重组人骨形态发生蛋白4基因腺相关病毒载体对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的应用重组人骨形态发生蛋白4基因腺相关病毒载体(AAV-hBMP4)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),观察其对BMSCs生物学行为的影响,从而为骨组织工程寻找理想的病毒载体及种子细胞。方法全骨髓法培养兔BMSCs,按感染复数(MOI)值不同设定为四组,分别转染兔BMSCs,观察病毒量对细胞形态的影响。选取影响最小的MOI值,进行后续实验。转染兔BMSCs,MTT法描记细胞生长曲线,观察AAV对细胞增殖活性的影响。以重组增强型绿色荧光蛋白基因的腺相关病毒载体(AAV-EGFP)为参照,行流式细胞仪检测,计算转染效率。AAV-hBMP4与对照病毒AAV-EGFP分别转染细胞,观察细胞形态,行碱性磷酸酶(ALP)染色、Von Kossa染色及ALP含量测定,观察成骨活性。兔肌袋实验观察异位成骨情况。结果MOI值为5×10~4 vg/cell时,AAV对细胞形态影响最小,以此值进行后续实验。AAV转染后,细胞增殖活性良好,转染效率为55％～65％。AAV-hBMP4转染后,细胞形态呈现典型的成骨改变,ALP染色及Von Kossa染色均出现成骨的特征性改变,而AAV-EGFP组无上述改变。细胞上清ALP含量测定显示,实验组ALP含量显著增高,与对照组比较差异有统计学意义(t=218．65,P＜0．01)。兔肌袋实验术后4周组织学检测可见大量钙盐沉积,矿化结节形成。结论AAV-hBMP4转染效率高,对BMSCs的增殖活性影响小,AAV-hBMP4转染的BMSCs可望成为组织工程化骨的理想种子细胞。     

重组人骨形态发生蛋白7的腺相关病毒载体的构建

目的构建重组人骨形态发生蛋白7(hBMP7)的腺相关病毒(AAV)载体。方法通过RT-PCR方法,从HEK293细胞中扩增hBMP7全长cDNA并亚克隆入通用型AAV载体质粒pSNAV。将pSNAV-hBMP7质粒DNA转染BHK-21细胞,筛选出携带hBMP7的AAV载体细胞株—BHK-21细胞。用能表达Rap和Cap的重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/ΔUL2按MOI=0·1感染BHK-21载体细胞株后收获病毒液,通过氯仿—PEG/NaCl沉淀—氯仿抽提纯化病毒。结果所克隆的hBMP7全长cDNA经测序证实和已知hBMP7序列完全一致。通过用能表达Rap和Cap的重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/ΔUL2感染携带hBMP7基因的AAV载体细胞株BHK-21细胞的方法获得了滴度为2×1012vg/ml、纯度达99%的重组人骨形态发生蛋白7的腺相关病毒载体(AAV-hBMP7)。结论RT-PCR方法从HEK293细胞中扩增克隆hBMP全长cDNA是一种有效可行的方法。成功地构建了高滴度、高纯度的AAV-hBMP7载体,为进一步体内及体外研究基因治疗促进骨愈合提供了有力的工具。     

转染重组人骨形态发生蛋白-7基因对骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的 观察重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)基因转染骨髓基质细胞(BMSCs)后的稳定表达及表达产物对BMSCs生物学行为的影响。方法利用脂质体介导法将rhBMP．7基因转染BMSCs，以G418筛选出阳性克隆并扩大培养，用免疫组织化学链霉抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法检测转基因细胞的稳定表达；转染48h后，用转基因细胞的培养液上清刺激正常培养的BMSCs，利用^3H标记的胞腺嘧啶氧核苷(^3H-TdR)掺入法、Na2^35SO4掺入法以及氯胺T法检测基因表达产物对BMSCs增殖、合成蛋白多糖以及胶原的影响。结果 转基因细胞4周时仍能表达外源性基因；基因表达产物能明显促进BMSCs的增殖以及蛋白多糖和胶原的合成。结论 rhBMP-7基因转染BMSCs后可获得稳定表达，且基因表达产物能促进BMSCs增殖。诱导其向软骨细胞分化并增强其生物学活性。     

腺病毒骨形态发生蛋白2绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓基质干细胞成骨及示踪作用

目的 观察腺病毒介导的人骨形态发生蛋白绿色荧光蛋白基因(Ad-GFP-hBMP-2)转染对骨髓间质干细胞(bMSCs)成骨能力的影响.方法 取日本大耳白兔4只自双侧股骨远端抽取骨髓培养bMSCs.以Ad-GFP-hBMP-2基因(实验组)及Ad-GFP(对照组)基因转染bMSCs后,用ALP检测试剂盒检测两组细胞的ALP活性;原位杂交检测两组细胞I型胶原的表达;Western blot 检测细胞中BMP-2的表达.将转染后24 h的bMSCs接种到裸鼠体内,术后第4、8、12周观察成骨情况.结果 转Ad-GFP-hBMP-2基因组和Ad-GFP组各时间段ALP分泌量差异分别有统计学意义(P<0.01);实验组I型胶原原位杂交实验组为阳性.实验组成骨阳性率为90%,对照组为40%.结论 bMSCs经Ad-GFP-hBMP-2基因转染后能高效表达BMP-2并诱导成骨.腺病毒介导人BMP-2转基因可以提高bMSCs的成骨能力.     

人骨形态发生蛋白-2基因转染兔骨髓基质干细胞及其表达

目的探讨含有人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)cDNA的真核表达载体在兔骨髓基质干细胞(MSCs)中的转录及表达情况,为进一步进行多基因转染MSCs复合纳米仿生骨治疗骨缺损实验提供材料。方法用电穿孔方法将真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2转染至兔MSCs中,荧光显微镜及流式细胞学检查观察转染效果、检测转染效率,定量RT-PCR方法观察hBMP-2cDNA在兔MSCs中的转录情况,免疫组织化学及westernblot方法检测hBMP-2蛋白表达情况,ALP活性定量测定检测hBMP-2蛋白功能。结果电穿孔方法将重组质粒转染至兔MSCs中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪检测转染效率为(42.7±2.1)%,转染24h后定量RT-PCR方法检测到hBMP-2cDNA在兔MSCs中的转录片断,免疫组织化学观察到hBMP-2蛋白呈强阳性表达,westernblot方法可见18KDhBMP-2蛋白条带,转染组细胞ALP活性明显提高(P>0.05)。结论pIRES2-EGFP-hBMP2通过电穿孔方法导入兔MSCs,并在其中有效表达,发挥生物学作用。     

腺相关病毒介导人骨形态发生蛋白7基因体外转染脂肪源性干细胞的研究

目的构建人骨形态发生蛋白7(hBMP7)基因重组腺相关病毒载体并观察其在脂肪源性干细胞(ADAS cells)中的表达,为骨组织工程探索新的基因治疗方法和细胞来源。方法以pcDNA1．1／Amp-hBMP7质粒为模板扩增,将回收的PCR产物片段克隆入pUC18载体,获得重组质粒pUC18-hBMP7。双酶切质粒pUC18-hBMP7、pSNAV,回收的两片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV-hBMP7。用重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc／△UL2感染BHK-21细胞,裂解细胞收获病毒液。采用“氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提”三个步骤分离浓缩和纯化,测定病毒滴度。培养大鼠ADAS cells,并检测细胞表面标记物。在体外分别转染rAAV2-hBMP7和rAAV2-GFP,流式细胞仪、Western-blot方法检测转染基因的表达。结果PCR、酶切鉴定以及测序分析表明,BMP7基因成功克隆入质粒pSNAV-hBMP7载体中,并在BHK21细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7。早期对ADAS cells的转染效率可达90％, Western-Blot方法检测到第1周与第8周的转染组细胞均有蛋白水平的表达。结论成功构建了hBMP7基因重组腺相关病毒载体和培养出大鼠ADAS cells,rAAV2-hBMP7载体在体外可高效转染大鼠ADAS cells。     

