的 利用实时荧光定量PCR法测定急性百草枯中毒大鼠肺组织中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶组织因子抑制剂-1(TIMP-1)基因的表达,探讨其在急性百草枯中毒所致的大鼠急性肺损伤及纤维化中的作用.方法 80只SD大鼠,随机分为对照组(n:8)、染毒组(n:72);对照组一次性腹腔注射与染毒组等体积的生理盐水,染毒组一次性腹腔注射百草枯溶液(18mg/kg)染毒;分别于1、3、5、7、14、28 d光镜下观察两组大鼠的肺组织病理变化,同时利用实时荧光定量PCR法动态测定MMP-2、TIMP-1的mRNA表达量.结果 与对照组相比,染毒组大鼠早期主要表现为肺脏的急性炎症反应,肺水肿和出血明显,染毒5 d后观察到肺纤维化变化,第28天纤维化最明显;染毒组肺组织中的MMP-2的mRNA表达较对照组从第1天开始即明显增强,第7天达到高峰,为对照组的2.83倍,以后逐渐下降,但28 d时仍高于对照组,差异无统计学意义(P<0.01);TIMP-1的mRNA表达第1天也明显高于对照组,逐渐增强至14 d达到峰值,为对照组的7.28倍,后开始缓慢下降,28 d时仍明显高于对照组(P<0.01).结论 MMP-2、TIMP-1在急性百草枯中毒所致的急性肺损伤中起了重要的作用,同时大鼠的肺纤维化进程与MMPs/TIMPs的基因表达比例失调有很大的关系.     

应用实时荧光PCR分析apoE3、4等位基因

目的 建立实时荧光PCR进行apoE单核苷酸多态性(SNP)分析法,快速检测人栽脂蛋白E(apoE)等位基因.方法 以人apoE基因中的Cys112Arg为研究对象,用荧光染料SYBR Green Ⅰ标记PCR产物,通过熔解曲线分析结果,并进行SNP分型.用高保真DNA聚合酶提高SNP测定的特异性;通过DNA测序验证荧光定量PCR对apoE基因Cys112Arg分型结果的准确性.结果 每个样品设立2个检测管,利用下游引物P2和SNP检测引物P33、P44进行定量PCR反应,30份样品各自获得2种等位基因扩增产物的熔解曲线,通过熔解曲线的Tm值判读,在30份样本中,apoE基因型3/3、3/4分别有27例和3例,与PCR-RFLP及DNA测序结果一致.结论 建立的apoE等位基因分型法操作简便,结果准确,适合人外周血apoE等位基因的定性检测.     

实时荧光聚合酶链反应检测患儿手足口病病原体

目的采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测患儿手足口病病原体,为防治手足口病提供依据。方法收集手足口病疑似患儿189例(按年龄分为<3岁组113例、3～5岁组76例)及39例手足口病密切接触儿童的咽拭子、疱疹液,用FQ-PCR检测标本中的肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A组16型(CoxA16),并与酶联免疫吸附试验(ELISA)结果进行比对。结果 189例手足口病患儿疑似组FQ-PCR检测EV阳性141例,阳性率为74.6%,其中<3岁阳性91例、3～5岁阳性50例,3～5岁组EV检出率明显低于<3岁组(P<0.05);EV71阳性135例,CoxA16阳性65例;咽拭子标本阳性率为74.5%(120/161),疮疹液标本阳性率为82.1%(23/28);ELISA检测EV阳性76例(40.2%);39例手足口病密切接触者FQ-PCR检测EV阳性率为33.3%(13/39),ELISA检测阳性率为17.9%(7/39)。结论 FQ-PCR是一种特异性强、灵敏度高、检测较快速、效率高的方法,对检测手足口病病原体及进行相关流行病调研有重要价值。     

实时荧光定量PCR在测定艾滋病患者肠道菌群量变化中的应用及意义

目的:应用实时荧光定量PCR观察艾滋病患者肠道菌群量的变化,研究艾滋病对肠道微生态的影响及其在发病中的作用。方法:分别设计双歧杆菌属、乳酸杆菌属、大肠杆菌、粪肠球菌及屎肠球菌的特异性引物。收集艾滋病患者粪便标本30份及正常对照标本30份,提取细菌基因组DNA,应用实时荧光定量PCR反应测定5种细菌的数量。结果:艾滋病患者组双歧杆菌属、乳酸杆菌属的数量较正常对照组明显减少;大肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌数量明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:艾滋病患者肠道微生态发生了明显变化,提示艾滋病患者肠道微生态紊乱。