人p16基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建含有人p16基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定.方法用基因工程技术将人p16基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组,然后通过脂质体将正确重组体包裹并转染293T细胞,并在其中包装扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定, 利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果酶切鉴定及PCR结果证明p16基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达6.1×1010pfu/ml,对人成纤维细胞有较强感染能力.结论应用细菌内同源重组方法成功构建了含人p16基因的重组腺病毒载体.     

人IL-24基因重组腺病毒的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建含有人IL-24基因的重组腺病毒载体,并转染肺腺癌细胞A549细胞观察其感染能力,为进一步的基因治疗奠定实验基础.方法采用基因工程技术将人IL-24基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用PAdEasy系统进行细菌内同源重组,后通过脂质体将正确重组体包裹并转染293T细胞以包装并扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定, 利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检定;最后采用免疫组化法对IL-24在A549中的表达进行检测.结果酶切和PCR结果证实IL-24基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.2×1010 pfu/ml,能够成功转染A549细胞并在其中进行表达.结论成功构建了有较强感染能力的含人IL-24基因的重组腺病毒载体.     

小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞的感染情况.方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将Osf2/Cbfa1基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,将重组腺病毒对成纤维细胞株NIH3T3进行感染.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测.结果酶切鉴定及PCR结果证明Osf2/Cbfa1基因重组腺病毒载体成功,病毒滴度达(1.6×1012) pfu/ml,并对NIH3T3细胞有很强感染能力.结论应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体.     

人ICOS胞外区腺病毒载体的构建与鉴定

目的利用细菌内同源重组法构建含ICOS胞外区基因的重组腺病毒。方法用基因工程的方法将ICOS胞外区的cDNA片段插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdtrack-cmv-ICOS,将之PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,同源重组质粒PacⅠ酶切鉴定后用脂质体转染293细胞,包装成重组体腺病毒颗粒Ad-ICOS。采用PCR方法对重组腺病毒颗粒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。通过Western Blot检测重组腺病毒感染后的293细胞上清中的ICOS胞外区蛋白。结果获得了重组人ICOS胞外区腺病毒载体颗粒。PCR检测表明重组腺病毒颗粒含有目的基因,滴度为2.1×1010pfu/ml。Western Blot检测到阳性目的条带。结论细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法。所制备的重组体腺病毒Ad-ICOS在体外能有效表达相应的基因产物,为今后对ICOS胞外区的深入研究奠定了基础。     

携带内皮抑素基因的重组腺病毒的构建

目的 利用AdEasy-1系统,构建并鉴定人内皮抑素重组腺病毒,为后续的实验奠定基础.方法 以PshuttleEndostatin质粒为模版PCR扩增内皮抑素基因片断,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,在AAV293细胞中包装并扩增.结果 重组腺病毒经测序、酶切鉴定正确,病毒滴度为2.06×1010 pfu/ml.结论 人内皮抑素重组腺病毒pAd-Endo构建成功.     

携带凋亡抑制蛋白Livinα基因的重组腺病毒载体的构建

目的构建携带凋亡抑制蛋白Livinα和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒pAd-Livinα。方法 PCR扩增Livinα基因片段,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,在人胚肾293细胞中包装扩增得到携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒pAd-GFP-Livinα。采用PCR对重组腺病毒进行鉴定。结果经酶切及PCR鉴定证实携带Livinα的重组腺病毒载体构建成功,并可在人胚肾293细胞中表达,病毒滴度2.15×1010 pfu/mL。结论成功构建了携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒载体系统,为进一步研究Livinα的生物学特性奠定了基础。     

小鼠Osf2／Cbfal基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞的感染情况。方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将Osf2/Cbfa1基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,将重组腺病毒对成纤维细胞株NIH3T3进行感染。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果酶切鉴定及PCR结果证明Osf2/Cbfa1基因重组腺病毒载体成功,病毒滴度达(1.6×1012)pfu/ml,并对NIH3T3细胞有很强感染能力。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体。     

编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体.为进一步研究其蛋白功能提供工具.方法:穿梭质粒pAdTrack-CMV-PGC1α线性化后与骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183菌中完成同源重组,筛选并提取重组正确的腺病毒质粒,PacI线性化,脂质体转染293细胞包装出成熟的具有感染活力的腺病毒颗粒,TCID50法测定病毒滴度,Western bloting检测PGC1α蛋白在293细胞的表达.结果:测序及酶切鉴定表明目的基因正确插人穿梭质粒,读码框未发生移位.重组腺病毒扩增后滴度约3×1010TCID50/ml,能在293细胞中表达PGC1α蛋白.结论:利用细菌内同源重组的方法成功构建了编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体,并观察到其蛋白表达.     

人BMP-7基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建含有人骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对肾小管上皮细胞株(HKC)细胞的转染情况.方法 用基因工程技术将人BMP-7基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-BMP-7转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒Ad5-BMP-7,并在其中包装扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HKC细胞感染效率的检测.结果 酶切鉴定及PCR结果证明BMP-7基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.25 × 1010PFU/ml,对HKC有较强感染能力.结论 应用细胞内同源重组方法成功构建了含人BMP-7基因的重组腺病毒载体.     

人HCN4基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的: 构建超极化激活环核苷酸门控通道基因(HCN4)重组腺病毒载体. 方法: 采用基因工程技术,将HCN4 cDNA定向克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中,利用pAdeasy-1系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,CsC1密度梯度超速离心纯化. 采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测. 结果: 测序结果证明成功构建了HCN4基因重组腺病毒载体,病毒滴度达2.0×1015pfu/L. 结论: 应用细菌内同源重组法成功构建了含人HCN4基因的重组腺病毒载体.     

腺病毒介导Cubilin反义RNA对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的抑制作用

目的构建细菌内同源重组型的Cubilin反义RNA腺病毒表达载体并研究其对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的影响.方法 PCR 扩增大鼠Cubilin起始编码区767 bp 的DNA 片段,与T载体连接,测序鉴定连接方向,通过选择反向和同向的双酶切位点与腺病毒穿梭载体pAdtack-CMV 同时酶切和连接,构建反向插入(正向插入作为对照)的腺病毒穿梭载体.将PmeⅠ线性化的腺病毒穿梭载体pAdtack-ACUB和pAdtack-CUB转染包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1 的受体菌BJ5183(AdEasyTMXL) 进行同源重组.用含有卡那霉素的LB 平板筛选同源重组阳性的克隆, PacⅠ酶切和测序鉴定后,转染包装细胞(293细胞),经病毒扩增和纯化后,再以OD 法和GFP 法计算重组腺病毒的滴度.经免疫印迹法分析Cubilin反义RNA 对Cubilin 蛋白质诱导表达的抑制作用.结果成功构建了Cubilin的反义RNA腺病毒表达载体(pAdEasy-ACUB)和对照正义RNA腺病毒表达载体(pAdEasy-CUB),滴度为2.0 ×1010pfu/ ml、1.8×1010pfu/ ml;Cubilin反义RNA腺病毒表达载体转染可明显抑制大鼠肾小管上皮细胞的Cubilin 蛋白的诱导表达.结论 Cubilin的反义RNA腺病毒表达载体的成功构建以及对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的明显抑制作用,为在基因水平的研究和治疗蛋白尿引起的肾间质损伤奠定了良好的基础.     

