应用膜芯片技术快速鉴定分枝杆菌菌种

目的：利用膜芯片技术建立一种快速、简便的分枝杆菌分子菌种鉴定方法。方法：以DNA直接测序法为对照，通过PCR．SSCP和膜芯片技术分析11种分枝杆菌标准菌株、9种非分枝杆菌和199株分枝杆菌临床分离株的菌种。结果：应用膜芯片技术分析11种分枝杆菌标准菌株和7种非分枝杆菌菌株，特异性100％。199株分枝杆菌临床分离株中，经16S rRNA PCR-SSCP初步菌种鉴定，30株为结核分枝杆菌复合群，应用膜芯片分析，显示与分枝杆菌属探针分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群探针a杂交阳性，两种鉴定方法结果一致：169株PCR．SSCP初步鉴定为非结核分枝杆菌的分离株，经芯片分析，58株为龟分枝杆菌，46株为胞内分枝杆菌，33株为堪萨斯、瘰疬、胃和猿猴分枝杆菌复合群，6株为偶然分枝杆菌，15株为戈登分枝杆菌，3株为乌分枝杆菌，2株为海和溃疡分枝杆菌复合群，另6株只与探针分枝杆菌杂交，经测序显示2株为胞内分枝杆菌，但其基因序列与标准菌株不完全相同，1株为土分枝杆菌，1株为迪氏分枝杆菌，1株为草分枝杆菌，1株为新金色分枝杆菌，芯片上无鉴定该菌种的探针。结论：应用膜芯片技术可简便、快速、灵敏、特异地将大多数分枝杆菌鉴定到种，指导临床合理治疗。     

聚合酶链反应-反向斑点杂交鉴定分枝杆菌菌种

目的 建立一种简便、快速、敏感和特异的分枝杆菌菌种鉴定方法。方法以１６ＳｒＤＮＡ为靶序列,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）－反向斑点杂交检测２５种分枝杆菌１１种分枝杆菌标准株、１２０株分枝杆菌临床分离株和２６份痰标本。结果 分枝杆菌、非分枝杆菌标准株经ＤＮＡ扩增,分枝杆菌均出现５７８ｂｐＤＮＡ片段,非分枝杆菌除假白喉棒状杆菌可见同样片段外,其余菌种均未见扩增。敏感性试验可检测出１００ｆｇ结核分枝杆菌ＤＮ     

分枝杆菌菌种的基因快速鉴定技术

目前 ,由非结核分枝杆菌引起的疾病不断增多 ,其临床表现与结核病十分相似 ,但对许多抗结核药物有一定的耐受性 ,因此临床快速检测、鉴别分枝杆菌对于疾病的治疗具有十分重要的作用。本文对分枝杆菌的基因快速检测方法进行了综述。     

多位点PCR技术用于四川267株分枝杆菌临床分离株的鉴定

目的 初步了解四川省肺结核患者分枝杆菌菌种类型。 方法 收集267株分枝杆菌临床菌株,经PNB/TCH鉴别培养基进行培养鉴定后,采用聚合酶链反应(PCR)对16S rRNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8和Rv3120 基因位点进行扩增,鉴定至种,再经PRA-rpoB、hsp65基因测序进行验证。 结果 267株分枝杆菌临床分离株多位点PCR结果显示结核分枝杆菌262株,非洲分枝杆菌Ⅰ型3株,非结核分枝杆菌2株。PNB/TCH鉴别培养基培养鉴定结果为结核分枝杆菌复合群266株,非结核分枝杆菌1株。2株非结核分枝杆菌分别为鸟分枝杆菌(M. avium)和脓毒分枝杆菌(M. septicum)。多位点PCR结果与rpoB-PRA、hsp65基因测序结果一致。 结论 多位点PCR技术鉴定分枝杆菌菌种结果准确可靠,且具有简便和快速等优点,有较大的分子流行病学应用价值,且对于临床诊断和治疗都具有重要意义。     

PCR-反向线点杂交技术鉴定慢生长分枝杆菌的方法学研究

目的建立和评价以16S-23S rDNA间隔序列（ITS）为靶基因的PCR-反向线点杂交技术（RLB）快速鉴定慢生长分枝杆菌（SGM）的方法。方法PCR—RLB检测70株分枝杆菌参考菌株、4株诺卡菌参考菌株、5株红球菌参考菌株、1株棒状杆菌参考菌株，来源于中国生物制品和药品鉴定所和悉尼大学感染性疾病和微生物中心；358株分枝杆菌临床分离株来源于深圳、广州和澳大利亚。结果所有分枝杆菌参考菌株均可扩增出200～250bp DNA片段，分枝杆菌引物可扩增4种诺卡菌和5种红球菌，但不与分枝杆菌属探针和种探针杂交。21个探针可鉴定分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群、溃疡／海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌a／b和堪萨斯分枝杆菌c亚种及其他16种SGM。结论该方法能快速、简便和准确地鉴定SGM。     

分枝杆菌菌种鉴定结果分析

目的分析临床标本非结核分枝杆菌在分枝杆菌中所占比率。方法以中性改良罗氏培养基为基础培养基,以PNB和TCH为鉴定培养基．用绝对浓度间接法进行分枝杆菌的菌种初步鉴定。结果5351株分枝杆菌中非结核分枝杆菌255株,占4．77％。结论近年来非结核分枝杆菌发现率有增高趋势,结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌在治疗和预后方面是完全不同的,开展分枝杆菌的培养和鉴定有极其重要的意义。     

分枝杆菌特殊DNA序列检测及其在分类鉴定中的应用进展

分子生物学技术已应用于分枝杆菌菌种快速鉴定,目前分子鉴定靶序列主要有四种：即hsp65基因,dnaj基因16SrRNA基因,16S－23SrDNA 间隔区序列,其他一些序列如IS6110,mce基因内453bp重复序列,SenX3-RegX3 IR,mtp40,DTI/DT6,属于种特异性或群特异性DNA序列,本文对这些DNA序列在分枝杆菌鉴定应用进行综述。     

分枝杆菌菌种的基因快速鉴定技术

目前，由非结核分枝杆菌引起的疾病不断增多，其临床表现与结核病十分相似，但对许多抗结核药物有一定的耐受性，因此临床快速检测、鉴别分枝杆菌对于疾病的治疗具有十分重要的作用。本文对分枝杆菌的基因快速检测方法进行了综述。     

PCR—微孔板反向杂交法在结核分枝杆菌检测中的应用

目的　评价PCR 微孔板反向杂交法检测临床标本中结核分枝杆菌 (MTB)的应用价值。方法　应用集菌涂片镜检法、培养法、PCR法、PCR 微孔板反向杂交法分别对 5 5份肺结核病患者和 30份非结核呼吸系统病患者痰标本平行检测。结果　涂片法对结核病患者临床标本中MTB检出率为 2 1.82 % ,培养法检出率为2 5 .4 6 % ,PCR法检出率 36 .36 % ,PCR 微孔板反向杂交法检出率 4 7.2 7%。对 30例非结核呼吸系统疾病患者检测MTB ,PCR法出现 2例假阳性 ,其余 3种方法均阴性 ,PCR 微孔板反向杂交法比单纯PCR法灵敏度高、特异性强。结论　PCR 微孔板反向杂交法具有简便、快速、抗污染、灵敏度高、特异性强的优点 ,缺点是存在假阴性 ,应改进标本前处理方法 ,在对结核病的辅助诊断中应与细菌学方法相结合 ,以提高检出率     

深圳市临床分枝杆菌菌种鉴定分析

目的了解深圳地区分枝杆菌的感染、分布状况,为临床诊断和治疗提供科学依据。方法采用基因芯片,对1 096例临床疑似标本进行菌种鉴定。结果基因芯片鉴定结果阳性检出率为9.40%(103/1 096)。阳性患者中有87例为结核分枝杆菌感染,另有16例为非结核分枝杆菌感染,其中脓肿分枝杆菌5例、胞内分枝杆菌3例、鸟分枝杆菌3例、偶发分枝杆菌2例、堪萨斯分枝杆菌1例、海分枝杆菌1例、戈登分枝杆菌1例。结论深圳地区分枝杆菌感染,结核分枝杆菌占84.47%,为主要发病类型;非结核分枝杆菌分离率比例已达到15.53%,其感染菌株包括7个种类,因此开展分枝杆菌菌种鉴定,明确病因,对实现个体化治疗有着重要意义。     

改进的反向斑点杂交方法

目的 改进反向斑点杂交的操作方法,探索更为简便快捷的实验流程.方法 优化杂交液Ⅱ的组分,使用HPV基因分型、β-地中海贫血基因突变和HBV基因分型三个试剂盒验证改进的实验方法.结果 HPV基因分型、β-地中海贫血基因突变和HBV基因分型试剂盒的实验结果证实,使用优化后的杂交液Ⅱ,链霉亲和素过氧化物酶在杂交温度能够有效地...     

聚合酶链反应-微孔板杂交法检测结核分支杆菌的临床应用及其评价

目的:对聚合酶链反应-微孔板杂交法检测结核分支杆菌的临床适用性和可行性进行评价。方法:收集1130份临床标本,用抗酸染色、培养、PCR 电泳、PCR 微孔板杂交法分别进行结核杆菌的检测,并结合临床诊断和疗效观察对实验结果进行分析。结果:100份临床证实未含结核杆菌的临床标本,抗酸染色和 PCR 电泳分别有1例和2例假阳性;培养和 PCR 微孔板杂交法未查出阳性。1030份高度怀疑含有结核杆菌的体液标本的检测结果,以 PCR 微孔板杂交阳性检出例数最高(481/1030),其次为 PCR 电泳(406/1030)、培养(365/1030)以及抗酸染色(256/1030);x~2检测结果显示 PCR 微孔板杂交的结核杆菌阳性检出例数与其它三种方法比较均呈显著或极显著差异。结论 PCR-微孔板杂交方法是一种特异、灵敏、准确、快速的结核杆菌检测方法,具有广泛推广应用的价值。     

