干扰转酮醇酶的短发卡RNA表达载体的构建与筛选

目的筛选出干扰小鼠转酮醇酶(TK)的短发卡RNA(shRNA)表达载体。方法针对TK基因序列设计4条TK干扰序列:hMGFP-shRNA1、hMGFP-shRNA2、hMGFP-shRNA3、hMGFP-shRNA4,PstⅠ酶切鉴定其序列。然后利用质粒转染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6,用逆转录-聚合酶链式反应和酶活性方法检测转染TKshRNA后Hepa1-6细胞内TK mRNA和蛋白表达变化。结果经酶切凝胶电泳证实shRNA载体构建正确,质粒筛选实验表明hMGFP-shRNA1质粒对TK基因的抑制作用最强。结论成功构建表达靶向TK的shRNA重组质粒载体。     

pcDNA3-MAGE-1真核表达载体的构建及其在Hepal-6细胞中的稳定表达

目的:构建真核表达载体,并在小鼠肝癌Hepa1-6细胞中稳定表达,观察转染细胞的增殖能力和致瘤能力。方法:用PCR方法扩增SMMC-7721人肝癌细胞株MAGE-1全长序列,连接到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达pcDNA3-MAGE-1,脂质体法转染小鼠Hepa1-6细胞。G418筛选阳性克隆(Hepa1-6- MAGE-1),用RT-PCR和Western blotting检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;MTT 法检测Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞生长和增殖的变化;分别以Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞接种于C57BL /6j小鼠右侧背部皮下,观察Hepa1-6- MAGE-1细胞的致瘤能力。结果:构建MAGE-1的真核表达载体转染Hepa1-6细胞,PT-PCR与Western boltting检测分别在Hepa1-6- MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组细胞增殖无统计学差异;两组各10只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠肝癌Hepa1-6细胞株,并具有很好的增殖和致瘤能力。     

异基因造血干细胞移植后供体基质细胞植活证据的研究

目的:探讨转录因子GATA4在肝癌细胞中的表达及其在肝癌发生中的作用.方法:将GATA4真核表达载体转染小鼠正常肝细胞,RT-PCR、免疫组化鉴定转染效果,G418筛选稳定表达细胞克隆;进行细胞计数并绘制未转染、空转染、转染GATA4组及肝癌细胞组细胞生长曲线;RT-PCR法比较成纤维细胞(3T3,L1)、GATA4转染肝细胞(BNLG,L2)、未转染肝细胞(BNL,L3)、肝癌细胞株H22细胞(H22,L4)、肝癌细胞株Hepa1-6细胞(Hepa1-6,L5)和小鼠孕13.5 d胎肝细胞(孕13.5d胎肝,L6)的GATA4、胎蛋白转录因子(FTF)和甲胎蛋白(AFP)mRNA的表达.结果:GATA4真核表达载体转染效果较好;小鼠肝癌细胞株高表达GATA4 mRNA而正常肝细胞几乎不表达;GATA4转染组小鼠肝细胞增殖速度明显大干未转染和空转染组,但要小于肝癌细胞组.L1～L6的GATA4、FTF、AFP mRNA表达强度分别为0.04±0.02,0.28±0.03,0.04±0.02,0.26±0.03,0.32±0.04,0.24±0.03;0.04±0.02,0.26±0.02,0.08±0.02,0.22±0.02,0.26±0.02,0.26±0.01;0.04±0.01,0.37±0.03,0.14±0.02,0.50±0.03,0.51±0.03,0.49±0.03.L1、L3与L2、L4、L5、L6比较差异显著(P＜0.01),说明正常肝细胞的GATA4、FTF、AFP mRNA表达明显低于肝癌和胎肝细胞,转染后表达增高.结论:GATA4在肝癌细胞中高表达,并能够促进正常肝细胞增殖,促进FTF、AFP mRNA的表达,可能参与肝癌的发生、发展.     

