软骨生长因子对兔软骨细胞作用的实验研究

目的：探讨软骨生长因子（CDGF）对体外培养兔软骨细胞的作用。研究了CDGF,胰岛素样生长因子－I（IGF－I）及软骨细胞生长代谢三者之间的关系。方法：体外单层培养兔软骨细胞,取生长良好的第二代细胞实验,分别或共同加入不同浓度CDGF和IGF－I,利用氯胺T法和MTTI地分别观察比较细胞培养液中羟脯氨酸与能量的合成及细胞的增殖情况,结果：CDGF与IGF－I均能剂量依赖性的促进细胞外基质中羟脯氨酸的合成以及细胞的增殖与能量合成;对两种作用的最佳刺激浓度,CDGF分别为16ng/ml和32ng/ml,IGF-I为30ng/ml;二者联合应用能明显增强对软骨细胞作用。结论：CDGF可以刺激软骨细胞的增殖与胶原合成,并与IGF－I有协同作用。     

地塞米松与TGFβ1对骨髓基质细胞增殖、分化及代谢的影响

目的　明确地塞米松与转化生长因子 β1对骨髓基质细胞增殖代谢及向软骨细胞分化的影响 ,为应用骨髓基质细胞构建组织工程化软骨提供技术参数。方法　抽取猪股骨骨髓 ,分离有核细胞 ,体外培养扩增并分别加入地塞米松 (40ng/ml)或地塞米松 (40ng/ml)与转化生长因子β1(10ng/ml)联合诱导。通过细胞计数及MTT法检测不同诱导因子对骨髓基质细胞增殖的影响 ,透射电镜观察不同诱导组细胞代谢功能的变化 ,免疫组化、原位杂交、RT -PCR及Northernblott等检测Ⅱ型胶原及蛋白聚糖表达量的差异。结果　加入地塞米松后细胞增殖能力受到轻度抑制 ,而同时加入地塞米松与转化生长因子 β1后 ,细胞生长明显受抑制。电镜下可见随诱导因子的增加 ,细胞变得肥大 ,细胞器丰富 ,功能活跃。Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达在联合诱导组明显增强 ,且随诱导时间的延长 ,Ⅱ型胶原mRNA表达量也显著增加 (P <0 .0 1)。结论　地塞米松与转化生长因子β1能有效地诱导骨髓基质细胞表达软骨细胞特征性蛋白 ,但对细胞的增殖及代谢也产生明显的影响 ,在骨髓基质细胞构建组织工程化软骨时 ,应充分调整好诱导与增殖的关系     

IGFl对兔关节软骨细胞增殖的影响及其形态学观察

目的 :了解胰岛素样生长因子1 (IGF1 )对体外生长的兔关节软骨细胞增殖以及细胞超微结构的影响。方法 :应用兔关节软骨细胞体外单层培养 ,对照组培养液为含 1 0 %小牛血清DMEM ,实验组在培养液DMEM中加入IGFl使其终浓度为 1 0 0 μg·L- 1 ,作用细胞 1周 ,得出细胞生长曲线 ,并分别测得两组DNA含量。同时观察IGFl 作用后 ,软骨细胞超微结构的变化。结果 :结果显示IGFl能明显促进培养软骨细胞增殖。实验组DNA含量 ,与对照组相比 ,有统计学意义 (P<0 .0 1 )。在电镜下 ,细胞主要表现为增殖性改变 ,说明细胞代谢活跃。结论 :IGFl 可刺激软骨细胞增殖 ,细胞超微结构表现代谢活跃状态     

胰岛素样生长因子-1基因转染脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的研究

目的 观察胰岛素样生长因子(IGF)-1基因转染的脂肪间充质干细胞(ADSCs)向软骨细胞分化的效果.方法 原代培养兔ADSCs,免疫荧光法检测细胞表面抗原CD44、CIM9;脂质体介导人IGF-1基因转染兔ADSCs联合低浓度血清培养基向软骨细胞分化诱导,RT-PCR及Western blot方法检测IGF-1的表达,MMT法绘制细胞增殖曲线、甲苯胺蓝染色软骨结节、免疫组织化学检测Ⅱ型胶原的表达.结果 脂肪间充质干细胞CD44、CD109表达阳性,基因转染后细胞IGF-1表达阳性,细胞增殖速度增快,出现软骨结节,Ⅱ型胶原表达增高.结论 从脂肪组织中能够分离出增殖旺盛的ADSCs,IGF-1在ADSCs内获得稳定表达,细胞增殖能力增强,促进其向软骨细胞分化.     

