脐带血树突状细胞的体外诱导及其特征鉴定

目的:探讨在体外无需预先分离CD34 造血祖细胞即可有效诱导脐带血单个核细胞而获得脐带血树突状细胞的方法,并对人脐带血树突状细胞的生物学功能进行鉴定。方法:实验于2003-12/2004-10在吉林省肿瘤防治研究所完成。健康孕妇正常胎儿脐带血由吉林省妇幼保健院提供,孕妇签署知情同意书。无菌采集健康孕妇正常胎儿脐带血50mL左右,肝素抗凝。生理盐水稀释后加入甲基纤维素使终浓度为1g/L,室温沉降45min,取上层富含细胞的血浆层,1500r/min离心10min,弃上清,沉淀加两倍体积的生理盐水稀释,以1∶1体积叠加于淋巴细胞分层液上,分离出脐带血中的单个核细胞,体外培养24h后去除悬浮细胞,加入粒细胞-巨噬集落刺激因子、白细胞介素4联合刺激脐带血单个核细胞分化为脐带血树突状细胞。在光镜和透射电镜下观察培养的脐带血树突状细胞的形态学特征。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联法测量脐带血树突状细胞表面分子CD1α、人类白细胞抗原-DR的表达水平。四甲基偶氮唑蓝法测定不同细胞密度的树突状细胞刺激同种T淋巴细胞增殖的能力。结果:①不同诱导时间体外培养的脐带血树突状细胞形态学观察:倒置显微镜下,淋巴细胞经细胞因子诱导后第3d聚集成均匀散布的细胞聚体,部分细胞变形,胞体拉长;第7d可见不明显突起,细胞形态不规则,呈疏松贴壁生长或悬浮生长;14d集落样生长,具有典型的树突状细胞形态。透射电镜下可见树突状细胞呈不规则形,细胞表面粗糙,突起明显;细胞核呈肾形或马蹄形,核浆比增大;胞浆中富含线粒体,较少溶酶体。②细胞因子诱导前后脐血淋巴细胞表型的变化:诱导前脐带血淋巴细胞表面不表达CD1α,诱导后CD1α的表达上升为(22.00±4.36)%;人类白细胞抗原-DR由诱导前的(3.67±2.08)%表达上升为(61.67±7.02)%。③脐带血树突状细胞对T淋巴细胞增殖能力的影响:脐带血树突状细胞具有明显刺激同种T淋巴细胞增殖的功能,且其数量的不同对T淋巴细胞的刺激能力亦不同。脐带血树突状细胞与淋巴细胞比值为1∶10时平均刺激指数为3.95,比值为1∶100时平均刺激指数为2.16。结论:采取粒细胞-巨噬集落刺激因子、白细胞介素-4联合刺激可成功诱导出形态典型、纯度较高的脐带血树突状细胞,且体外培养后具有明显的刺激同种T淋巴细胞增殖的能力。     

肿瘤全抗原激活的树突状细胞体外肿瘤的杀伤实验

目的：树突状细胞是功能最强的抗原提呈细胞，能够向T淋巴细胞有效地提呈抗原，发挥特异性的杀伤肿瘤的作用，本实验主要观察树突状细胞的体外抗癌作用。 方法：实验于2002-03／2003-03在华北煤炭医学院完成。选取华北煤炭医学院健康志愿者30例，抽取外周血10mL，分离出外周血单个核细胞。联合应用重组人集落细胞刺激因子和重组人白细胞介素14诱导外周血单个核细胞7d后获取树突状细胞。以肺癌细胞系CALU-6肿瘤细胞全抗原负载的树突状细胞和重组人白细胞介素-2联合活化自体混合T淋巴细胞，使其增殖为树突状细胞活化的杀伤细胞；体外观察树突状细胞活化的杀伤细胞及其培养上清对肿瘤细胞的杀伤活性，并检测不同的树突状细胞对其活化的杀伤细胞杀伤活性的影响。 结果：①10mL健康人外周血单个核细胞经重组人集落细胞刺激因子和重组人白细胞介素-4联合培养7d收获的树突状细胞数量为（1．88&;#177;0．77）&;#215;10^6个。②树突状细胞活化的杀伤细胞其细胞表型CD8阳性率明显增加。③树突状细胞活化的杀伤细胞对于肿瘤细胞全抗原来源的肺癌细胞系CALU-6肿瘤细胞有明显的特异性杀伤作用。④树突状细胞浓度适中，其活化的杀伤细胞的杀伤肿瘤细胞的能力最强，树突状细胞浓度过高或过低，其活化的杀伤细胞的杀伤力均减弱。⑤树突状细胞活化的杀伤细胞上清液有一定的杀伤活性，并且随着树突状细胞浓度的降低而降低。 结论：负载抗原的树突状细胞能诱导自体的混合T淋巴细胞，产生树突状细胞活化的杀伤细胞进而诱导高效而特异性的抗肿瘤免疫作用。树突状细胞诱导的抗肿瘤免疫与其浓度有关，呈双向调节作用。     

