骨桥蛋白反义寡核苷酸对体外微缺氧诱导的肿瘤新生血管的影响

目的 观察靶向骨桥蛋白(OPN)的反义寡核苷酸(ASODN)对微缺氧下HT-29细胞体外促进新生血管形成能力的影响,探讨OPN与微缺氧诱导的肿瘤新生血管的关系.方法 合成靶向OPN的ASODN,以Lipofectamine为载体,将其转染入微缺氧下高表达OPN的HT-29细胞.RT-PCR和Western blot分别检测转染细胞微缺氧下OPNmRNA和蛋白的表达;明胶酶谱分析检测分泌的MMP-2/MMP-9活性变化;内皮细胞小管形成试验检测体外促进新生血管形成的能力.提取胞核蛋白,Western blot检测胞核内NF-kB/p65蛋白表达.结果 微缺氧诱导的OPNmRNA和蛋白表达被靶向OPN的ASODN特异性地抑制,表达量分别是对照组的35.4%和31.5%.ASODN组HT-29细胞明胶酶活性下降71.0%,内皮细胞形成管状结构的数仅为(12.4±1.8);胞核内的NF-κB/p65蛋白表达下调了61.2%.与各对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 靶向OPN的ASODN明显抑制微缺氧诱导的OPNmRNA和蛋白表达,显著下调微缺氧诱导的HT-29细胞分泌MMP-2/MMP-9的活性,显著桔抗新生血管形成.阻抑OPN的表达,胞核内NF-κB/p65表达、MMP-2/MMP-9的活性随之下调,提示NF-κB和MMP-2/MMP-9也可能参与微缺氧诱导的恶性转化,并且是OPN的下游调控基因.     

反义寡核苷酸对微缺氧下人结肠癌细胞HT-29骨桥蛋白表达的影响

目的观察靶向骨桥蛋白（OPN）的反义寡核苷酸（ASODN）对微缺氧下HT-29细胞骨桥蛋白表达的影响,为探讨OPN与微缺氧诱导的肿瘤恶性表型的关系奠定基础。方法合成ASODN,以Lipofectamine为载体,将其转染入微缺氧下高表达OPN的HT-29细胞。Western blot行OPN ASODN抑制OPN蛋白表达的量效关系和特异性分析。RT-PCR检测转染细胞微缺氧下OPNmRNA的表达。结果 ASODN组OPN蛋白表达较各对照组明显下调（P〈0.01）,其下调的幅度随OPN ASODN浓度升高而增强,但这种增强趋势在浓度为10umol/L和20umol/L之间已不明显（P〉0.05）。微缺氧诱导的OPN蛋白和mRNA表达被靶向OPN的ASODN特异性地抑制,表达量分别是对照组的35.4%和31.5%。结论靶向OPN的ASODN明显抑制微缺氧诱导的OPNmRNA和蛋白表达。     

低氧对人结肠癌细胞HT-29体外侵袭转移潜能的影响

目的 探讨低氧与人结肠癌细胞HT-29恶性转化的关系,检测骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、细胞核内核转录因子（NF—κB／p65）表达和MMP-2、MMP-9活性变化,以探索其恶性转化的潜在机制。方法 参照体内肿瘤的氧分压,建立低氧模型。MTT比色试验测定HT-29细胞的异质性黏附能力,Transwell侵袭试验判定其侵袭游走能力;将HT-29细胞低氧处理0、6、12、24、48h,明胶酶谱分析检测分泌的MMP-2、MMP-9活性变化,RT—PCR和Western blot检测OPN mRNA和蛋白表达,提取细胞核蛋白,Western blot检测细胞核内NF—κB／065蛋白表达。结果 低氧诱导24h后,HT-29细胞的异质性黏附能力、侵袭游走能力显著增加。低氧下6h,MMP-2、MMP-9活性无明显变化,随着低氧时间的延长,其活性逐渐显著上调,24h达顶峰,48h与24h无显著性差异。HT-29细胞在低氧的诱导下,其OPN mRNA和蛋白以及细胞核内NF—κB／065蛋白的表达趋势与MMP-2、MMP-9活性变化趋势类同。结论 低氧能诱导HT-29细胞异质性黏附能力、侵袭游走能力显著增加,MMP-2、MMPO活性上调而促使其向恶性表型转化。OPN—NF—κB可能是低氧下继HIF-1之外的另一重要调节途径,该途径与低氧诱导的恶性表型有密切关系。     