透明质酸复合人骨形态发生蛋白-2转染兔骨髓基质干细胞的体内外成骨研究

目的观察透明质酸(HA)复合腺病毒介导的人骨形态发生蛋白(AdvhBMP)2基因转染的兔骨髓基质干细胞(BMSCs)的体内外诱导成骨活性。方法(1)体外成骨活性研究方法分成4组,AdvhBMP2转染细胞 HA组、AdvhBMP2转染细胞组、未转染细胞 HA组和未转染细胞组,采用免疫沉淀法(IP)、Western印迹法检测hBMP2表达、逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法检测骨涎蛋白mRNA表达、ALP和vonKossa染色及ALP定量检测;(2)裸鼠肌内诱导成骨实验裸鼠12只(共24侧)分4组注射AdvhBMP2转染细胞 HA组(n=8)、注射AdvhBMP2转染细胞组(n=8)、注射未转染细胞组(n=4)和单纯注射HA组(n=4),观察方法采用X线、成骨计量对照、组织学观察法。结果(1)AdvhBMP2转染细胞 HA组和AdvhBMP2转染细胞组BMSCs表达hBMP2和骨涎蛋白mRNA,两组的ALP活性均高于未转染细胞 HA组和未转染细胞组(P<0.01),并有明显的钙结节形成;(2)AdvhBMP2转染细胞 HA组和AdvhBMP2转染细胞组均有成骨,两组差异有显著性(P<0.01),未转染细胞和单纯注射HA组均未见成骨,局部以纤维和脂肪组织为主。结论HA复合AdvhBMP2基因转染的BMSCs在体外有较好的诱导成骨活性,在裸鼠肌内有良好的诱导成骨和成软骨的作用,是可注射性的骨缺损修复方法。     

人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及分化的影响

目的：研究人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染人骨髓基质干细胞(hBMSC)对其增殖及分化的影响。方法：利用免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞。BMP-2的表达。流式细胞仪和ALP活性测定分析BMP-2基因转染对细胞增殖、分化的影响。结果：转染后，hBMP-2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达，S期细胞比例和ALP活性明显增高。结论：Ad-BMP-2可高效转染hBMSC，且促进细胞增殖和成骨转化。     

重组BMP4/7融合基因腺相关病毒的构建及其对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响

[目的] 应用重组骨形成蛋白4/7融合基因腺相关病毒载体(AAV BMP4/7)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),观察其对BMSCs生物学行为的影响.[方法] (1)采用RT-PCR一步法和基因重组法,从胎盘组织中克隆BMP4和BMP7成熟肽cDNA,获取BMP4/7融合基因,克隆到质粒pGEM质粒中;(2)从pGEM-BMP4/7质粒中切取BMP4/7融合基因克隆到穿梭质粒,在大肠杆菌内重组,在293细胞中构建AAV-BMP4/7重组腺相关病毒载体;(3)不同MOI值的AAV-BMP4/7转染兔BMSCs,观察细胞形态学变化,MTT法描记细胞生物曲线,观察对细胞增殖的影响,以AAV-EDFP做对照;(4)AAV-BMP4/7转染兔BMSCs细胞7、14 d后,行ALP及OC含量测定,观察成骨活性,以AAV-EDFP做对照.[结果] (1)成功构建高滴度的携带BMP4/7融合基因的重组腺相关病毒AAV-BMP4/7;(2)AAV-BMP4/7转染BMSCs细胞后,细胞增殖活性良好,转染效率为72%,细胞形态呈典型的成骨改变,1×105 vg/cell的MOI值对细胞形态影响较小,而转染效率强于5×104vg/cell(59.38%).(3)AAV-BMP4/7转染细胞后,ALP、OC含量均明显增高,并与转染后诱导培养的时间呈正相关,与对照组比较差异统计学意义(tALP=896.88 P<0.001 tOC=543.24 P<0.01).[结论] AAV-BMP4/7融合基因转染效率高,对BMSCs细胞有明显的诱导成骨活性,对骨愈合的基因治疗提供了新的思路和途径.     