基于手法筛选的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法

目的：通过建立简单经济的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法，比较不同成熟状态下树突状细胞生物免疫学特性的变化。 方法：实验于2004-07／2005-06在南方医院检验医学中心完成。①取C57B／L小鼠骨髓细胞作为树突状细胞的前体细胞。将培养的树突状细胞分成两组，未成熟树突状细胞组(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+白细胞介素4诱导)；成熟树突状细胞组(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+白细胞介素4+脂多糖)，每天光镜观察各组细胞生长情况。第6天收集细胞，其形态采用电镜观察。②两组树突状细胞表型分析采用流式细胞仪分析。③取BALB／c小鼠脾脏细胞，分离T细胞作为反应细胞。用两组树突状细胞作为刺激细胞。按刺激细胞与反应细胞1∶5，1∶10，1∶20，1∶40的比例混合培养，并用T细胞悬液作阴性对照，观察混合淋巴细胞反应情况。 结果：①树突状细胞培养的光镜观察：未成熟树突状细胞多为圆形，少量菌幕样突起；脂多糖刺激后，树突状细胞呈悬浮状态，表面较多细长突起。②树突状细胞电镜观察结果：扫描电镜示未成熟树突状细胞表面皱褶和较少的毛刺；成熟树突状细胞表面大量树枝状细长突起。透射电镜示未成熟树突状细胞形态较规则，突起较少，胞浆内有许多吞饮泡及多泡体；成熟树突状细胞形态不规则，胞内囊泡结构减少，细胞器较丰富，细胞核偏向一侧，表面有细长树枝状突起。③各组树突状细胞表型分析：未成熟树突状细胞表面中度表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子，低水平表达CD40，CD86和CD25；成熟树突状细胞表面高度表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子，高水平表达共刺激分子。④混合淋巴细胞反应：未成熟树突状细胞只能轻度刺激同种T细胞增殖；成熟树突状细胞能够刺激T细胞大量增殖。 结论：采用重组小鼠粒-巨集落刺激因子和白细胞介素4联合诱导骨髓前体细胞可在体外培养出大量未成熟树突状细胞，低表达共刺激分子，体外诱导同种T细胞增殖能力较弱，呈现耐受性树突状细胞特性，有望应用于移植排斥反应及或自身免疫疾病的生物治疗。     

CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞的诱导培养及鉴定

背景:新近发现CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞在参与免疫负向调控机制和临床治疗上有潜在的意义。目前对于健康人骨髓来源的调节性树突状细胞的体外诱导培养及鉴定的研究较少。目的:体外培养正常人骨髓来源的具有CD11clowCD45RBhigh表型的调节性树突状细胞,从细胞形态、免疫表型、吞噬功能及刺激T淋巴细胞增殖能力等方面对其进行鉴定。方法:分离正常人骨髓单个核细胞分别在不同的培养体系中进行体外诱导培养,实验分3组:①调节性树突状细胞组,在含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素10,转化生长因子β1的1640培养基中培养7d后,用脂多糖刺激24h。②未成熟树突状细胞组,用含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素4的1640培养基培养8d。③成熟树突状细胞组,用含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素4的1640培养基培养7d后,予脂多糖刺激24h,使其成熟。光镜和扫描电镜观察树突状细胞的形态,流式细胞仪检测其免疫表型以及吞噬能力,CCK-8法检测其刺激异基因淋巴细胞增殖能力。结果与结论:①人骨髓源单个核细胞在联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素10,转化生长因子β1培养8d后获得的细胞具有调节性树突状细胞的典型特征和免疫表型,说明该实验建立的培养调节性树突状细胞的方法是切实可行的。②CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞这种新亚群具有较强的吞噬能力,刺激T淋巴细胞增殖的能力较弱,为调节性树突状细胞诱导免疫耐受的进一步研究奠定实验基础。     