微缺氧对人结肠癌细胞HT-29血管生成能力及分泌基质金属蛋白酶2/9活性的影响

目的 观察HT-29细胞在微缺氧下的血管生成能力,检测OPN的表达和MMP-2/MMP-9的活性变化,以探讨其向恶性表型转化的潜在机制.方法 参照体内肿瘤的氧分压,建立微缺氧模型.内皮细胞小管形成试验检测体外促进新生血管形成的能力.将HT-29细胞微缺氧处理0、6、12、24和48 h,明胶酶谱分析检测分泌的MMP-2/MMP-9活性变化,RT-PCR和Western blot检测OPN的mRNA和蛋白表达.结果 微缺氧组内皮细胞形成的管状结构数为(28.5±3.6),明显多于对照组(12.4±2.8),其差异具有显著性(P<0.01).微缺氧6h,MMP-2/MMP-9活性无明显变化,随着微缺氧时间的延长,其活性逐渐上调,24h达顶峰,48 h与24 h差异无显著性.HT-29细胞在微缺氧的诱导下,其OPN mRNA和蛋白的表达趋势与MMP-2/9活性变化趋势类同.结论 微缺氧能诱导HT-29细胞促进新生血管形成,上调MMP-2/MMP-9活性而促进其向恶性表型转化.该实验检测到在微缺氧下OPN和MMP-2/MMP-9普遍上调,且时限同步.因此,笔者推测:OPN可能是微缺氧下继HIF-1α之外的另一重要调控因子,该调控因子与微缺氧诱导的恶性表型密切相关.     

人结肠癌细胞HT-29血管生成能力与微缺氧的关系

目的观察HT-29细胞在微缺氧下的血管生成能力,检测OPN的表达,以探讨其向恶性表型转化的潜在机制。方法参照体内肿瘤的氧分压,建立微缺氧模型。内皮细胞小管形成试验检测体外促进新生血管形成的能力。将HT-29细胞微缺氧处理0、6、12、24、48小时,RT-PCR和Western blot检测OPN的mRNA和蛋白表达。结果微缺氧组内皮细胞形成的管状结构数为（28.5±3.6）,明显多于对照组（12.4±2.8）,差异具有统计学意义（P〈0.01）。微缺氧6h,HT-29细胞OPN的mRNA和蛋白无明显变化,随着微缺氧时间的延长,其表达逐渐上调,24h达顶峰,48h与24h无显著差异。结论微缺氧能诱导HT-29细胞促进新生血管形成,而促进其向恶性表型转化。微缺氧下OPN普遍上调,OPN可能是微缺氧下继HIF-1α之外的另一重要调控因子,该调控因子与微缺氧诱导的恶性表型密切相关。     

β1整合素反义寡核苷酸对人结肠癌细胞黏附和侵袭抑制作用

目的 研究β1整合素反义寡核苷酸(ASODN)对人结肠癌HT-29细胞侵袭的抑制作用.方法 以脂质体为载体将硫代磷酸修饰的β1整合素ASODN及无义寡核苷酸(NSODN)转染人结肠癌HT-29细胞,通过RT-PCR及Western-Blot试验,分别测定ASODN组、NSODN组和空白对照组β1整合素mRNA和蛋白的表达,MTT法和Transwell小室法分别测定其黏附力和侵袭力.结果 与NSODN组和空白对照组相比较,ASODN 组中β1整合素 mRNA 和蛋白表达强度明显降低;ASODN组和NSODN组转染的人结肠癌HT-29细胞侵袭力均下降,但前者下降较为明显.结论β1整合素ASODN转染HT-29细胞后,通过降低其β1整合素mRNA和蛋白表达水平,从而抑制其对细胞外基质的侵袭.     