干扰SULT2B1对Hepa1-6肝癌细胞凋亡的影响及机制研究

目的研究羟基类固醇硫酸基转移酶SULT2B1对小鼠Hepa1-6肝癌细胞凋亡的影响及作用机制。方法SULT2B1慢病毒干扰载体感染Hepa1-6细胞(MOI=100),Real-time PCR检测其干扰效果。采用流式细胞仪通过Annexin V-APC/7-ADD染色检测干扰SULT2B1后Hepa1-6细胞凋亡率的改变,Western blot检测FAS和p-JNK的蛋白表达水平。结果构建的SULT2B1干扰载体可显著抑制Hepa1-6细胞中SULT2B1的表达(P<0.05)。Hepa1-6细胞中干扰SULT2B1后其凋亡率较对照组相比显著增加(P<0.05),干扰SULT2B1后可显著增加FAS和p-JNK的蛋白表达水平(P<0.05)。结论干扰SULT2B1可促进Hepa1-6细胞的凋亡,其作用主要与增加FAS和p-JNK的蛋白表达水平有关。     

ATG5 介导肝癌细胞对抗营养危机的作用研究

目的 探索在小鼠肿瘤细胞中对抗营养缺乏的分子途径。方法 构建ATG 5 基因表达的质粒并瞬 时转染至细胞内;用不同靶基因的si-RNAs 转染到细胞来沉默基因的表达;不同条件下提取小鼠正常肝细胞 AML-12 和肝癌细胞Hepa1-6 的RNA 和蛋白;用qRT-PCR 检测基因的表达;用Western blot 检测蛋白的表达; 用流式细胞仪检测细胞周期;用CCK-8 的试剂测定细胞活性。结果 与小鼠正常肝细胞AML-12 比较,肝癌 细胞Hepa1-6 对缺血引发的细胞死亡有抵抗性。缺血使Hepa1-6 细胞内诱导自噬相关蛋白ATG5 表达升高 （P <0.05）;沉默内源ATG 5 基因后Hepa1-6 细胞对缺血的敏感性升高,且ATG5 诱导细胞周期抑制蛋白p21（cip1/ waf1）表达增加使细胞滞留在G1 期。结论 在营养缺乏的环境中,Hepa1-6 细胞内ATG5 表达升高,且ATG5 增加p21（cip1/waf1）的表达量使细胞滞留在G1 期,可能与对抗缺血引起的死亡有关。     

SULT2B1影响小鼠Hepa1-6肝癌细胞的HIF-1α，糖酵解及血管新生

 目的 研究羟基类固醇硫酸基转移酶SULT2B1对小鼠Hepa1-6肝癌细胞HIF-1α、糖酵解及血管新生能力的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 分别用SULT2B1过表达及干扰载体感染Hepa1-6细胞,采用real-time PCR和Western blot检测过表达/干扰SULT2B1对HIF-1α表达水平的影响,同时检测糖酵解相关基因HK Ⅱ和LDH的mRNA表达水平。CCK-8法检测干扰SULT2B1的肿瘤条件培养基(tumor conditioned medium,TCM)对小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3增殖能力的影响,并检测VEGF的mRNA表达水平。建立Hepa1-6细胞裸鼠移植瘤模型,免疫组化染色检测裸鼠瘤组织中CD34的表达水平。结果 过表达/干扰 SULT2B1可分别上调/下调HIF-1α的mRNA及蛋白表达水平,且干扰SULT2B1可使HK Ⅱ和LDH的mRNA表达水平降低,过表达发生相反的变化(P<0.05)。干扰SULT2B1的TCM可抑制bEnd.3细胞的增殖能力,并降低VEGF的mRNA表达水平(P<0.05)。同时,干扰SULT2B1可降低Hepa1-6细胞移植瘤在裸鼠体内的生长并降低瘤组织中的微血管密度(P<0.05)。结论 干扰SULT2B1可抑制Hepa1-6细胞的糖酵解及血管新生能力,其作用主要与下调HIF-1α、HK Ⅱ、LDH及VEGF的表达水平有关。     

乙酰肝素酶基因siRNA表达载体的构建及其沉寂作用

目的:构建针对人乙酰肝素酶(HPSE)基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对HPSE基因的干扰作用。方法:设计HPSE靶向的发夹状siRNA,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pRNATU6.1载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染人恶性黑素瘤细胞A375,采用半定量PCR测定HPSE基因RNA水平变化,Western blot检测HPSE蛋白表达的变化。结果:将针对HPSE基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pRNATU6.1载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染A375细胞后,半定量PCR和Western blot检测显示,HPSE基因和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。结论:成功构建了针对HPSE基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制HPSE的表达。     