人外周血树突状细胞的分离与鉴定

目的:体外分离培养并鉴定人外周血树突状细胞,并观察其抗原呈递功能。方法:实验于2005-05/2006-11在南方医科大学南方医院肿瘤中心生物治疗实验室完成。从人类白细胞抗原A2表达阳性的健康人外周血中分离获得单个核细胞。培养5h后洗涤贴壁细胞,加入含有10%人AB血清的RPMI1640培养基,及重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素4,于培养的第1,3,6天对树突状细胞的形态、表型进行分析,并定期检测树突状细胞的纯度与得率。抽取与以上树突状细胞不同来源的其他健康人外周血。经淋巴细胞分离液分离后,获取非贴壁细胞,用含10%人AB血清的1640培养基重悬,加入白细胞介素2继续孵育6d,作为同种异体T淋巴细胞。将树突状细胞分为两组,一组按常规方法培养6d,另一组在培养至第5天时加入黑色素瘤抗原基因A3编码的多肽继续培养24h。在经紫外线处理后的96孔板中,分别加入树突状细胞悬液1×104,5×103,2×103,1×103细胞/每孔,以自身T淋巴细胞作为对照,每孔设3个复孔,分别加入1×105淋巴细胞/每孔。评价树突状细胞刺激T淋巴细胞增殖的能力。结果:①单个核细胞体外培养至第6天,可获得大量、90.81%高纯度的树突状细胞,能够较高地表达21.8?1a、99.0%HLA-DR、63.4?80、18.9?83和80.6?86。②将诱导培养6d获得的两组树突状细胞作为刺激细胞,以不同的浓度与同种异体淋巴细胞混合,均可产生增殖反应;经过黑色素瘤抗原基因A3编码的多肽处理的各种比例的树突状细胞,较相应未经黑色素瘤抗原基因A3编码的多肽处理的树突状细胞激发淋巴细胞增殖的能力明显增强,浓度相对较高的树突状细胞刺激效果最明显,能够强烈地激发同种混合淋巴细胞增殖。结论:得到了一群较高程度表达CD83、CD86和HLA-DR分子、体外可强烈激发同种异体T淋巴细胞增殖的树突状细胞群。     

当归多糖对乙肝病毒转基因小鼠树突状细胞功能状态的影响

目的:探讨当归多糖对乙肝病毒转基因小鼠树突状细胞功能状态的影响。方法:取当归多糖处理和未处理的转基因小鼠脾脏来源的单个核细胞,以重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和重组小鼠白细胞介素-4培养诱导树突状细胞,显微镜下观察其形态,流式细胞仪检测其表面共刺激分子(CD80,CD86),MTT法检测其刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,ELISA法测定培养上清液中IL-12、r-IFN水平等方法进行研究。结果:当归多糖处理组小鼠树突状细胞的表面协同刺激分子(CD86)表达水平、刺激同种异体淋巴细胞增殖能力和细胞因子产生水平均高于对照组(P<0.05)。结论:当归多糖可以促进乙肝病毒转基因小鼠树突状细胞的成熟,上调其表面协同刺激分子CD86的表达,增强了其促淋巴细胞细胞增殖和分泌IL-12、r-IFN的能力,加强其抗原递呈能力,诱导细胞免疫反应,在乙肝病毒转基因小鼠抗病毒免疫中可能发挥一定的作用。     

TNF-α促进树突状细胞分化成熟的实验研究

本研究探讨不同浓度肿瘤坏死因子α(TNF-α)对人外周血单个核细胞来源树突状细胞(MNC-derived den-dritic cells,MNCDC)分化成熟的影响。采集正常健康成人外周血30 ml,以Thomas法分离外周血单个核细胞(PBMNC),用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素-4(rhIL-4)于体外联合诱导培养8天,并于培养第5天加入不同浓度的rhTNF-α共同培养;用流式细胞术检测DC膜表面的HLA-DR、CD83和CD1a表达,用MTT法检测DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果表明,不同浓度的TNF-α能不同程度地刺激DC表达HLA-DR、CD83和CD1a,增强DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结论:TNF-α能够显著增强外周血单个核细胞来源DC的分化和成熟,不同浓度TNF-α能不同程度地刺激MNCDC功能成熟,TNF-α浓度为20ng/ml时刺激DC分化成熟的作用最强。     