地塞米松与TGF β1对骨髓基质细胞增殖、分化及代谢的影响

目的明确地塞米松与转化生长因子β1对骨髓基质细胞增殖代谢及向软骨细胞分化的影响,为应用骨髓基质细胞构建组织工程化软骨提供技术参数.方法抽取猪股骨骨髓,分离有核细胞,体外培养扩增并分别加入地塞米松(40 ng/ml)或地塞米松(40 ng/ml)与转化生长因子β1 (10 ng/ml)联合诱导.通过细胞计数及MTT法检测不同诱导因子对骨髓基质细胞增殖的影响,透射电镜观察不同诱导组细胞代谢功能的变化,免疫组化、原位杂交、RT-PCR及Northern blott等检测Ⅱ型胶原及蛋白聚糖表达量的差异.结果加入地塞米松后细胞增殖能力受到轻度抑制,而同时加入地塞米松与转化生长因子β1后,细胞生长明显受抑制.电镜下可见随诱导因子的增加,细胞变得肥大,细胞器丰富,功能活跃.Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达在联合诱导组明显增强,且随诱导时间的延长,Ⅱ型胶原mRNA表达量也显著增加(P＜0.01).结论地塞米松与转化生长因子β1能有效地诱导骨髓基质细胞表达软骨细胞特征性蛋白,但对细胞的增殖及代谢也产生明显的影响,在骨髓基质细胞构建组织工程化软骨时,应充分调整好诱导与增殖的关系.     

转化生长因子-β1和胰岛素样生长因子-1对人髓核细胞体外增殖活性的影响

目的：研究转化生长因子-β1（TGF—β1）和胰岛素样生长因子-1（IGF—1）单独及联合应用对人髓核细胞体外增殖活性的影响，并观察其量效和时效关系。方法：体外分离培养人髓核细胞．将传2代细胞种于96孔板，采用噻唑蓝（MTT）比色法，观察TGF—β1和IGF—1在1％和10％血清浓度下对人髓核细胞体外增殖的调节作用及其剂量、时间与作用效果的关系。结果：在1％血清条件下，IGF—1的作用不显著，TGF—B1具有促增殖作用。在10％血清条件下，TGF—B1和IGF—1均能提高细胞的增殖活性，并且在有效浓度范围内呈剂量效应关系，TGF—B1的作用强于IGF—1。二者联合应用效果更显著。结论：TGF—B1和IGF—1均能不同程度地促进入髓核细胞的体外增殖，其效应在一定范围内与剂量和时间呈正相关．联合应用促进增殖作用更显著。     

IGF-Ⅰ对培养兔关节软骨细胞作用的实验研究

目的 了解胰岛素样生长因子I（ICF－I）对培养关节软骨细胞增残及代谢的影响。方法 体外单层培养兔关节软骨细胞,实验组以10,100,200ng/mlICF-I作用细胞2,4,6天,对照组不加IGF－I作用培养细胞。检测细胞DNA及基质中糖醛酸含量,用流式细胞仪分析在100ng/mlIGF-I作用下细胞周期亚时相。结果 IGF－I在10－100mg/ml浓度范围内,对培养软骨细胞增残和代谢有促进作用,以100ng/ml浓度作用效果最佳,细胞周期分析,实验组DNA合成前期（G1期）较对照组缩短。结论 IGF－I促进软骨细胞的增殖与代谢,且通过缩短细胞G1期而缩短的细胞周期。     

培养软骨同生长板的比较研究

目的：探讨培养软骨用作生长板移植替代物的可行性。方法：自1月龄兔分离软骨细胞、离心管培养2周形成软骨。切取6周龄兔胫骨生长板，与培养软骨进行组织学、胰岛素样生长因子I型受体α链（IGF－I Ra)免疫组织化学、^3H-胸腺嘧啶脱氧核苷（^3H-TdR)掺入率检测和电镜观察。结果：培养软骨具有一定的骺软骨组织学结构，缺乏典型的生长板软骨细胞柱状排列。培养软骨和生长板IGF－IRa免疫组织化学染色均为阳性。培养软骨^3H-TdR掺入率显著高于生长板（P＜0．01）。培养软骨中细胞外基质结构疏松，5％软骨细胞呈现凋亡。结论：培养软骨具有一些与生长板相似的性质，可能成为生长板的移植替代物。     