人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及分化的影响

目的:研究人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染人骨髓基质干细胞(hBMSC)对其增殖及分化的影响.方法:利用免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达.流式细胞仪和ALP活性测定分析BMP-2基因转染对细胞增殖、分化的影响.结果:转染后,hBMP-2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达.蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达,S期细胞比例和ALP活性明显增高.结论:Ad-BMP-2可高效转染hBMSC,且促进细胞增殖和成骨转化.     

基因修饰细胞和成骨蛋白在脊柱融合中作用比浇

目的 观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导大鼠脊柱融合的能力,并与已广泛商品化使用的BMP-2蛋白比较.方法 分别将携带BMP-2和β-半乳糖苷酶的腺病毒转染BMSCs,在大鼠脊柱融合模型中建立5个实验组,每组8只,分别植入:Ⅰ组,5×106个BMP-2转染细胞;Ⅱ组,5×106个β-半乳糖苷酶转染细胞;Ⅲ组,10μgBMP-2蛋白;Ⅳ组,5×106个未转染细胞;Ⅴ组,单独的胶原海绵.8周后处死大鼠,进行各项观察.结果 手触力学评价显示Ⅰ、Ⅲ组全部达到骨性融合,而其他组均未融合.X线评分Ⅰ组(5.02)和Ⅲ组(4.21)也明显高于其他组.Micro-CT和组织学切片显示Ⅲ组的新骨骨量较少,骨小梁较细.结论 基因修饰的骨髓间充质干细胞能够很好地诱导脊柱融合,诱导效果要好于商品化的BMP-2蛋白.     

转染BMP-2基因的兔BMSCs种植PLA/PCL支架体外构建组织工程骨

目的:用腺病毒载体将人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因导入兔骨髓基质干细胞(BMSCs),种植PLA/PCL(聚乳酸/聚己内酯)支架体外构建组织工程骨.方法:蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达,流式细胞仪和ALP活性检测分析基因转染对细胞增殖分化的影响.然后将转染后细胞接种到PLA/PCL支架上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况.结果:转染后,BMSCs表达BMP-2,S期细胞比例和ALP活性明显增高.扫描电镜见转染细胞分布均匀,伸展良好.结论:BMP-2基因转染BMSCs,可促进细胞增殖分化.转染后细胞在PLA/PCL支架上生长良好,BMP-2基因治疗的组织工程骨构建成功.     

转染人骨形成蛋白-7基因的骨髓基质细胞异位成骨实验研究

目的 观察转染人骨形成蛋白-7（Bone morphogenetic protein-7,BMP-7）基因的骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）与胶原膜（BME-10X）复合培养后的异位成骨能力。方法将hBMP-7基因转染Beagle犬BMSC,与胶原膜复合培养后,植入裸鼠皮下,8周后取材,HE、Mallory染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色,观察其异位成骨能力。结果各组均有不同程度Ⅰ型胶原的表达,转染组和未转染组显著高于单纯膜组,转染组又显著高于未转染组（P〈0．05）。结论转染了hBMP-7基因的BMSCs具有更强的异位成骨能力,有望成为牙周组织工程理想的种子细胞,     

骨髓间充质干细胞在丝素蛋白/骨形态发生蛋白中的生物学行为观察

目的 观察丝素蛋白与牛骨形态发生蛋白的载体系统与骨髓间充质干细胞的体外相容性.方法 将多孔丝素蛋白修剪成20×10×5 mm长方体状物,置入6孔板中;将粉状bBMP用PBS液溶解制成2mg/ml混悬液,0.5ml无菌移液管滴定于多孔丝素蛋白上(0.5毫升/个).骨髓间充质干细胞以107/ml接种到载体系统上,复合4小时后加入生长液继续体外培养,每1、4、8天时进行碱性磷酸酶、矿化结节染色观察以及扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察;另外同时设立单纯丝素蛋白与细胞复合培养对照组进行观察.结果 倒置显微镜、扫描电镜和共聚焦显微镜下观察到细胞在两种材料上生长形态、活性正常,体外培养24小时时细胞已贴附材料上,呈匍匐状伸展,以后逐渐融合生长,8天时大量细胞成片状攀附在材料表面,并分泌有大量的网状细胞外基质,实验组可见结节状基质生成;碱性磷酸酶、矿化结节染色观察发现实验组细胞碱性磷酸酶和矿化结节染色阳性反应,对照组阴性.结论 丝素蛋白是一种良好细胞外基质材料,也是一种良好生长因子的缓释载体.     