曲古抑菌素A体外对结肠癌细胞凋亡及低氧状态下其缺氧诱导因子-1α表达的影响

目的:观察曲古抑菌素A(TSA)体外对结肠癌HT-29细胞凋亡及低氧状态下其缺氧诱导因子(HIF)-1α表达的影响.方法:体外培养结肠癌HT-29细胞,给予TSA 100、200、400、600、800 nmol/L分别处理12、24、48、72h,对照组加入同等体积的DMSO.MTT法检测各组HT-29细胞的存活率;Annexin V、TUNEL法检测HT-29细胞凋亡率;RT-PCR、免疫印迹法分别检测低氧状态下(37℃、1%O2)HT-29细胞HIF-1α mRNA及蛋白的表达.结果:MTT法检测结果发现,与对照组相比,TSA处理组HT-29细胞活力明显降低(P＜0.05),随着浓度的增大、时间的延长,其抑制作用逐渐增强.Annexin V、TUNEL法检测结果发现,TSA能诱导HT-29细胞的早期凋亡,TSA(200、400、600、800 nmol/L)处理组凋亡率明显高于对照组(P＜0.05).低氧条件下,TSA抑制HT-29细胞HIF-1α蛋白的表达,随着浓度的增大,其抑制作用逐渐增强;而对HIF-1α mRNA的表达无影响.结论:TSA体外可能通过抑制低氧条件下HT-29细胞HIF-1α蛋白的表达,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖.     

纳米基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨纳米基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因对大肠癌细胞HT-29增殖和凋亡的影响.方法 用壳聚糖-聚乙二醇纳米粒介导的Survivin shRNA(基因纳米复合物)转染结肠癌细胞株HT-29,并以携带相同shRNA的脂质体载体,以及阴性对照shRNA为对照,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后的HT-29细胞中Survivin mRNA的变化,用噻唑蓝(MTT)法检测细胞凋亡率.结果 和脂质体载体比较,转染基因纳米复合物后,HT-29细胞中Survivin mRNA拷贝数及蛋白表达显著降低,其细胞死亡率和凋亡率显著提高(P<0.05).结论 壳聚糖-聚乙二醇纳米粒里介导的Survivin shRNA较之脂质体载体具有更高的干扰效率,且能长期、高效地诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖.     

缺氧诱导因子1α对直肠癌HT-29细胞增殖的影响

目的:探讨缺氧诱导因子1α（HIF-1α）对直肠癌细胞增殖的影响,阐明其可能机制。方法:野生型直肠癌细胞系HT-29（Wt-HT-29）及转染HIF-1α特异性小干扰RNA（siRNA）的转染型HT-29细胞系（Si-HT-29）分别在常氧及缺氧状态下培养,通过Western blotting方法检测各组细胞在常氧及缺氧状态下HIF-1α和己糖激酶Ⅱ（HK-Ⅱ）的表达情况,采用MTT法检测各组细胞的生存率,采用ATP试剂盒检测细胞ATP生成量。结果:Western blotting结果,缺氧状态下野生型HT-29细胞中HIF-1α和HK-Ⅱ表达量高于转染型细胞。以常氧状态下野生型HT-29细胞的ATP生成量及细胞数量分别作为ATP及MTT数据的100%,将常氧状态下转染型HT-29细胞、缺氧状态下野生型及转染型HT-29细胞的ATP生成量及细胞数量与常氧状态下野生型HT-29细胞比值的百分数作为各组的ATP生成量及细胞生存率。常氧状态下转染型HT-29细胞的ATP生成量及细胞生存率分别为93.6%和92.0%,与野生型HT-29细胞比较差异无统计学意义（P>0.05）。在缺氧状态下野生型及转染型HT-29细胞的生存率分别为85.0%和61.3%,二者比较差异有统计学意义（P<0.05）;同时在缺氧状态下野生型及转染型HT-29细胞ATP生成量分别为81.2%和42.9%,二者比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论:HIF-1α能诱导直肠癌细胞表达HK-Ⅱ,增加ATP生成,从而发挥促增殖作用,HIF-1α可能成为直肠癌新的治疗靶点。     