血红素氧化酶1基因重组腺病毒的构建

目的利用细茵内同源重组法构建含血红素氧化酶1基因的重组腺病毒.方法用限制性内切酶XhoⅠ HindⅢ从克隆载体PRH01中切出血红素氧化酶1基因片段,亚克隆至经Sal Ⅰ HindⅢ酶切的克隆质粒Puc18中,形成转移质粒Puc18-PRHO1,将之用KpnⅠ HindⅢ双酶切,再次亚克隆至经同样酶切的质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrackPuc18-PRHO1,将之PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒,PacⅠ酶切后用脂质体转染293细胞,包装成重组体腺病毒Ad-H01.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测.结果利用CaCl2法由pAdTrack-Puc18-PRHO1和pAdEasy-1共转化BJ5183感受态菌,可获得阳性重组体细菌克隆.PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因,滴度为1.4×1010pfu/ml.结论细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法.所制备的重组体腺病毒Ad-H01在体外能有效表达相应的基因产物,为今后对血红素氧化酶1的深入研究奠定了基础.     

hTERT核心启动子驱动的条件复制型腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定一种新型人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的条件复制型腺病毒载体。方法采用PCR的方法克隆腺病毒E1区基因(E1A,E1B55K)、E1B的启动子(E1Bp)以及人端粒酶逆转录酶亚基启动子(hTERTp),以及2个目的基因:人GM-CSF和GFP(GreenFluorescenceProtein,GFP)。采用一系列分子生物学方法构建pShuttle-GFPSV55K穿梭质粒,应用此穿梭质粒与AdEasy-1腺病毒DNA在BJ5183细菌内重组得到重组腺病毒质粒,将其转染293细胞获得Ad-GFPSV55K重组腺病毒。PCR法鉴定重组腺病毒,噬斑形成实验测病毒滴度。结果经过酶切鉴定成功地构建了分别携带GM-CSF基因和GFP报告基因的腺病毒载体,病毒滴度为7×1010pfu/ml。结论成功获得由hTERT启动子驱动的条件复制型腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗打下良好的基础。     

人突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定

目的: 构建人突变型低氧诱导因子1(HIF-1)α腺病毒表达载体,研究人突变型HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用. 方法: 采用分子克隆技术,由pcDNA3.1( )-HIF1α(突变型)质粒获得突变型HIF1α cDNA,克隆到穿梭质粒pShuttle2,以PI-Sce I和I-Ceu I双酶切重组穿梭质粒,获得含有突变型HIF1α cDNA的表达盒,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-X Viral DNA连接,重组成pAdeno-HIF1α腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-HIF1α腺病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定. 结果: 经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×1012 pfu/L. 结论: 成功构建重组腺病毒Adeno-HIF1α(突变型),为冠心病的突变型HIF1α基因治疗研究奠定基础.     

复制缺陷型人TPO重组腺病毒的构建与鉴定

目的:构建并鉴定携带人TPO基因的复制缺陷型重组腺病毒.方法:将含全部编码序列的人TPOcDNA克隆于腺病毒载体穿梭质粒pCA3的CMV启动子下游,然后与含有腺病毒基因组的质粒pBHG10共转染293细胞,经同源重组产生人TPO重组腺病毒(AdCMVTPO);体外转染A549细胞并检测其表达活性.结果:扩增后获得的病毒滴度达4.5×109pfu/ml,经体外转染A549细胞检测到TPO的表达.结论:所构建的重组腺病毒能有效介导人TPO基因的转移,可望用于造血功能重建的基因治疗研究.     

血管紧张素Ⅱ2型受体基因重组腺病毒简便快速的构建方法

目的:利用细菌内同源重组法构建含血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因的重组腺病毒。方法:应用PCR技术从质粒PUHD AT2R中克隆出AT2R基因片段,定向克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV中,PmeⅠ酶切线性化后转化Adeasier1细胞,抽提经鉴定含有目的基因的重组腺病毒质粒,PacⅠ酶切后用脂质体转染293细胞,包装成重组腺病毒Ad AT2R。用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有GFP报告基因,对病毒滴度进行监测。结果:PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因AT2R,滴度为1.5×1012pfu/ml。结论:细菌内同源重组法构建腺病毒比传统的细胞内同源重组法具有成功率高、方法简便、快捷和实验周期短的优点。AT2R基因重组腺病毒的成功构建为进一步实验研究奠定了基础。     