健康人外周血树突状细胞体外培养及表型鉴定

目的 分离人外周血单个核细胞,经体外诱导培养获取成熟树突状细胞(DC),并对树突状细胞表型表达鉴定,为进一步研究DC功能提供基础.方法 取健康成人新鲜外周血,经密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞,2 h贴壁后加入粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-4,第6天加入肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激DC成熟,倒置显微镜观察每日细胞形态;分别于第1天、第6天、第8天用流式细胞仪对其进行表型鉴定;同种异体混合淋巴细胞反应观察对T细胞的抗原提呈能力 倒置显微镜下DC细胞形态不规则,表面有毛刺状突起,呈DC典型形态学特征;成熟DC细胞表面CD1a、CD80、CD83、人类白细胞抗原(HLA)-DR表达明显增加,混合淋巴细胞反应OD值增加.结论 用GM-CSF、IL-4和TNF-α可以诱导健康成人外周血单个核细胞,培养出成熟的DC细胞,为进一步研究DC功能提供基础.     

人外周血单核细胞体外诱导树突状细胞的形态学观察与功能研究

目的：探讨从人外周血单核细胞体外培养扩增的树突状细胞(dendritic cell,DC)形态学特征及其活性。方法：人外周血常规分离单个核细胞，粘附6h后去除悬浮细胞，以细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)进行诱导培养7d，并进行形态学特征，细胞表型和淋巴细胞刺激能力鉴定。结果：培养1周即可得到大量DC，形态学观察可见细胞形态不规则，细胞表面大量突起，为典型的DC特征，免疫组化和间接免疫荧光显示CDla阳性表达率达80％～95％，并能刺激同种淋巴细胞增殖反应。结论：人外周血单核细胞可经GM-CSF、IL-4诱导培养成DC，具有典型的树突状细胞的形态学特征及抗原呈递能力。     

基于手法筛选的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法

目的：通过建立简单经济的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法,比较不同成熟状态下树突状细胞生物免疫学特性的变化.方法：实验于2004-07/2005-06在南方医院检验医学中心完成.①取C57B/L小鼠骨髓细胞作为树突状细胞的前体细胞.将培养的树突状细胞分成两组,未成熟树突状细胞组（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子＋白细胞介素4诱导）;成熟树突状细胞组（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子＋白细胞介素4＋脂多糖）,每天光镜观察各组细胞生长情况.第6天收集细胞,其形态采用电镜观察.②两组树突状细胞表型分析采用流式细胞仪分析.③取BALB/c小鼠脾脏细胞,分离T细胞作为反应细胞.用两组树突状细胞作为刺激细胞.按刺激细胞与反应细胞1：5,1：10,1：20,1：40的比例混合培养,并用T细胞悬液作阴性对照,观察混合淋巴细胞反应情况.结果：①树突状细胞培养的光镜观察：未成熟树突状细胞多为圆形,少量菌幕样突起;脂多糖刺激后,树突状细胞呈悬浮状态,表面较多细长突起.②树突状细胞电镜观察结果：扫描电镜示未成熟树突状细胞表面皱褶和较少的毛刺;成熟树突状细胞表面大量树枝状细长突起.透射电镜示未成熟树突状细胞形态较规则,突起较少,胞浆内有许多吞饮泡及多泡体;成熟树突状细胞形态不规则,胞内囊泡结构减少,细胞器较丰富,细胞核偏向一侧,表面有细长树枝状突起.③各组树突状细胞表型分析：未成熟树突状细胞表面中度表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子,低水平表达CD40,CD86和CD25;成熟树突状细胞表面高度表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子,高水平表达共刺激分子.④混合淋巴细胞反应：未成熟树突状细胞只能轻度刺激同种T细胞增殖;成熟树突状细胞能够刺激T细胞大量增殖.结论：采用重组小鼠粒-巨集落刺激因子和白细胞介素4联合诱导骨髓前体细胞可在体外培养出大量未成熟树突状细胞,低表达共刺激分子,体外诱导同种T细胞增殖能力较弱,呈现耐受性树突状细胞特性,有望应用于移植排斥反应及或自身免疫疾病的生物治疗.