血友病A携带者检测与产前诊断的研究进展

血友病A是最常见的遗传性出血性疾病,由于目前尚无有效的治疗措施,所以携带者的检测及早期产前诊断显得更加重要。直接检测基因突变位点的方法是最理想、最准确和最可靠的诊断方法,然而凝血因子VIII基因突变的异型性和复杂性使得直接法在血友病A的诊断中变得困难,因此作为间接法的连锁分析仍是目前广泛采用的方法。本文拟简要阐述近年来血友病A携带者的基因检测与产前诊断的研究进展。     

STR遗传标记在广西地区血友病A携带者诊断中的应用

目的：建立理想的STR遗传标记体系，对广西地区血友病A携带者进行快速简便的基因诊断。方法：选取广西地区10个血友病A家系作为研究对象，运用荧光PCR联合毛细管电泳的方法，对家系成员中FⅧ基因内外具有高度遗传性的3个STR位点F8Int13、DXS1073、DXS9901进行等位基因分型，评估该体系用于家系中血友病A携带者的诊断效率，并对待检者进行携带者诊查。结果：10个血友病A家系中，11例肯定女性携带者均含有与相应先证者完全一致的3个STR等位基因（F8Int13、DXS1073、DXS9901）片段长度；在待检的8例女性中，5例检出3个STR等位基因片段与相应家系中先证者完全相同，被诊断为血友病A携带者。结论：联合应用3个STR位点F8Int13、DXS1073、DXS9901进行遗传分析能够快速检出血友病A携带者，给血友病A产前诊断提供可靠的依据。     

7个血友病A家系基因型与临床表型分析

目的 确定各家系凝血因子Ⅷ(F Ⅷ)基因突变类型,了解基因突变与临床表型的关系。方法 对7 个家系患者进行活化部分凝血酶原时间(APTT)及凝血因子Ⅷ凝结活性(F Ⅷ :C)检测,再采用PCR 方法对7 个血友病A家系患者进行内含子22、内含子1 倒位检测,对检测结果阴性患者采用直接测序法确定基因突变类型,并对家系相关成员进行相应位点的扩增与测序。结果 8 例血友病A患者APTT 为91.6~131 s,F Ⅷ :C 为0.8%~2%,基因检测结果显示8 例患者中未检出内含子22 倒位,仅检出1 例内含子1 倒位。余7 例血友病A 患者中,共检出5 种基因型,其中6例位于外显子14,1例位于外显子23,均为单碱基突变;有1 例检出基因型为p.His1202LeufsX16(c.3666delA),经检索为新突变。结论 F Ⅷ突变热点区域位于外显子14,新突变p.His1202LeufsX16 的发现丰富了F Ⅷ基因突变数据库。     

X连锁肾上腺脑白质营养不良的携带者筛查及产前诊断探讨

目的探讨X连锁肾上腺脑白质营养不良(X linkedadrenoleukodystrophy,X ALD)的携带者筛查及产前诊断方法。方法应用气相色谱质谱联用法对83例X ALD可疑携带者血浆、9例高危孕妇羊水细胞及其中5例胎儿出生后的血浆中极长链脂肪酸(VLCFAs)水平进行了检测。应用PCR、测序方法对31例X ALD可疑携带者及羊水细胞VLCFAs增高的男性及女性各1例进行了基因突变分析。结果83例X ALD可疑携带者中,51例血浆VLCFAs水平增高,31例ABCD1基因突变分析,29例有突变。9例胎儿中,7例羊水细胞VLCFAs水平正常,2例增高(1例男性,1例女性)。5例出生后进行了血浆VLCFAs水平检测,结果与产前诊断结果相一致。2例羊水细胞VLCFAs水平增高的胎儿,均有ABCD1基因突变,其核苷酸与氨基酸的改变分别为871G>A(E291K)和726G>A(W242X)。结论血浆及羊水细胞中VLCFAs水平检测结合基因突变分析可以准确地进行X ALD携带者筛查及产前诊断。     

血友病A基因治疗的研究进展

血友病A是凝血因子VⅢ(FVⅢ)基因缺陷所致的X连锁隐性遗传性疾病，目前FVⅢ基因的结构已基本明确，已确认的基因突变种类繁多。基因治疗就是利用病毒载体，将正常的FVⅢ基因导人患者体内，并表达治疗水平的FVⅢ，从而实现彻底治愈血友病A。选择适合血友病A基因治疗的病毒载体，将关系到基因治疗的成功与否。该文对血友病A基因治疗中常用的病毒载体和靶细胞的研究进展作一简要综述。     

血友病A基因治疗的研究进展

血友病A是凝血因子VIII(FVIII)基因缺陷所致的X连锁隐性遗传性疾病,目前FVIII基因的结构已基本明确,已确认的基因突变种类繁多。基因治疗就是利用病毒载体,将正常的FVIII基因导入患者体内,并表达治疗水平的FVIII,从而实现彻底治愈血友病A。选择适合血友病A基因治疗的病毒载体,将关系到基因治疗的成功与否。该文对血友病A基因治疗中常用的病毒载体和靶细胞的研究进展作一简要综述。     

血友病乙患儿一家系基因突变分析

目的探讨凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因突变致血友病乙的分子机制。方法回顾分析1例确诊血友病乙并经家系基因检测患儿的临床资料。结果先证者男,2岁4个月,反复皮肤瘀斑、鼻衄。查活化部分凝血活酶时间118. 3 s,凝血酶原时间15 s,血小板287×10~9/L,FⅨ2. 3%。明确诊断血友病乙型。收集其家系临床资料,提取家系DNA,运用PCR扩增及Sanger双脱氧链终止法对其FⅨ基因8个外显子及其侧翼序列进行测序,先证者FⅨ基因突变为c. 129 delGp.Pro 44 Glnfs*60,突变位于2号外显子,家系中5例女性为该位点的杂合突变,先证者大姨的胎儿经产前诊断提示未携带该致病基因。结论 c.129delG p.Pro44Glnfs*60是该家系FⅨ基因突变类型,基因检测有助于产前诊断。     

儿童血友病的前沿性诊断

血友病A(hemophilia A)和血友病B(hemophilia B)是X连锁隐性遗传性出血性疾病,遗传特点是男性发病、女性携带。血友病的基因诊断采用方法有DNA常规测序、聚合酶链反应(PCR)法、酶谱分析法、Southern印迹法。目前,临床上开展了FⅧ22内含子倒位分析,可作为重型血友病的筛选试验。产前诊断有助于减少血友病患儿出生率。而凝血因子抑制物的产生是目前造成替代治疗无效的根本原因。危险因素包括:有抑制物家族史、存在高风险基因突变、首次出血发作时强化治疗。不同血友病患者凝血因子的药代动力学(pharmacokinetic,PK)存在明显差异。除了考虑患者出血事件以外,PK参数应该作为预防治疗个体化调整的重要参考指标。相关参数包括半衰期、清除率、体内回收率(IVR)、曲线下面积(AUC)、峰浓度、谷浓度等。不同年龄、体重、血型及von Willebrand因子(v WF)水平等都可能为其影响因素。上述进展有助于针对血友病患者进行个体化治疗策略调整。     

血友病B的基因突变研究

为探讨血友病B基因突变，以指导产前诊断，应用聚合酶链反应（PCR）及基因扩增转录序列（GAWTS）检测了8例血友病B患儿及7例家系女性成员的因子Ⅸ基因突变，结果是4例为单碱基替换；3例为单碱基、双碱基或三碱基的丢失；1例为碱基插入。其中6例是文献上未曾报告过的新发现突变病例。5例患儿的母亲及1例患儿的姐和妹携带有与患儿相同的突变基因。提示此研究对本病的产前基因诊断具有重要意义。     

先天性甲状腺功能减低症患儿DUOXA2基因突变研究

目的 探讨广州地区先天性甲状腺功能减低症(CH)患儿DUOXA2基因突变特点及其基因型与表型的关系。方法 采用PCR及直接测序法,对2011年至2012年出生、广州市新生儿筛查中心诊断并排除DUOX2基因突变的20例疑似甲状腺激素合成障碍的CH患者进行DUOXA2基因突变分析。结果 20例CH患者中2例为p.Y246X/p.Y246X纯合突变;4例为单等位基因杂合突变:分别为已知致病突变c.413-414ins A携带者2例,p.Y246X携带者1例,新突变p.G79R携带者1例。2~3岁再评估时显示,2例p.Y246X/p.Y246X纯合突变者分别表现为暂时性CH及轻度永久性CH;4例单等位基因突变者,除1例p.Y246X携带者表现为典型永久性CH外,其余3例携带者均为暂时性CH。结论 DUOXA2基因突变是广州地区疑似甲状腺激素合成障碍性CH患儿较常见的分子发病基础,多数表现为暂时性CH,未发现DUOXA2基因型与表型的关系。新突变p.G79R为致病性突变的可能性大。     

血友病基因治疗进展

<正>血友病是一种X连锁隐性遗传性出血性疾病,是由编码凝血因子Ⅷ/Ⅸ（FⅧ/Ⅸ）的基因突变导致FⅧ/FⅨ产生障碍所致。血友病A(Hemophilia A,HA)是由于FⅧ缺乏引起,血友病B(Hemophilia B,HB)是FⅨ缺乏所致。血友病的治疗目前主要是通过终身注射外源性凝血因子以弥补自身的不足,但由于凝血因子半衰期短、需要频繁静脉给药,极大地影响患者的依从性及生活质量。     