rhIGF-Ⅰ、rhTGF-β1对骨髓基质细胞增殖分化成软骨细胞的实验研究

目的研究重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF-1)、重组人转化生长因子(rhTGF-β1)和重组人胰岛素样生长因子(rhIGF-Ⅰ)体外对骨髓基质细胞生物学活性的影响,并在体内诱导骨髓基质细胞向软骨细胞分化。方法单独或联合应用细胞因子对细胞进行体外诱导培养,进行常规染色、MTT、免疫组织化学染色观察细胞因子对骨髓基质细胞的作用。体内将rhTGF-β1和rhIGF-Ⅰ,骨髓基质细胞复合于纤维蛋白凝胶,植入到兔膝关节实验性关节软骨缺损,观察软骨修复效果。结果常规形态学观察,rhTGF-β1和rhIGF-Ⅰ联合应用诱导的细胞在形态上类似于软骨细胞,免疫组化染色提示诱导细胞具有软骨细胞表型。rhTGF-β1和rhIGF-Ⅰ在体内能诱导骨髓基质细胞向软骨细胞分化,修复缺损的软骨。结论rhT-GF-β1和rhIGF-Ⅰ联合应用可作为诱导骨髓基质细胞向软骨细胞分化的最佳组合。     

bFGF和IGF对体外培养骨髓基质干细胞增殖及分化的影响

目的观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)对体外培养骨髓基质干细胞(BMSc)增殖、分化的影响.方法 3～6月龄的雄性SD大鼠处死后,取双侧股骨、胫骨的骨髓进行体外培养.将含有不同细胞因子的培养基分为4组:①bFGF组;②IGF组;③bFGF IGF组;④对照组.以上各组均含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、青霉素、链霉素.显微镜下观察BMSc的生长特性,用MTT法测得的细胞相对值绘制生长曲线.采用改良Gomori氏钙钴法计数碱性磷酸酶(ALP)阳性率的细胞.结果 BMSc在传代培养前两天,各组的细胞数量无明显变化,从第二至第八天,bFGF组、IGF组、bFGF IGF组的细胞数量均高于对照组,并且bFGF IGF组明显高于其它3组.含细胞因子3组的ALP阳性率均高于对照组,bFGF IGF组的阳性率最高.结论 bFGF、IGF都能促进BMSc增殖及向成骨细胞分化,并且两者同时运用优于单独使用;bFGF、IGF在促进BMSc增殖与分化时起协同作用.     

组织工程骨-软骨复合组织种子细胞的获取与培养

目的:探索体外培养组织工程骨-软骨复合组织种子细胞的条件,并观察其部分生物学活性。方法:采用机械-酶消化法对3周龄新西兰大白兔耳软骨和关节软骨消化来获得软骨细胞,采用全骨髓贴壁法来获得骨髓间充质干细胞,对两种细胞进行原代和传代培养,通过倒置相差显微镜观察细胞形态、绘制生长曲线、免疫组化染色等对细胞进行生物学特性分析。结果:原代培养的软骨细胞以多角形或三角形为主,传代3次以后出现去分化。形态学和免疫组化显示细胞3代以内可以保持表型稳定,具有较强的增殖及分泌细胞外基质的能力,而且耳软骨及关节软骨细胞在实验中没有表现出明显的生物学差别。采用贴壁筛选法获得的BMSCs呈长梭形或多边形,生长曲线呈"S"形,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,细胞生长增殖能力旺盛。结论:体外分离培养的软骨细胞和骨髓间充质干细胞符合组织工程要求,能够作为骨-软骨复合组织的种子细胞。     

兔脊索细胞体外培养及生物学特点观察

目的建立体外兔椎间盘脊索细胞藻酸盐凝胶培养模型,观察脊索细胞形态及生物学特点。方法采用胶原酶消化法及Percoll不连续密度梯度沉淀法体外分离收集原代椎间盘脊索细胞,于1.2%藻酸盐凝胶(低密度)中培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态,经Ⅱ型胶原免疫荧光染色对细胞表型初步鉴定,并分别以细胞增殖和细胞毒性试剂-8(CCK-8)检测细胞在藻酸盐凝胶中的存活和增殖能力。结果成功分离获得原代椎间盘脊索细胞,可稳定表达Ⅱ型胶原。原代脊索细胞在藻酸盐凝胶中生长良好,但增殖缓慢。结论初步了解兔椎间盘脊索细胞体外生物学特性,为椎间盘退变机制及组织工程学髓核种子细胞的研究提供一定的实验依据。     