转染人骨形态发生蛋白在兔骨髓间充质干细胞中的表达

目的采用基因转移技术将人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)基因转染兔骨髓间充质干细胞(BMSc),检测外源基因的表达.方法常规分子生物学技术构建hBMP-7逆转录病毒载体,制备含目的基因的重组逆转录病毒液,感染兔骨髓间充质干细胞,使用原位杂交以及免疫组织化学的方法检测hBMP-7在BMSc中的表达.结果原位杂交和免疫组化检测经hBMP-7基因转染的BMSc中出现阳性结果,未转染的BMSc中未见阳性结果出现.结论采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至BMSc中,并有外源性基因的表达.     

重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨

目的：构建人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein,，hBMP-2)真核表达载体PcDNA3．1-hBMP-2，转染兔骨髓基质干细胞(bane marrow stromal cells，BMSCs)，种植去抗原牛松质骨(bovine cancellous bone，BCB)支架体外构建组织工程骨。方法：蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达，碱性磷酸酶(ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上，扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果：转染后，BMSCs表达BMP-2，ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀，伸展良好。结论：在脂质体介导下，BMP-2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化，转染后细胞在支架材料上贴附生长良好，为进一步应用携带BMP-2基因的人工骨修复骨缺损奠定了实验基础。     

基因强化组织工程骨联合显微外科方法修复长段骨缺损的实验研究

目的评价骨形态发生蛋白2（BMP-2）基因强化的组织工程骨联合显微外科方法修复长段骨缺损的效果。方法分离培养兔骨髓基质干细胞，经BMP-2基因转染后复合异种骨支架体外构建基因强化的组织工程骨（GEB）。建立兔双侧桡骨缺损（2．5cm长）模型，采用5种方法修复。A：GEB加带血管蒂骨膜移植；B：GEB加血管束植入；C：GEB加游离骨膜移植；D：GEB；E：单纯支架。术后4、8、12周行X线、组织学、生物力学测定和微血管墨汁灌注等观察血管形成及成骨情况。结果A组血运建立最快，B组血管束早期即发出分支向移植骨内长入，C组4周时游离骨膜成活并发出微小血管，D组在BMP-2基因诱导下成骨速度和质量优于E组，12周时骨缺损部分修复，但中央区成骨不良，而E组12周时形成骨不连，缺损区内被纤维组织填充。在细胞成活率、生物力学性能、VEGF表达水平等方面，均表现为A〉B〉C〉D〉E，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论BMP-2基因强化的组织工程骨联合显微外科方法修复长段骨缺损，既提供了血运，又提供了有效的成骨诱导因子，是治疗长段骨缺损较为理想的方法。其中，带血管蒂骨膜联合移植修复效果最佳；血管束植入法血供重建较快，方便临床应用。     

人工骨腰椎后外侧融合过程中BMP基因的表达

目的研究利用人工骨做脊柱后外侧融合时局部BMP的表达情况,探讨人工骨在此过程中是否具备骨诱导作用。方法选用36只健康成年雄性新西兰白兔,制作L4、L5双侧横突间植骨融合模型,一侧采用磷酸钙人工骨(CPC),另一侧采用自体骨作为对照。按术后动物不同处死时间(0、2、4d、1、2、3、4、5、6、10周、6、10个月)随机平分为12组。采用RTPCR法检测融合组织BMP2mRNA、BMP4mRNA的表达水平。结果CPC材料内部在融合的各个时间段均未检测到BMP2mRNA和BMP4mRNA的表达。与紧密结合的植骨床及融合交界面中BMP2mRNA和BMP4mRNA的表达水平随时间变化均没有明显的增高,与自体骨相比,CPC融合过程中不同时间段内BMP2mRNA、BMP4mRNA的表达水平均明显低于自体骨(P<0.05)。结论单纯利用CPC做脊柱融合时,局部缺乏BMP的有效表达,可能导致融合失败率的增加。