蟾蜍毒素诱导结肠腺癌细胞HT-29凋亡中对相关蛋白的影响

目的 探讨蟾蜍毒素诱导结肠癌细胞株HT-29凋亡及其机制.方法 MTI检测蟾蜍毒素对结肠腺癌细胞HT-29增殖抑制;瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学变化;流式细胞术分析细胞凋亡;Western-Blot检测livin、Bcl-2、Bax及Capase-3蛋白的表达.结果 蟾蜍毒素抑制HT-29细胞增殖,呈时间、剂量依赖关系;蟾蜍毒素诱导HT-29细胞凋亡,形态学观察到典型的凋亡小体;流式细胞仪检测到明显亚二倍体凋亡峰;蟾蜍毒素诱导细胞凋亡过程中下调livin、Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达,并活化Caspase-3蛋白.结论 蟾蜍毒素诱导HT-29细胞凋亡可能与下调livin、Bcl-2蛋白、上调Bax蛋白表达并活化Caspase-3有关.     

短发夹状干扰RNA沉默信号传导和转录激活子3基因表达对大肠癌细胞的影响

目的构建携带信号传导和转录激活子3（STAT3）基因短发夹状干扰RNA（shRNA）的真核表达载体,观察干扰STAT3表达对大肠癌细胞HT-29细胞增殖的影响。方法从GenBank STAT3mRNA上寻找到3条符合特征的靶序列,合成靶序列的DNA寡核苷酸链,合成双链DNA,并和BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/Neo载体质粒连接产生重组质粒,行PCR和测序鉴定。重组质粒瞬时转染大肠癌HT-29细胞,实时定量PCR、Western blot检测STAT3的表达。筛选出最佳重组质粒,转染大肠癌细胞后,MTT检测细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果成功构建了携带有STAT3基因的shRNA的重组质粒,PCR和测序证实重组质粒构建正确。3种重组质粒对大肠癌HT-29细胞STAT3的表达有明显的抑制作用。筛选出的最佳重组质粒转染大肠癌细胞后,细胞增殖能力明显减弱;细胞周期分析显示,G0/G1期细胞占（74.80±1.85）%,S期细胞占（15.72±2.26）%,与对照组差异显著（P〈0.01）。结论干扰STAT3基因的表达可以有效抑制大肠癌HT-29细胞的生长。     

反义硫代寡核苷酸对786-O细胞survivin基因的表达及生长抑制作用

目的研究survivin反义寡核苷酸对肾透明细胞癌786O细胞表达survivin蛋白、细胞凋亡、增殖的影响。方法设计并合成特异性靶向survivin的反义寡核苷酸(ASODN)。肾透明细胞癌细胞株786O分为6组:空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组、200、400和600nmol/LASODN转染组。作用24h后收获各组细胞。倒置显微镜及透射电子显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测各组细胞survivin表达情况和流式细胞术检测各组细胞周期变化和凋亡指数,MTT法检测survivin反义寡核苷酸对各组细胞的生长抑制率。结果电镜下可以见到典型凋亡样改变,而各对照组细胞生长良好;各ASODN转染组细胞survivin表达有不同程度减弱;各ASODN转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组(P<0.05),以600nmol/LASODN转染组最为明显(P<0.05),而各对照组间差异无显著性(P>0.05)。结论不同浓度survivinASODN转染后能下调survivin蛋白表达,诱导肾透明细胞癌786O细胞凋亡,抑制786O细胞增殖。     

量子点在叶酸偶联白蛋白纳米粒靶向肿瘤细胞研究中的应用

目的 制备荧光量子点标记的叶酸偶联白蛋白纳米粒,并研究该纳米粒对人结肠癌HT-29细胞的靶向性.方法 先通过缩合荆将量子点与白蛋白纳米粒相结合,再利用叶酸活性酯在碱性条件下与白蛋白表面上的氨基反应,制得叶酸修饰的白蛋白/量子点纳米粒,通过量子点荧光标记的方法对结肠癌HT-29肿瘤细胞摄取Folate-HAS/QDs纳米粒进行相关研究.结果 成功制备了具有良好粒径分布和荧光性能的Fo-late-HAS/QDs纳米粒,并证实该纳米粒对HT-29细胞有较强的靶向性.结论 通过量子点作为荧光标记物,简单直观的证实了叶酸修饰的白蛋白/量子点纳米粒能通过细胞膜上的叶酸受体介导内吞入细胞,可显著靶向于叶酸受体丰富的肿瘤细胞.     

存活蛋白反义寡核苷酸诱导食管癌细胞凋亡的研究

目的观察存活蛋白反义寡核苷酸转染对食管癌细胞凋亡、增殖、对化疗药物敏感性的影响。方法设计合成特异性存活蛋白反义寡核苷酸（ASODN）。食管癌EC109细胞系分为6组：空白对照组、空脂质体转染对照组、正义链转染对照组、160、200、240nmol／L ASODN转染组。作用20h后收获各组细胞,Western blot法检测各组细胞生存素表达情况。TUNEL法检测各组细胞的凋亡情况。结果各ASODN转染组细胞存活蛋白表达有不同程度减弱,细胞变圆、折光增强、细胞碎片形成等,而各对照组细胞生长良好。各ASDON转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组（P〈0．05）,以240nmol／L转染组最明显（P〈0．05）。结论封闭食管癌细胞存活蛋白基因,能下调存活蛋白的表达,从而诱导食管癌细胞凋亡,抑制食管癌的发展。     

IP_6对人结肠癌细胞HT-29凋亡Caspase3基因作用

目的 研究肌醇六磷酸(IP6)对人结肠癌细胞HT-29的诱导凋亡作用,检测Caspase3基因在IP6处理细胞前后表达的变化,并对IP6诱导人结肠癌细胞HT-29的凋亡机制进行初步探讨.方法 不同浓度的IP6以不同时间作用于体外培养的HT-29细胞,用MTT法检测IP6持续作用对癌细胞增殖的影响;透射电镜观察癌细胞超微结构的变化;用RT-PCR方法对IP6作用前后以及作用不同浓度和时间的癌细胞内Caspase3活性进行检测.结果 IP6能显著抑制人结肠癌细胞HT-29生长,呈剂量与时间依赖性;IP6作用后,HT-29细胞出现凋亡的形态学改变;与对照组相比,不同浓度的IP6作用不同时间后,Caspase3 mRNA表达均升高(F=8.173～91.755,q=3.960～17.095,P<0.05), IP6作用6个月组Caspase3 mRNA表达升高较其他时间组显著(q=12.858～14.890,P<0.01).结论 IP6具有抑制人结肠癌细胞HT-29增殖和诱导凋亡的作用;IP6长期作用诱导细胞凋亡更加显著;Caspase3基因参与细胞的凋亡调节机制,发挥重要作用.     

凋亡信号调节激酶1在紫花牡荆素诱导结肠癌细胞凋亡中的作用

目的:研究紫花牡荆素诱导人结肠癌细胞凋亡作用及其作用机制。方法:体外培养人结肠癌HT-29细胞。碘化丙啶(P)I染色流式细胞术(FCM)和细胞凋亡ELISA试剂盒检测细胞凋亡。荧光探针二氯荧光素(DCFH-DA)标记FCM测定细胞内活性氧的含量。Western blot和小干扰RNA转染用于探索其分子机制。结果:紫花牡荆素以浓度依赖性的方式诱导结肠癌HT-29细胞系细胞凋亡。紫花牡荆素引起活性氧(ROS)的产生,并激活HT-29细胞的凋亡信号调节激酶1(ASK1)。N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理HT-29细胞有效地抑制ASK1活性,减弱紫花牡荆素处理引起的细胞凋亡。ASK1特异小干扰RNA能显著减弱紫花牡荆素诱导HT-29细胞凋亡作用。结论:紫花牡荆素通过刺激活性氧形成活化ASK1诱导结肠癌HT-29细胞凋亡。