胰岛素样生长因子-1对甲状旁腺激素介导成骨细胞增殖及成骨活性的影响

目的：通过构建乳鼠颅盖骨成骨细胞分离培养与鉴定方法,研究胰岛素样生长因子－1（Insulin－like growth factor－1,IGF－1）及IGF－1联合重组人甲状旁腺激素1－34（recombinant human parathyroid hormone 1－34,rhPTH1－34）对成骨细胞增殖及I型胶原蛋白mRNA表达的影响。方法培养乳鼠成骨细胞,并观察其形态及功能,以原代培养乳鼠成骨细胞为实验模型,分空白组、PTH组、IGF－1组及不同浓度IGF－1作用的PTH介导的成骨细胞组（0、10、50、100 ng／L）。通过不同剂量的胰岛素样生长因子－1（0、10、50、100 ng／L）联合10－9 mol／L重组人甲状旁腺素刺激体外培养的成骨细胞,用噻唑蓝（ MTT）法检测细胞的增殖能力,RT－PCR法检测成骨细胞I型胶原蛋白mRNA的表达。结果 PTH和IGF－1均可促进成骨细胞增殖;IGF－1联合PTH可以促进成骨细胞增殖,且具有剂量依赖性。 PTH联合IGF－1使成骨细胞增殖能力增强、I型胶原蛋白mRNA表达增强。 IGF－1可以促进成骨细胞I型胶原蛋白mRNA的表达,且具有剂量依赖性。 IGF－1可以促进成骨细胞I型胶原蛋白mRNA的表达,且具有剂量依赖性。结论 PTH与IGF－1均可刺激成骨细胞增殖和分化,IGF－1可促进PTH对成骨细胞的分化、增殖。两者合用其作用增强,有协同促进作用。     

大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡体外模型的建立

[目的]建立大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡体外模型.[方法]为了模拟椎间盘内部低营养低代谢环境,采用低胎牛血清培养法培养椎间盘软骨终板细胞分别含0％,1％,3％,5％,8％,10％胎牛血清,设置不同浓度梯度筛选最佳浓度,检测凋亡率、凋亡蛋白表达及caspase酶活性.[结果]低胎牛血清培养组细胞发生形态改变,DAPI染色阳性细胞增多;流式细胞仪检测凋亡率随着FBS浓度降低而升高,1％为最有效诱导凋亡浓度;Western blot示FAS、caspase-3、PARP、细胞色素C表达在1％ FBS组明显高于10％时,同时caspase-3/8/9酶活性增高.[结论]低胎牛血清培养法能诱导体外培养的软骨终板细胞发生凋亡,最终会引起细胞功能丧失和椎间盘退变,caspase家族可能参与了这一过程.     

人退变椎间盘髓核细胞体外平面培养的形态学及活性观察

[目的]观察平面培养体系内人退变椎间盘髓核细胞的形态及活性变化.[方法]收集20例人退变椎间盘髓核,分离髓核细胞行平面培养,倒置相差显微镜和HE染色观察髓核细胞的生长过程与形态变化,流式细胞仪量化细胞周期分布和凋亡率,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学染色髓核细胞聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达,观察平面培养传代对髓核细胞活性和基质合成能力的影响.[结果]原代髓核细胞呈类圆形或多角形,平均7d贴壁,31 d融合至95％,P1代髓核细胞呈长梭形或多角形,平均12h贴壁,6.6d融合至95％,两代细胞增殖能力的差异有统计学意义(P＜0.01).原代与P1代髓核细胞的细胞浆阳性染色聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,生长融合至95％后约90％的细胞分布于G1期,约16％的细胞凋亡,两代细胞的细胞活性和基质合成能力无统计学差异(P＞0.05).[结论]人退变椎间盘髓核细胞体外平面培养将经历显著的形态学变化.传一代后髓核细胞增殖能力提高,但能维持细胞活性以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成能力.     

雌激素受体α和胰岛素样生长因子1对小鼠前列腺平滑肌细胞增殖的影响

目的:探讨在雌激素对前列腺平滑肌细胞(PSMC)生物学效应中,雌激素受体α(ERα)和胰岛素样生长因子1(IGF1)对细胞增殖的影响。方法:构建pGSadeno-ERα腺病毒载体,体外转染原代培养的小鼠PSMC后,以半定量逆转录PCR和Western印迹分别检测ERαmRNA和蛋白质的表达;成功获取ERα下调细胞后,加入10-8mol/L17β雌二醇,6h后Western印迹检测细胞IGF1的表达;以噻唑蓝比色分析法(MTT法)评价转染后雌激素或外源性IGF1对PSMC的增殖活性。结果:加入17β雌二醇后,正常对照组PSMC增殖明显,IGF1基因表达水平明显增高(P<0.05);而在ERα下调细胞组中,PSMC增殖、IGF1基因表达水平均无明显变化(P>0.05)。外源性IGF1作用于ERα下调的PSMC后,未能激活细胞增殖(P>0.05)。结论:雌激素在对PSMC的生物学效应中,通过ERα的介导刺激产生IGF1,并且IGF1在ERα的共同参与下促进细胞的增殖。     

b-FGF和TGF-β1对体外培养的软骨细胞增殖的影响

目的:研究转化生长因子-β1(TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对体外培养的软骨细胞增殖的影响。方法:细胞取自猪耳弹性软骨,体外培养原代至第6代软骨细胞,将培养液中加入TGF-β1或/和b-FGF作用于软骨细胞,并用MTT比色分析法对其增殖行为进行分析,探讨两种因子对软骨细胞增殖行为的影响。结果:b-FGF明显促进原代至第3代软骨细胞的增殖,并逐渐减弱,对第4代细胞无增殖作用,TGF-β1仅促进原代软骨细胞的增殖,TGF-β1和b-FGF联合应用,其刺激细胞增殖的作用明显低于b-FGF单一作用。结论:b-FGF显著促进体外培养的软骨细胞的增殖,主要作用于原代至第2代软骨细胞,明显强于b-FGF和TGF-β1联合应用。     

关节游离体软骨细胞生物学特性的初步观察

目的观察关节游离体软骨细胞的生物学特性，寻找组织工程软骨种子细胞来源。方法分别取游离体软骨标本5例，正常软骨标本2例和骨关节炎软骨标本6例，组织学观察其细胞分布、尿嘧啶脱氧核苷末端转移酶介导的三磷酸脱氧核苷缺口标记法观察细胞凋亡，细胞分离培养观察原代软骨细胞形态，并进行比较。结果与正常软骨、骨关节炎软骨比较，游离体软骨细胞分布密度较高，细胞凋亡明显．体外培养时原代细胞已呈成纤维细胞样形态。结论游离体软骨细胞已具有成纤维细胞特性，不宜直接作为组织工程的种子细胞来源。     

TGF—β1对人前列腺上皮细胞增殖与凋亡的调节作用

目的 观察TGF－β对体外培养人前列腺上皮细胞增殖与凋亡的调节作用。方法 建立原代人前列腺上皮细胞株13例,角化蛋白PSA等免疫组织化学染色鉴定培养细胞,绘制细胞生长曲线,运用BrdU方法和细胞凋亡原位染色观察传后细胞生长状况及不同剂量TGF－β1对细胞增殖与凋亡的作用。结果 培养细胞角色蛋白、PSA染色阳性。TGF－β1抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡,作用与剂量成正比,EGF与TGF－β1相互减弱对方的作用。结论 TGF与TGF－β1对前列腺上皮细胞增殖与凋亡状态起重要的调节作用。     

IGF1对兔关节软骨细胞增殖的影响及其形态学观察

目的了解胰岛素样生长因子1(IGF1)对体外生长的兔关节软骨细胞增殖以及细胞超微结构的影响.方法应用兔关节软骨细胞体外单层培养,对照组培养液为含10%小牛血清DMEM,实验组在培养液DMEM中加入IGFl使其终浓度为100μg*L-1,作用细胞1周, 得出细胞生长曲线,并分别测得两组DNA含量.同时观察IGFl作用后,软骨细胞超微结构的变化.结果结果显示IGFl能明显促进培养软骨细胞增殖.实验组DNA含量,与对照组相比,有统计学意义 (P<0.01).在电镜下,细胞主要表现为增殖性改变,说明细胞代谢活跃.结论IGFl可刺激软骨细胞增殖,细胞超微结构表现代谢活跃状态.