新生儿血友病A 11例病例系列报告

目的探讨新生儿血友病A的临床表现、诊治及预后。方法对复旦大学附属儿科医院2016年2月1日至2019年6月30日收治的11例新生儿血友病A临床资料进行回顾性分析。结果 11例新生儿血友病患儿均为男性,3例有明确血友病家族史。2例无出血表现,2例仅表现为皮肤瘀点瘀斑,7例有出血表现。出血部位包括硬膜下、颅内、皮下、消化道。11例活化部分凝血酶时间(APTT)均延长,均为凝血因子Ⅷ缺乏,中间型9例,重型和轻型各1例。5例行基因检测者证实FⅧ基因突变,缺失2例,点突变3例。血友病A确诊后予静脉输注Ⅷ因子。随访至2019年6月9～10日,1例失访,4例无出血表现,1例有踝关节自发出血表现,5例表现为外伤后皮肤瘀点/皮下血肿。结论新生儿期多次凝血功能异常,以APTT延长为主,特别是延长3倍者有或无出血表现均应考虑血友病可能,应行凝血因子活性水平测定及基因检测及早确诊,早期诊断和预防性输注凝血因子可改善预后。     

疑似新生儿肝内胆汁淤积症SLC25A13基因突变检测分析

目的 建立SLC25A13基因突变分析方法,分析19例临床疑似新生儿肝内胆汁淤积症(NICCD)患儿SLCE25A13基因突变情况.方法 选取2004-2006年间在广州市儿童医院住院,临床表现为黄疸、肝功能异常、低血糖和(或)低蛋白血症,疑似NICCD的患儿19例,应用聚合酶链反应-DNA测序方法对其SLC25A13基因上14种已知突变进行检测分析.结果 19例患儿中8例患儿为SLC25A13基因纯合或杂合突变,6例为单个SLC25A13等位基因携带突变.共检测出两种突变类型.即851～854del(突变Ⅰ)和IVS6 5G>A(突变X).突变Ⅰ占86.4%(19/22),突变X占13.6%(3/22).结论 出现不明原因黄疽、肝功能异常、低血糖和(或)低蛋白血症患儿需高度警惕NICCD可能,应行相关基因突变分析以诊断和鉴别诊断.突变Ⅰ是本研究中NICCD患儿最常见的突变类型.聚合酶链反应-DNA测序是检测SLC25A13基因突变,诊断NICCD的有效可行方法.     

Menkes病患儿ATP7A基因突变分析

目的分析并确定2例Menkes病（MD）患儿的ATP7A基因突变及遗传特征。方法收集并分析2例Menkes病患儿的临床资料，提取其外周静脉血DNA，采用PCR法扩增ATPTA基因的23个外显子及其与内含子的连接区，并行DNA直接测序，异常者用DNA限制性内切酶酶切PCR扩增片段方法进行验证。结果发现2个半合子突变，1例在第12外显子检测到不连续的多处碱基缺失c．2589delTGAAGGA＋c．2598delTT＋c．2601delT＋c．2603delT＋c．2605delGTAGATGA（P．E864fsX883），导致移码突变。另1例在第15外显子检测到单个碱基缺失c．3045delT（p．T1016fsX1018），并发现移码突变。2例患儿的母亲均为相应突变但表型正常的携带者。结论发现2个国际上尚未见报道的新ATPTA基因突变（p．E864fsX883与p．T1016fsX1018），首次在国内明确了2例Menkes病患儿的基因诊断。     

广西崇左市葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因突变型研究

目的 研究广西崇左市葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症的发生率及基因突变类型.方法 对广西崇左市510例病例采用四氮唑蓝定量法筛查G6PD活性.对诊断为G6PD缺乏的病例采用PCR/限制性内切酶消化试验检测出G1376T、G1388A、A95G、G871A和C1024T 5种常见G6PD基因突变类型,用DNA直接测序法检测未确定突变类型的标本.结果 在广西崇左市510名居民中筛查出52例G6PD缺乏症,其缺乏率为10.20％.在52例G6PD缺乏症标本中,检出G1376T突变14例、G1388A突变12例、A95G突变13例、G871A突变6例、C1024T突变1例,C1360T突变1例、C519T突变l例,未定型4例.结论 G6PD缺乏症在广西崇左市的发病率为10.20％.G1388A、G1376T、A95G也是广西崇左市G6PD缺乏症最常见的基因突变.发现G6PDUnion 1例,很可能属于零星分布.     