分泌mMIP-1α趋化因子的小鼠肝癌细胞株的建立及其体内致瘤性

目的：建立分泌mMIP-1α的小鼠肝癌细胞株,并观察其体内致瘤性。方法：mMIP-1αcDNA被克隆入pBabe puro逆转录病毒载体,构建的重组逆转录病毒载体pBabe-puro-mMIP-1α转染包装细胞,嘌呤酶素抗性细胞培养上清感染小鼠肝癌细胞系Hepa1－6,RT－PCR和免疫组化分别检测Hepa1-6,Hepa1-6-mMIP-1α的mMIP-1αmRNA和mMIP-1α蛋白折表达。绘制Hepa1-6-mMIP-1α与Hepal1-6手长曲线观察细胞的生长,琼脂糖凝胶打孔法体外观察Hepa1-6-mMIP-1α分泌蛋白对小鼠脾细胞的趋化作用。观察Hepa1-6-mMIP-1α体内瘤性。结果：构建了重组逆转录病毒载体pBabe puro-mMIP-1α,Hepa1-6不表达mMIP-1αmRNA及蛋白,Hepa1-6-mMIP-1α表达mMIP-1αmRNA和蛋白。Hepa1-6-mMIP-1α与Hepa1-6的生长曲线基本一样,Hepa1-6-mMIP-1α分泌了对小鼠脾细胞有趋化作用的分子。Hepa1-6-mMIP-1α体内致瘤性降低。结论：Hepa1-6-mMIP-1α能产生mMIP-1α,mMIP-1α分泌了对小鼠脾细胞有趋化作用的分子。Hepa1-6-mMIP-1α体内致瘤性降低。结论：Hepa1-6-mMIP-1α能产生mMIP-1α,mMIP-1α不改变细胞体外生长状况,嫌生的mMIP-1α有趋化活性,mMIP-1α能使Hepa1-6-mMIP-1α致瘤性降低。     

RNA干扰沉默中期因子基因表达诱导肝癌细胞凋亡

目的:探讨RNA干扰(RNA interference)沉默中期因子(midkine,MK)基因表达对肝癌细胞增殖和凋亡的影响.方法:根据中期因子基因mRNA序列特点,设计合成中期因子基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染肝癌SMMC 7721细胞后,分别以实时定量PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞中期因子表达情况,分别通过检测caspase-3活性和琼脂糖凝胶电泳方法了解肝癌细胞凋亡,以软琼脂集落培养试验检测对各组细胞增殖的影响.结果:中期因子siRNA可有效抑制肝癌细胞中期因子 mRNA和蛋白水平.转染组肝癌细胞caspase-3活性增高,呈浓度和时间依赖性;转染组出现明显的DNA条带.中期因子转染组细胞增殖受到明显抑制,且呈浓度依赖性.结论:采用RNA干扰沉默肝癌细胞中期因子基因表达,可抑制癌细胞增殖和诱导凋亡.     

甲胎蛋白基因转录调控元件驱动白细胞介素-2基因在肝癌细胞中的特异性表达

目的利用小鼠甲胎蛋白(AFP)基因转录调控元件驱动白细胞介素-2(IL-2)基因在肝癌细胞中特异性表达.方法构建逆转录病毒载体pDOR-mAFP-IL-2,采用经包装后的病毒分别感染AFP阳性的小鼠肝癌细胞Hepa1-6和AFP阴性的小鼠ψ2细胞,检测IL-2表达.结果该载体能使IL-2基因在Hepa1-6细胞中特异性表达而不能在ψ2细胞中表达.结论采用具有肝癌特异性活性的AFP基因转录调控元件可以驱动IL-2基因在肝癌细胞中特异性表达,为进一步开展直接体内靶向性肝癌基因治疗实验研究提供了依据.     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

尿微量白蛋白检测在继发性肾脏疾病中的临床意义

目的探讨尿微量白蛋白（m-Alb）检测在继发性肾脏疾病中的临床意义。方法采用Beckman Immage全自动特种蛋白分析仪对糖尿病组、高血压组、心脏病组患者进行了m-Alb测定,同时与健康组结果作对比。结果m-Alb检测糖尿病组为3.7±5.26mg/dl,高血压组为7.5±8.18mg/dl,心脏病组为7.8±3.76mg/dl,健康组为0.66±0.48mg/dl,各试验组m-Alb增高百分率为糖尿病组48.9%,高血压组37.5%,心脏病组26.9%。结论尿蛋白阴性的糖尿病、高血压、心脏病患者进行m-Alb检测,可以监测病程的进展。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …