抗阴道毛滴虫AP33单克隆抗体的制备及其功能初探

目的 制备阴道毛滴虫（T.υ317株）黏附蛋白抗原（AP33）单克隆抗体并初步分析鉴定其功能。　方法　将制备和纯化的融合黏附蛋白33（rAP33）为抗原，免疫BALB/c小鼠，共免疫3次（抗原含量分别为100、50和100 μg），每次间隔2周，末次免疫后3 d取小鼠脾细胞及SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇（PEG1500）作用下进行细胞融合，筛选出高滴度分泌的McAb 杂交瘤细胞株，测定其免疫球蛋白亚类及其效价，蛋白质印迹（Western blotting）分析其特异性，间接免疫荧光实验（IFAT）进行定位，并初步探讨其体外对阴道毛滴虫黏附HeLa细胞的抑制作用。 结果 经筛选获得能稳定分泌抗AP33单克隆抗体的5株（4A2， 4F11， 4F8， 4E7和4H11）杂交瘤细胞株，经免疫球蛋白类型和亚型鉴定为IgG1; ELISA和Western blotting分析显示，5 株单抗均能与重组阴道毛滴虫AP33发生特异性结合；IFAT显示其中4株（4F11， 4F8， 4E7， 4H11）可识别培养的阴道毛滴虫，体外滴虫黏附抑制实验显示终浓度分别为200、200、400和200 μg/ml，该4株单抗体外对滴虫黏附HeLa细胞的抑制率分别为50.08%、65.03%、50.70%和49.08%。 结论 制备的抗重组AP33单克隆抗体，体外对阴道毛滴虫黏附有较好的抑制功能。     

重组阴道毛滴虫黏附蛋白33单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备重组阴道毛滴虫(T.υ)黏附蛋白33(AP33)单克隆抗体(McAb)并进行初步鉴定。方法将pET32(a)-AP33重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),用0.5 mmol/L IPTG诱导表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过Ni-NTA法纯化,以纯化的融合蛋白33为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,免疫印迹分析其特异性。结果共筛选出能稳定分泌抗AP33单克隆抗体的5株(4A2,4F11,4F8,4E7,4H11)杂交瘤细胞株,抗体重链均为IgG1;腹水的上清效价为1∶40 000-1∶80 000。免疫印迹分析显示,5株单抗均能与重组阴道毛滴虫AP33发生特异性结合;与阴道毛滴虫抗原分子量为33kDa抗原分子结合。结论制备的抗重组AP33杂交瘤细胞株能分泌识别重组AP33的高特异性单抗,为进一步研究其在阴道毛滴虫病免疫诊断中的应用奠定了基础。     

重组恶性疟原虫醛缩酶鉴定及其单克隆抗体的制备

目的 鉴定重组表达的恶性疟原虫醛缩酶（ALD），制备针对此酶的单克隆抗体。 方法 用PCR法扩增恶性疟原虫海南株ALD基因，经大肠埃希菌表达并纯化的ALD免疫BALB/c小鼠，腹腔注射免疫3次,每次间隔2周，加强免疫后3d取免疫小鼠脾细胞制备单克隆抗体。同时用获得的免疫血清进行间接荧光抗体试验（IFAT）和蛋白质印迹（Westernt blotting）分析。 结果 ELISA检测表明，小鼠能产生较高的针对ALD免疫应答，3次免疫后血清中特异性抗体滴度达1∶10⁵，IFAT显示免疫血清能特异性识别疟原虫体内的抗原；Western blotting分析显示免疫血清识别的疟原虫蛋白相对分子质量（Mr）约41 000；所制备的免疫血清与人红细胞内醛缩酶无交叉反应。经ELISA检测 3次，筛选获得7株分泌针对ALD的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中3株分泌的单克隆抗体能识别培养的恶性疟原虫；抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型。 结论 本实验构建并表达了重组疟原虫糖酵解醛缩酶，并获得特异性的单克隆抗体。     

阴道毛滴虫单克隆抗体的制备和鉴定

用阴道毛滴虫滋养体免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与NS_1鼠骨髓瘤细胞融合,选择4株(2A2,2A4,2A12,2H9)杂交瘤细胞,证明能分泌效价高、特异性强的单克隆抗体(McAb)。亚类鉴定为IgG1(2A2,2A4),IgG2b(2A12),IgG3(2H9)。2H9株和其他3株McAb分别能抗阴道毛滴虫细胞核和细胞膜。除2H9株外均可凝集或杀伤虫体,但2A2、2A4和2A12株介导的细胞毒性分别是不依赖和依赖补体的。这4株McAb与杜氏利什曼原虫前鞭毛体、枯氏锥虫锥鞭毛体和蓝氏贾第鞭毛虫滋养体无交叉反应。     

阴道毛滴虫重组蛋白AP33的免疫保护机制初探

目的探讨阴道毛滴虫重组AP33融合蛋白对宿主的保护性免疫机制。方法用纯化的重组AP33蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清和脾细胞多项免疫指标的变化;实验组与对照组分别用滴虫滋养体进行皮下和腹腔攻击,观察各组小鼠的行为变化和死亡时间。结果重组AP33蛋白免疫小鼠产生高效价抗体;实验组小鼠的CD4+T淋巴细胞有所增高(30.65±3.69)%,CD4+/CD8+比值明显升高(3.96±0.56)%(P<0.01);脾细胞培养上清液中mIL-2、mIFN-γ、mIL-4和mIL-6均有不同程度的升高,尤其mIFN-γ浓度增高最明显;皮下注射组,实验组小鼠背部出现明显溃疡;腹腔注射组,对照组小鼠6d内全部死亡,而实验组小鼠的存活时间比对照组长,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论重组AP33融合蛋白具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生较好的免疫保护作用,可能成为阴道毛滴虫预防或治疗性多价疫苗的侯选抗原。     

阴道毛滴虫黏附蛋白65基因的克隆、表达及免疫反应性鉴定

目的通过构建原核表达载体,获得阴道毛滴虫黏附蛋白65基因重组融合蛋白。方法分离并纯化培养阴道毛滴虫临床分离株,提取其总RNA,经RT-PCR扩其全长序列基因,T-A克隆测序后,连接表达载体PET-28a(+)。在E.coli(DE3)Plyss宿主菌中用不同浓度IPTG诱导目的蛋白的表达,采用Ni-NTA亲和层析法提纯AP65,SDS-PAGE检测表达和提纯效果。采用兔抗阴道毛滴虫全虫多抗鉴定其免疫反应性。结果克隆ap65基因与GenBank公布基因同源性高,在1mmol/LIPTG诱导下,AP65产量可占细菌总蛋白量的23%,提纯后蛋白纯度达到90%以上,且重组蛋白AP65能与兔抗阴道毛滴虫全虫抗体发生特异性结合。结论成功地构建了阴道毛滴虫ap65基因的原核表达系统,重组蛋白且有良好的免疫反应性,可为疫苗抗原的筛选及单克隆抗体的制备奠定基础。     

阴道毛滴虫重组蛋白AP33的制备、鉴定和初步应用

目的 克隆阴道毛滴虫(T.v)重组蛋白AP33的基因(ap33基因),构建其原核表达系统,鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性和免疫原性。方法 从阴道毛滴虫临床分离虫株Tv317抽提总RNA,经mRNA纯化试剂盒纯化后逆转录合成cDNA。以cDNA为模板扩增ap33基因,T-A克隆后测序,构建pET32a(+)的ap33基因表达载体,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21DE3株,用不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用抗阴道毛滴虫全虫抗体蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性,用兔抗重组融合蛋白AP33血清的免疫双扩散试验鉴定重组融合蛋白AP33的免疫原性,用阴道毛滴虫临床分离虫株全虫抗原包被的ELISA鉴定重组蛋白AP33的免疫原性。ELISA检测滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体。结果 克隆的ap33基因与已报道的相应核苷酸序列同源性及氨基酸序列同源性均较高。重组融合蛋白AP33表达量较大,能与抗阴道毛滴虫全虫抗体发生结合反应,免疫家兔能获得高效价抗AP33蛋白抗体。T.v临床分离虫株重组蛋白AP33表达率高,能刺激机体产生抗体。ELISA检测50例滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体,阳性率为78.0%(39/50)。结论 构建了阴道毛滴虫ap33基因原核表达系统,重组融合蛋白AP33具有良好的抗原性和免疫原性。     

Monoclonal antibodies against a 62 kDa proteinase of Trichomonas vaginalis decrease parasite cytoadherence to epithelial cells and confer protection in mice

Trichomonas vaginalis infects the epithelium of the genital tract. The mechanism by which it invades the tissue leading to the disease is not thoroughly understood. However, results of several studies seem to agree that parasite adhesion to epithelium cells is the initial step leading to infection in women. T. vaginalis is associated with high levels of proteolytic activity. The role of some of these proteinases in the development of infection has been demonstrated. The current study establishes the role of a 62 kDa excretion-secretion proteinase in parasite cytoadherence. Monoclonal antibodies (MAbs) against this enzyme were tested for their ability to inhibit this process. Three stable hybrid producers of IgG(1)class MAbs (4D8, 1A8, 3C11) against the 62 kDa proteinase were obtained. Two of them (4D8 and 1A8) showed parasite recognition by immunofluorescence. Parasite cytoadherence to a monolayer of HeLa cells was inhibited by the 4D8, 1A8 and 3C11 antibodies. MAb 4D8 administered 24 h before a challenge with T. vaginalis by the intraperitoneal route was able to protect the majority of mice. Nitric oxide levels in the serum of animals inoculated with MAb 4D8 and challenged with the parasite were significantly different from those recorded in mice treated with an unrelated MAb. These studies show that an appropriate antibody against 62 kDa proteinase can help the host resist a challenge by the intraperitoneal route with T. vaginalis.     

抗旋毛虫副肌球蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的利用杂交瘤技术制备分泌抗重组旋毛虫副肌球蛋白N端抗原（rTsP3）的单克隆抗体（McAb）并进行鉴定。方法以rTsP3免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,筛选分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,制备腹水并进行纯化,采用间接ELISA法测定培养细胞上清液及腹水中的McAb滴度、相对亲和力及抗体亚类,Western blot法鉴定抗体对抗原识别的特异性。结果获得了2株稳定分泌抗旋毛虫rTsP3的McAb杂交瘤细胞株,分泌的McAb分别为IgG2b亚类κ型和IgG1亚类κ型,亲和力常数分别为8.98×108mol/L和9.7×10^8mol/L,Western blot显示2株单抗均能识别旋毛虫成虫匀浆蛋白、rTsP3及重组副肌球蛋白（rTsPmy）。结论成功制备了抗旋毛虫rTsP3单克隆抗体,该单抗能识别旋毛虫副肌球蛋白抗原。     

空肠弯曲菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备

目的为获得空肠弯曲菌鞭毛蛋白单克隆抗体,用于空肠弯曲菌的检测和研究。方法用空肠弯曲菌ATCC29428株灭活全菌作为抗原,免疫BALB/c小鼠,待抗体水平达到1∶51 200时,取脾细胞与生长良好的对数期Sp2/0进行融合。同时以粗提天然鞭毛蛋白和人工表达重组鞭毛蛋白包板,用间接ELISA方法筛选,多次克隆化培养后获得的单抗用Western blot进行生物学特性鉴定。结果获得3株持续、稳定分泌抗空肠弯曲菌鞭毛蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G8、1G9和3F2。结论获得的空肠弯曲菌鞭毛蛋白单克隆抗体为建立空肠弯曲菌的蛋白检测及后续研究奠定基础。     

阴道毛滴虫与人型支原体共生对AP33基因序列的影响

目的研究河南地区阴道毛滴虫临床分离株与人型支原体共生情况,并观察其共生对阴道毛滴虫AP33基因序列的影响。方法应用人型支原体及AP33基因的特异性引物对41株阴道毛滴虫临床分离株进行PCR扩增,扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测,对AP33基因扩增产物测序,测序结果与GenBank已知序列比对,绘制进化树。结果有34株阴道毛滴虫扩增出人型支原体的特异性片段,大小为334bp;所有虫株均扩增出AP33基因特异性片段,碱基序列相似性为96．8％～99．3％,有多个位点发生突变。进化树分析提示人型支原体的共生对AP33基因序列有一定影响。结论河南地区阴道毛滴虫临床分离株与人型支原体共生具有普遍性,其共生对阴道毛滴虫的基因序列有一定影响。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定

[目的 ]制备抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDHp)单克隆抗体 (McAb) ,并对其特异性进行鉴定。[方法 ]用纯化的LDHp重组抗原免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术制备McAb ,筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株 ,测定其免疫球蛋白亚类及其效价 ,ELISA、Westernblot试验分析其特异性。 [结果 ]筛选出 2A5和1H10两株能稳定分泌抗LDHpMcAb的杂交瘤细胞株 ,两株单抗均为IgG2b,2A5和 1H10培养上清的ELISA效价分别为 1∶5 12和 1∶2 5 6 ,腹水效价分别为 1∶2 5 6 0 0和 1∶12 80 0 ,两株单抗与间日疟原虫、红细胞、弓形虫、日本血吸虫等抗原均不发生交叉反应 ,能识别恶性疟原虫 33kDa的虫源蛋白。 [结论 ]制备的抗LDHp杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗     

抗重组日本血吸虫P38抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的?摇在大肠埃希菌中可溶性表达日本血吸虫P38（SjP38）抗原分子，并以其纯化产物为抗原，制备抗SjP38单克隆抗体(McAb)。 方法 将pET32(a)-P38重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)，在1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下表达，超声破菌后获得可溶性表达产物，通过镍柱一步法纯化，以纯化的重组SjP38为抗原，免疫BALB/ｃ小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb，用ELISA和有限稀释法筛选出高分泌滴度McAb杂交瘤细胞株，测定其免疫球蛋白亚类及其效价，蛋白质印迹法（Western blotting）分析其特异性。 结果 筛选出能稳定分泌抗重组SjP38单克隆抗体的8株杂交瘤细胞株，均为IgG1； Western blotting 分析显示8株单抗能与日本血吸虫虫卵抗原中的天然P38发生特异性结合。 结论 制备的抗P38杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的McAb。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性单克隆抗体的制备

目的制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性单克隆抗体。方法克隆、表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因,并以表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,对所制备的单克隆抗体确定其亚类和效价,蛋白质印迹法(Western blotting)分析其特异性。结果成功克隆并表达了恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因,以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白作为免疫源制备单克隆抗体,共筛选了15株能高效分泌效价在1∶6 400～1∶51 200特异抗体的细胞株,抗体亚类为IgG1或IgG2。所有抗体均能唯一识别恶性疟原虫虫源蛋白Mr 33 000组分,而与疫区非疟疾发热病人的红细胞组分无交叉反应。结论以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白为免疫源成功制备了能识别天然恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白的特异性单克隆抗体。     

恶性疟原虫FCC1/HN株CSP抗原基因表达产物在小鼠体内的免疫应答研究

目的： 利用ｐｃＤＮＡ３ 质粒作为载体, 在人宫颈癌细胞（ＨｅＬａ 细胞） 中高效表达恶性疟原虫环子孢子蛋白 （ＣＳＰ）, 观察表达产物诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠免疫的应答水平。方法： 目的基因ＰｆＣＳＰ在ＨｅＬａ 细胞中表达, 将纯化的表达产物免疫接种小鼠, 通过ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析、Ｔ 淋巴细胞增殖实验、ＮＫ 细胞活性检测和Ｔ淋巴细胞亚群测定, 观察其诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠产生体液免疫和细胞免疫的应答水平。结果： ＥＬＩＳＡ 检测抗体滴度达１∶６ ４００;Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 结果在３８．３ ｋＤａ 相应位置出现较清晰的显色条带;表达产物能特异刺激小鼠脾淋巴细胞增殖、ＣＤ４＋ 与ＣＤ８＋ 细胞有所增加, 并能提高小鼠ＮＫ细胞活性。结论： 真核表达系统ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ／ＨｅＬａ表达产物能特异刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫的应答, 并提高小鼠ＮＫ细胞活性的作用     

日本血吸虫卵壳蛋白基因的克隆与表达

目的：在体外高效表达具有生物学和免疫学活性的日本血吸虫卵壳蛋白，探讨其作为抗卵免疫靶抗原的可能性。方法：采用PCR技术扩增日本血吸虫卵壳蛋白基因，将其克隆到pcDNA3质粒，在HeLa细胞中高效表达，对表达产物进行鉴定和免疫原性研究。结果：特异扩增日本血吸虫卵壳蛋白基因编码序列（618bp），构建了真核表达质粒pcDNA3／ESG，在HeLa细胞中高效表达卵壳蛋白，其表达量高达24．4％，分子量约为22kDa，dot－ELISA和Westernblot分析显示，表达蛋白能与感染兔血清及虫卵免疫血清产生较强的免疫反应；此外，表达蛋白还能特异刺激经虫卵免疫后的BALB／c小鼠脾细胞增殖，其转化率达44．57％。结论：成功地构建重组质粒pcDNA3/ESG, 并在HeLa 细胞中高效表达卵壳蛋白基因, 表达的重组蛋白具有较强的免疫活性。     

抗广州管圆线虫成虫单克隆抗体的研制及初步应用

目的制备抗广州管圆线虫成虫单克隆抗体并研究其初步应用。方法用广州管圆线虫成虫可溶性抗原免疫BALB/c小鼠,经融合,筛选分泌高滴度、高特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。使用所得的单克隆抗体以Western blotting检测广州管圆线虫病患者血清,并建立双抗体夹心ELISA法检测感染大鼠血清。结果获得3株分泌高滴度抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株(2A2、3F1、4H2),其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫、猪囊尾蚴、旋毛虫抗原均不发生交叉反应。3株单克隆抗体均可识别广州管圆线虫成虫可溶性抗原蛋白Mr 15 000,以及患者血清中两种循环抗原Mr24 000和Mr15 000。双抗体夹心ELISA检测阳性率为76.5%。结论制备的抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的单克隆抗体,且在循环抗原的检测方面有应用前景。     

抗恶性疟原虫有性期单克隆抗体的制备和鉴定

以培养的恶性疟原虫ＮＦ５４（３Ｄ７）株配子体蛋白抽提液及我国云南现场采集的恶性疟原虫细胞骨架分别免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。取免疫小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，以ＩＦＡ法筛选出８株抗恶性疟原虫有性期ＭｃＡｂ杂交瘤细胞株。经免疫球蛋白类别鉴定，６株为ＩｇＧ１（Ｍ２Ａ１０Ｃ９、Ｍ２Ｃ１Ｂ８、Ｍ４Ｃ７Ｂ１０、Ｍ４Ｇ１２Ｃ１、Ｍ５Ｂ７Ｅ６和Ｍ６Ｅ１Ｇ１１），２株为ＩｇＭ（Ｍ４Ｄ７Ｆ７和Ｍ６Ｆ４Ｄ６）。其中３株ＭｃＡｂｓ（Ｍ４Ｃ７Ｂ１０、Ｍ４Ｄ７Ｆ７和Ｍ６Ｅ１Ｇ１１）的靶抗原定位于配子体以及大滋养体和裂殖体期无性体原虫；其余５株仅定位于配子体。经Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹试验，ＭｃＡｂ所识别的蛋白区带各异（１６－１２０ｋＤ），与已发现的有性期特异性抗原相比较，３２ｋＤ抗原国内外尚未报道。各株ＭｃＡｂ与猴疟（Ｐ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｉ）红内期、鸡疟（Ｐ．ｇａｌｉｎａｃｅｕｍ）子孢子和杜氏利什曼原虫前鞭毛体均无交叉反应。     

阴道毛滴虫ap33基因克隆及其表达载体的构建

目的 研究阴道毛滴虫粘附蛋白AP33的基因结构特点并构建其表达载体。方法 提取阴道毛滴虫mRNA,逆转录合成cDNA,PCR得到阳性克隆,将其亚克隆到pLICm-T载体中进行PCR、酶切及测序分析,并与CenBank中核苷酸序列进行同源性分析。再将亚克隆与表达载体分别酶切并连接。结果 阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为927bp,,ap33与国外已报道的3株T.vaginalis的ap33基因分别具99％、97％、94％的同源性。结论 成功克隆出阴道毛滴虫ap33基因序列,与已公布的ap33序列有很高的同源性。构建获得PET-32a(+)-ap33重组质粒,可在原核中进一步表达特异性蛋白。     

抗粉尘螨主要变应原Der fⅡ单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定鼠源抗粉尘螨主要变应原Der fⅡ单克隆抗体（Monoclonal Antibody,McAb）。方法重组Der fⅡ蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取小鼠免疫脾细胞与NS-1细胞融合。间接ELISA法筛选特异性分泌的杂交瘤细胞。用筛选获得的单克隆细胞株诱生小鼠腹水,蛋白G亲和层析法纯化腹水抗体。利用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型;通过间接ELISA、Western Blotting方法鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。结果获得5株IgG2a型鼠抗粉尘螨主要变应原Der fⅡ的单克隆抗体,效价良好。ELISA和Western Blotting分析表明该5株单抗均可识别重组Der fⅡ蛋白和天然粉尘螨提取物。结论成功制备了5株鼠抗粉尘螨主要变应原Der fⅡ的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原Der fⅡ的检测及纯化方法奠定了基础。