生长激素缺乏症患者Pit-1基因突变分析

检测生长激素缺乏症（GHD）患者的Pit－1基因突变,研究GHD的发病机制。方法利用银染单链构象多态性法（SSCP）和直接测序法检测GHD患者Pit－1基因突变。结果GHD患者中未发现Pit－1基因突变。结论Pit－1基因突变是导致GHD的稀有病因。     

新生儿血友病A 11例病例系列报告

目的 探讨新生儿血友病A的临床表现、诊治及预后。方法 对复旦大学附属儿科医院2016年2月1日至2019年6月30日收治的11例新生儿血友病A临床资料进行回顾性分析。结果 11例新生儿血友病患儿均为男性,3例有明确血友病家族史。2例无出血表现,2例仅表现为皮肤瘀点瘀斑,7例有出血表现。出血部位包括硬膜下、颅内、皮下、消化道。11例活化部分凝血酶时间(APTT)均延长,均为凝血因子Ⅷ缺乏,中间型9例,重型和轻型各1例。5例行基因检测者证实FⅧ基因突变,缺失2例,点突变3例。血友病A确诊后予静脉输注Ⅷ因子。随访至2019年6月9~10日,1例失访,4例无出血表现,1例有踝关节自发出血表现,5例表现为外伤后皮肤瘀点/皮下血肿。结论 新生儿期多次凝血功能异常,以APTT延长为主,特别是延长＞3倍者有或无出血表现均应考虑血友病可能,应行凝血因子活性水平测定及基因检测及早确诊,早期诊断和预防性输注凝血因子可改善预后。     

17α羟化酶/17,20碳链裂解酶缺陷症一家系CYP17A1基因突变分析

目的 对一儿童17α羟化酶/17,20碳链裂解酶缺陷症(17OHD)先证者及其主要家系成员进行CYP17A1基因突变分析,旨在提高认识和引起重视.方法分别获取先证者及其父母、双胎姐姐的基因组DNA,应用PCR和DNA直接测序方法,进行CYP17A1基因突变检测.结果 先证者存在CYP17A1基因复合型点突变,即Exl的nt186delC和Ex6的nt1085G>A,使17α羟化酶完全失活,从而导致170HD.并在其父Exl、其母和其双胎姐姐Ex6上均发现同类型基因突变.其中nt186delC为新发现突变位点,健康对照者未发现类似基因突变.结论 异卵双胎先证者分别在CYP17A1基因的Exl和Ex6存在复合点突变,其父母和双胎姐姐均为突变携带者.开展基因诊断有助于提高临床诊治水平.     

成骨不全4个家系基因突变检测及表型与基因型的关系

目的对国内4个成骨不全(OI)家系进行临床调查分析和基因突变检测,探讨中国人群OI基因型与表型的关系。方法分别对4例来自不同家系的OI先证者进行体格检查及家系调查,收集临床资料及血液标本,绘制家系图谱,确定各家系成员患病个体的临床诊断分型。提取其血液标本基因组DNA,应用PCR扩增及DNA直接测序法对4例先证者Ⅰ型胶原基因进行基因突变检测,并应用生物信息学软件对测序结果与Genbank标准序列进行对比;根据先证者检测结果,分别对各家系成员进行COL1A1/COL1A2基因突变检测和分析。结果在先证者1及家系患病个体中检测到COL1A1基因第36外显子c.2473位点G>A突变,在先证者2COL1A1基因上第26内含子剪切位点处c.1821+1G>A突变,在先证者4及家系患病个体中检测到COL1A1基因第9内含子剪切位点处c.697-2A>T突变,先证者3及4个家系非患病成员均未检测到COL1A1/COL1A2基因突变。结论COL1A1基因突变是引起中国人群OI的原因之一,但还可能有其他的基因突变存在,临床表型不仅与基因型有关,还可能受遗传背景、环境及其他因素的影响。     

RT-PCR测序法检测G6PD缺乏症基因突变

目的 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 （G6PD）缺乏症是最常见的遗传性溶血性红细胞酶缺陷病,绝大多数为编码区单碱基突变,现有的多种基因突变检测方法均存在漏检率。该研究拟探讨RT-PCR测序法检测G6PD缺乏症基因突变的可行性。方法 将2013年8月至2014年7月的195例贫血查因或体检儿童根据G6PD/6GPD比值 （结果 G6PD缺乏组的基因突变检出率为100%,共检出13种错义突变,包括1种新突变。对照组中28例男性均没有检出错义突变;37例女性中13例检出杂合型错义突变,1例国内外未见报道的纯合型同义突变C1191T,14例C1311T多态位点。对照组的女性标本存在较高的G6PD缺乏症 （携带者）漏检率 （35%,13/37）。结论 RT-PCR测序法对G6PD基因突变检出率高,具有较大临床诊断价值。