携带神经导向因子netrin-1基因的重组腺病毒构建

目的:制备并构建神经导向因子netrin-1(NT-1)和EGFP双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续的基因转染做准备.方法:采用基因克隆技术克隆目的基因NT-1,并将目的基因克隆入含有报告基因EGFP的穿梭载体pDC316质粒;构建的质粒pDC316-netrin经酶切及测序鉴定正确后.通过脂质体lipofeetamine2000的介导与腺病毒包装质粒pBHGlox_E1.3Cre共转染至人胚肾细胞HEK293,经同源重组后得到携带鼠NT-1的重组腺病毒Ad5-netrin-CMV-EGFP.应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒.以50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度.结果:PCR鉴定证实重组腺病毒含有鼠NT-1基因,病毒滴度为5.2×109pfu/ml,EGFP活性检测腺病毒感染阳性细胞率在40%以上.结论:成功制备Ad5-netrin-CMV-EGFP腺病毒,为以后基因治疗研究打下基础.     

hBcl-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续基因转染和动物实验提供实验基础。方法通过RT-PCR从A549细胞中分别获得hBcl-2和hVEGF165基因片段,并克隆到pMD-19T载体。将目的基因hBcl-2、IRES元件和hVEGF165依次定向克隆到腺病毒穿梭载体质粒pAd-Track-CMV上。线性化重组穿梭质粒后通过电穿孔转化含有腺病毒骨架质粒pAd-easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。脂质体转染线性化的重组腺病毒载体质粒于HEK293细胞以包装制备重组腺病毒。重组腺病毒经PCR鉴定之后进一步扩增、纯化。通过荧光计数确定病毒感染滴度。结果克隆的hBcl-2和hVEGF165基因测序正确,酶切重组穿梭载体质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物,重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞3 d后观察到GFP的表达,重组腺病毒的PCR得到hBcl-2和hVEGF165基因的PCR产物,滴度测定为5×109pfu/mL。结论成功构建制备了高滴度的hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为联合基因治疗心肌梗死的研究提供实验基础。     

hNET基因重组腺病毒载体构建和体外表达

目的以复制缺陷的腺病毒为载体,用细菌内同源重组法构建含有人的去甲肾上腺素转运子(human neurotransmitter transporter,hNET)基因的腺病毒载体。方法利用限制性内切酶KpnⅠ XbaⅠ从pCMV5质粒中切下目的基因hNET,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,形成重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-hNET,PmeⅠ酶切线性化后,与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的基因的重组体质粒Ad-hNET,PacⅠ酶切后用脂质体Lipofectamine2000转染HEK293细胞,包装成重组体腺病毒。采用PCR技术和Western Blotting对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有绿色荧光蛋白报告基因检测表达,经过扩增和纯化,测定病毒滴度。结果测序结果证明hNET序列的正确,PCR、PacⅠ酶切电泳和Western Blotting证实腺病毒重组质粒Ad-hNET构建成功。扩增纯化后测定重组病毒Ad-hNET的滴度为1.2×1010pfu/mL。结论成功构建了能表达hNET基因的重组腺病毒载体,为肿瘤的靶向治疗提供前期的研究工作。     

细菌内同源重组高效制备人突变p27基因重组腺病毒

目的:利用细菌内同源重组法,构建含人突变p27(hp27mt)基因重组腺病毒. 方法:hp27mt自载体pORF9-hp27mt中切出,亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV中,形成转移质粒pShuttle-CMV-hp27mt;然后再用PmeI线性化的pShuttle-CMV-hp27mt转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的超感受态BJ5183,使其在细菌内发生同源重组. 重组质粒鉴定正确后经PacI酶切,转入Ad293细胞,包装成重组腺病毒Ad-hp27mt. 采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用紫外分光光度计进行滴度测定. 结果:用含pShuttle-CMV-hp27mt转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183后,可获得约30%的阳性重组质粒. PCR检测表明重组腺病毒含有目的基因. 滴度为7.95×1015 pfu/L. 结论:用细菌内同源重组法可快速、高效制备均一的高滴度重组腺病毒. 为研究p27mt对消化道肿瘤的治疗奠定了基础.