反向斑点杂交技术检测HBV基因型方法的评价

目的评价用于检测乙型肝炎病毒（HBV）基因型的反向斑点杂交（RDB）方法。方法应用RDB检测723例HBV阳性标本的HBV基因型。其中对423例HBV序列测序结果清晰可读的样本进一步使用NCBI在线数据库分析、系统进化法分析其HBV基因型,并与RDB法结果进行比较。将样本HBV序列与所用的探针序列进行比对,以评价单个碱基突变对该方法的影响。结果 RDB法检测的检出率为97.6%。RDB检测结果与NCBI在线数据库分析法的一致性为98.8%;与系统进化分析法一致性为100%。与对应探针有1个碱基差异的HBV A型1例、B型12例、C型46例和D型1例均被成功检出。结论 RDB是一种灵敏、准确、有效,且具有很高临床应用价值的HBV基因型检测方法。单碱基的突变不会影响其对HBV的分型结果。     

反向斑点杂交技术检测HBV基因型方法的评价

目的评价用于检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型的反向斑点杂交(RDB)方法。方法应用RDB检测723例HBV阳性标本的HBV基因型。其中对423例HBV序列测序结果清晰可读的样本进一步使用NCBI在线数据库分析、系统进化法分析其HBV基因型,并与RDB法结果进行比较。将样本HBV序列与所用的探针序列进行比对,以评价单个碱基突变对该方法的影响。结果 RDB法检测的检出率为97.6%。RDB检测结果与NCBI在线数据库分析法的一致性为98.8%;与系统进化分析法一致性为100%。与对应探针有1个碱基差异的HBV A型1例、B型12例、C型46例和D型1例均被成功检出。结论 RDB是一种灵敏、准确、有效,且具有很高临床应用价值的HBV基因型检测方法。单碱基的突变不会影响其对HBV的分型结果。     

PCR-反向点杂交法在外阴阴道念珠菌病诊断及白念珠菌耐药基因突变检测中的应用

目的评价PCR-反向点杂交法用于念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测的应用价值。方法收集念珠菌性阴道炎患者及体检健康妇女分泌物各285份和50份。用生物梅里埃酵母菌鉴定卡进行菌种鉴定,用最低抑菌浓度(MIC)法(郑州安图真菌快速培养鉴定药敏试剂)进行药敏试验;采用PCR-反向点杂交法(深圳亚能念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测试剂)进行菌种鉴定和耐药基因突变检测;采用PCR及测序方法进行耐药基因的检测。分别以培养鉴定法、MIC法、核酸序列测定法为对比方法,评价PCR-反向点杂交法念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测的敏感性、特异性及准确性。结果与培养鉴定法相比,PCR-反向点杂交法检测6种念珠菌菌种的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和总符合率分别为95%、96%、96%、98%、97%以上,2种方法检测6种念珠菌(白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和季也蒙念珠菌)结果的差异无统计学意义(χ~2值分别为0.44、0、0、0、0和0,P均0.05),一致性较好(Kappa均0.9)。与MIC法相比,PCR-反向点杂交法检测白念珠菌耐药的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和总符合率分别为98%、88%、98%、88%和96%,2种方法检测结果的差异无统计学意义(χ~2=0.17,P0.05),一致性较好(Kappa0.8)。PCR-反向点杂交法与核酸序列测定法相比,对6种白念珠菌耐药基因突变位点的检测结果完全一致。结论PCR-反向点杂交法在念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测上与培养鉴定法以及核酸序列测定法的一致性高,比传统检测方法更早期更快速,可应用于外阴阴道念珠菌病(VVC)的辅助诊断。     

针对gyrA基因突变的反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药性的研究

目的 建立快速检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药性的反向斑点杂交(reverse dot blot hybridization,RDBH)技术,并观察其效果。方法 针对结核分枝杆菌gyrA基因序列及常见的突变位点,分别设计1条野生型和7条突变型探针,建立RDBH技术,对临床分离结核分枝杆菌菌株进行喹诺酮耐药性检测,以比例法药敏试验和DNA测序做对照。结果 应用比例法药敏试验、DNA测序、RDBH三种方法分别检测59株喹诺酮耐药株和51株喹诺酮敏感株,与比例法相比,RDBH试验灵敏度和特异度分别为69.49%(41/59)、100%(51/51),符合度为83.63%;而RDBH与DNA测序结果比较,敏感度和特异度分别为97.56%(40/41),98.55%(68/69),符合度达98.18%。结论 RDBH技术检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药具有良好的灵敏度、特异度和符合度。     

快速反相杂交法检测HBV DNA

为建立一种简便快速的核酸探针杂交法检测 Ｐ Ｃ Ｒ扩增产物中的 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ,将 Ｐ Ｃ Ｒ 上游引物用生物素标记后进行扩增;核酸探针固定于硝酸纤维素膜上,与带有生物素的 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增产物杂交,杂交信号用链霉亲和素 酶结合物显色检测。结果表明,该法检测的敏感性为 ５ ｆｇ,杂交时间为４０ 分钟。２００ 例临床标本检测的阳性率（２７５％ ）高于琼脂糖电泳法（２４５％ ）。同时具有操作简便的特点,可作为 Ｐ Ｃ Ｒ扩增产物中 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 的常规检测方法。